Name: ザイモグラフィーによる機能マトリックスメタロプロテイナーゼの検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶ ゼラチンザイモグラフィーを用いたマトリックスメタロプロテイナーゼ活性の検出法。培養上清や体液中のMMPを可視化し、バンド密度解析で定量的に評価する実験手法です。

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我々は、細胞培養上清中のMMPの濃度を増加させるタンパク質集線装置の使用を示唆するため博士S.レスラーを（分子細胞生物学教室、ベイラー医科大学）に感謝いたします。 このプロジェクトは、（AR059838）ミセスクリフォードエルダーホワイトグラハム寄附研究基金とNIH / NIAMSからCBへの補助金によって支えられている。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。

1。ジェルのロードと実行<ol><li>すべてのサンプルは、酵素の機能を維持するために十分に準備され、コレクションの直後に使用されるか、または-80℃で凍結保存する必要があります。℃にサンプルは、還元剤を含んではならない（例えば、β-メルカプトエタノール）またはゲルローディング前に一度沸騰させ。 </li><li>カセット内部にゲルを含んでいるポーチを開くと、脱イオン水でカセットをすすいでください。 <ul><li>カセットとゲルの上から櫛の底から保護テープを取り外します。 </li><li>ランニングバッファー（脱イオン水で1Xに希釈）でウェル三回すすいでください。 </li><li>ミニ細胞、カセットの小さい側が内側を向くようにすることにゲルを置きます。ゲルテンションウェッジを所定の位置にロックします。ミニセルは並列に1つまたは2つのゲルを実行することができます。 </li><li>井戸のレベル以上の1X泳動バッファーと上部（内側）室を埋めるため、任意の漏れをチェックします。漏れの場合には、バッファを削除し、ゲルを再配置する。 </li><li> 1X泳動バッファーと下室を埋める。 </li></ul></li><li>よく一つにタンパク質分子マーカーの10μLをロードする。 <ul><li>ゲルローディングチップを（各サンプルの間で変更）を用いてゲルのウェルにゲルローディング緩衝液の試料と負荷を均等に混ぜる。これらの井戸は20μL、合計​​すると、最大ロードすることができます。 </li></ul></li><li>ミニセルにふたをし、電源に電極コードを接続します。の電源を切り替え、90分間一定の125 Vで実行するように設定します。現在の発行部数を示し、下室のワイヤーに小さな気泡の形成を確認してください。 </li><li>最初のゲルを実行する際に、指標としてのローディングバッファーに含まれるブロモフェノールブルーを使用して、マイグレーション15分ごとの進行状況を監視。インジケータの色素がゲルの底に達するまでゲルの実行をしましょう​​。 </li></ol> 2。ジェルをRenaturingと開発<ol><li>それぞれのゲルの場合は、脱イオン水で両方、1X renaturingバッファとバッファを変性200mLを100mLのを準備。 </li><li>ブロモフェノールブルートラッキング色素がゲルの底部に達すると、電源を切るミニセルを開いて、ゲルを取り外します。ゲルのナイフ（または計量へら）を使用してカセットの両面を区切ります。ゲルの方向を示すためにコーナーをカット。 </li><li>慎重に100mLのrenaturingバッファを使用してコンテナにカセットと場所からゲルを取り除く。穏やかに撹拌しながら室温で30分間インキュベートする。 </li><li> renaturingバッファを削除し、ゲルにバッファーを開発して100 mLを加え。穏やかに撹拌しながら室温で30分間インキュベートする。 </li><li>開発バッファを削除し、ゲルに開発バッファー100mLの詳細を追加。 37℃（16〜18時間）一晩インキュベート℃に</li><li>開発バッファを削除し、室温で穏やかに撹拌下に脱イオン水で3回（5分ごとに）すすいでください。 </li><li>彼らはゲルの染色後に小さいか、または表示されていないとなると蛋白質の標準的なバンドの正確な位置を保存するためにゲルをスキャンします。 </li><li>ゲルにSimplyBlue Safestain 20mLを追加することでゲルを染色する。穏やかに撹拌しながら室温で1時間インキュベートする。 </li><li> SimplyBlue SafeStainと穏やかに撹拌下、室温で1時間を100mL以上の脱イオン水で脱染色ゲルを取り外します。 </li><li>より良い結果を得るために、穏やかに撹拌下、室温で別の時間以上に新鮮な脱イオン水とインキュベートして交換してください。 </li></ol> 3。データ解析<ol><li>慎重にプラスチックシートプロテクターの水と場所からゲルを取り除く。 </li><li> 300dpi以上の解像度でゲルをスキャンします。 TIFF形式（図1A）で画像を保存します。 </li><li> ImageJの（または別の同様のソフトウェア）とのバンド強度を測定します。 <ul><li> ImageJは（図1A）でTIFFファイルを開きます。 </li><li> （図1B）"画像&gt;タイプ&gt; 8ビット"を選択することにより、黒と白で視覚化する。 </li><li>少なくとも二回以上、それは（これはソフトウェアの要件です）横幅よりも長方形を描く、最初のバンドの輪郭を長方形選択ツールを使用してください。 </li><li> "1"を押すか、"解析&gt;ジェル&gt;を選択最初のレーン"とバンドが概説されます]を選択します。 </li><li>新しい長方形が表示されるので、次のバンドに移動し、"&gt;ジェル&gt;を選択、次の車線を分析する"が選択されます。すべてのバンドが選択されるまで繰り返します（図1B）。 </li><li> "3"を押すか、各バンド（図1C）のプロファイルプロットを生成するために"解析&gt;ジェル&gt;プロットレーン"を選択します。 </li><li>興味のピークが完全に密閉された場所であることができるように、基本線を描画する直線の選択を（既に自動的に選択する必要があります）を使用してください。 </li><li>杖ツールを選択して、それを選択するために、各ピークの内側をクリックします。 </li><li>選択した各ピークの面積を持つテーブルを取得するために"解析&gt;ジェル&gt;ラベルのピーク"を選択してください。これらのデータは、（Fとしてプロットすることができますigureの1D）または、選択されたバンドの値に正規化することができます。結果の統計的有意性を決定するためにいくつかの複製ゲルから値をプールする場合は、この正規化は特に重要です。 </li></ul></li></ol> 4。代表的な結果我々は、MMP - 2（図1A）の異なる量を含むさまざまな細胞培養上清を搭載した11ウェルのゲルを示す。このゲルの直接観察は、井戸のいくつかの間にMMP - 2濃度の明らかな違いを示しています。例えば、それは井戸＃4と5ははるかにMMP - 2も＃11またはさえも＃10よりが含まれていることは明らかである。バンドの客観的な定量化のために我々は、MMP - 2も＃11と井戸の間の量＃4と5との約2倍の差が約4倍の差を確認し、ImageJのソフトウェア（図1B - D）でデンシトメトリーを使用しているよく＃10と井戸＃4と5の間にMMP - 2の量。 <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1ゼラチンザイモグラフィーによるMMP - 2の検出。ゼラチンゲルの、スキャン画像。よく数字は、ゲルの上部に示されています。 B、​​デンシトメトリー用の黒と白に示すのと同じゲル。各バンドは、ImageJの中の矩形で選択されまし​​た。 C、およびB（バンド＃4、＃11）に示すようにゲルのデンシトメトリーのプロファイルの二つの例。直線は、閉じた領域を作成するために、各ピークの基部に描かれました。 D、バンド＃1の密度にAとBの前（左）と後（右）正規に示すようにゲルのピーク面積のプロット。 <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2この図は、ザイモグラフィーの半定量的なテクニックとして使用することができる方法を示しています。我々は7回連続のウェルに希釈系列を（1:1希釈の手順）にロードされ、プロMMP - 2およびMMP - 2の両方のバンドの密度を測定した。

