酵素媒介によるバイオフィルム形成阻害の顕微鏡的評価

まずは、バイオフィルム形成細菌の懸濁液を含むガラス底のマイクロディッシュ2枚から始めます。

治療皿には活性シグナル伝達破壊酵素が含まれ、対照皿には不活化酵素が含まれます。

皿を蓋をして、細菌がマイクロダイッシュ表面に付着できるように培養してください。

非接着細胞を洗浄し、酵素を含む新しい培地を導入して培養します。

対照皿では、細菌がシグナル分子を介してコミュニケーションを取り、細胞外高分子物質(EPS)を生成してバイオフィルムを形成します。

活性酵素はシグナル分子を分解し、その機能を妨げ、バイオフィルムの形成を減少させます。

新しい培地で補充し、酵素のバイオフィルム破壊効果を強化するためにさらに培養します。

培地を取り出し、蛍光標識されたレクチンを加え、レクチンがEPSに結合するまで培養します。

未結合のレクチンを除去するために洗いましょう。

バイオフィルム構造を保つために固定剤で培養し、その後皿をすすいでください。

酵素媒介によるバイオフィルム形成抑制を評価するために、共焦点顕微鏡画像を取得します。

A . baumannii S1バイオフィルムの共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を行うには、揺れるインキュベーターで30度のLBで5ミリリットルのA . baumannii S1培養を16時間培養します。 A. baumannii S1の培養をOD₆₀₀ 0.8に調整してください。

次に、1.2ミリグラム/ミリリットルの精製GKL酵素を含む新鮮LBを用いて培養液を希釈し、1ミリリットルを35ミリリットルのガラス底マイクロディッシュに加えます。マイクロディッシュを蓋をして10リットルのプラスチック容器に入れ、密封してから30度Cで3時間孵化します。培地を優しく取り出した後、30マイクロリットルの精製GKL酵素を含む新鮮培地1ミリリットルを加え、30度Cでさらに21時間培養します。

培地をもう一度優しく取り除き、新しい培地にさらに1ミリリットルのGKL酵素を入れ替えます。30度Cで24時間孵卵します。培養後、培地を優しく取り出し、HBSSに溶け込んだAlexa Fluor 488共役小麦胚凝集素を500マイクロリットル、5マイクログラム/ミリリットルを加えます。

マイクロディッシュを37度Cで30分間孵化し、バイオフィルムを染色します。バイオフィルムを固定するには、HBSSに溶けた3.7%ホルムアルデヒド500マイクロリットルを加え、37度で30分間培養します。マイクロダイッシュを一度洗うのにHBSS2ミリリットルを使い、その後溶液を完全に除去します。

CLSM画像検査前に、アンテナを4度の暗闇で保管してください。CLSMのイメージングおよび解析では、63X対物レンズを用いて1枚の画像に97スタックを生成し、1スタックあたり0.21ミクロンの間隔を設定します。