<ol><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、細胞培養上清中のMMP - 2のzymographic分析を実行する方法を示している。 ゲルにロードするサンプル量は、経験的に関心の起源とMMPに応じて決定する必要があります。プロテアーゼは、バンドの領域に消化できるだけなので非常に基板があるので、あまりにも多くのロード中に少し検出を防ぐことがあまりにもロードすると、飽和状態につながる可能性があります。必要に応じて、サンプルをローディングバッファーや開発に時間と混合する前に脱イオン水で希釈することができますデは4時間に一晩に短縮できます。それは、コンセントレータ（例えばミリポアカタログ＃UFC803024）を用いて溶液中のタンパク質を濃縮することも可能です。バンドがほとんど見えない状態のままなら、それも、最大48時間まで、時間の長い期間のためのゲルを開発する必要があるかもしれません。組織培養上清からサンプルを調製する際に、それはウシ胎児血清（および他の血清が）結果に影響を与える可能性のMMPを含んでいることに留意すべきである。このような理由から、我々は、無血清培地での培養後に上清のすべてを収集する。 プロトコルのパラグラフ2.9および2.10で説明されている洗浄は消化バンドの染色バックグラウンドを除去する必要があります。長い洗浄時間は、ゲル全体に基板の染色をより多くの背景を削除しますが、また暗くなる。長い洗浄時間が必要な場合、我々は最高のコントラストを使用してスキャンを選択するためにゲルを数時間おきにスキャンすることをお勧めします。 この手法は、他のMMPを検出するために使用することができます。ゼラチンが好ましい基質ではないとして、例えば、MMP - 9はゼラチンゲル上で、そしてまた、より低い程度MMP - 1、MMP - 8、およびMMP - 13に検出することができます。 MMP - 1およびカゼインはMMP - 12、およびMMP - 13、MMP - 7、MMP - 3、MMP - 11のための好ましい基質であるともMMP - 1の検出を可能にする間、MMP - 13は最高のコラーゲンのザイモグラフィーで検出されています9。 MMP - 7（マトリリシン）およびコラゲナーゼ（MMP - 1およびMMP - 13）時カゼインまたはゼラチンゲル中での低レベルで存在を検出することは困難です。ゲルローディング時の試料へのヘパリンの添加はMMP - 7の検出限界を大幅に向上させます。 MMP - 1およびMMP - 13の場合は、ヘパリンは、電気泳動の実行は片道12で既に後にゲルに追加する必要があります。 ザイモグラフィーは、酵素の変性と再生の後に酵素活性を測定するので、試料中に存在するすべてのMMPの活性を測定します。これは、酵素、プロ酵素、及び内因性阻害剤（例えば、TIMP - 2）に結合した酵素が含まれています。それはわずかに高い分子量を持つ活性酵素のとプロ酵素のそのバンドの密度を、比較することにより、サンプル中のMMP活性のレベルを決定することは可能です。 ザイモグラフィーは頻繁にMMPを識別するのに十分ではありません。既知の分子量を基準とMMPの移行レベルの比較では、識別に役立つありませんが、これらの規格の一部が還元剤を含んでおり、その非還元条件下で使用したときには9種類の分子量を示すかもしれないことに注意すべきである。オプションは、テストサンプルと同じゲル上可溶性組換えMMPをロードすることです。 MMPは、しかし、見かけの分子量の変化を誘導し、他のタンパク質に関連付けられる場合があります。選択的MMP阻害剤はinterest.A第二の技術（ウェスタンブロット、免疫細胞化学、またはELISA）のMMPをすることをお勧めしますアイデンティティへの薬理学的ツールとして開発し、バッファ内のインキュベーションの間にゲル（または半分にゲルカットの部分）を追加することができます興味のMMPの同定に役立つ。これはウェスタンブロット法の検出限界は、このテクニックを使用するときに潜在的に偽陰性の結果につながる、しばしばzymographicゲルのものよりもはるかに低いことに留意すべきである。

<table><tbody><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell CE 電気泳動装置</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>電源装置 (model 302)</td><td>VWR international</td><td>93000-744</td><td></td></tr><tr><td>Novex 10% ゼラチンザイモグラムゲル, 1.0 mm, 12ウェル</td><td>Invitrogen</td><td>EC61752BOX</td><td></td></tr><tr><td>Blue Juice ゲルローディングバッファー</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディングチップ</td><td>VWR international</td><td>53509-015</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質分子量標準マーカー</td><td>Invitrogen</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine-SDS 泳動バッファー</td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td></td></tr><tr><td>Novex ザイモグラム再自然化バッファー</td><td>Invitrogen</td><td>LC2670</td><td></td></tr><tr><td>Novex ザイモグラム現像バッファー</td><td>Invitrogen</td><td>LC2671</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection 4490 フォトスキャナー</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td><td>n/a</td><td>W. Rasband, NIH/NIMH 著</td></tr></tbody></table>

ザイモグラフィーによる機能マトリックスメタロプロテイナーゼの検出

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）は亜鉛含有エンドペプチダーゼです。彼らは、ペプチド結合の切断によってタンパク質を分解。 20以上のMMPは同定されており、その構造と基質特異性（コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、膜の種類[MT - MMP]、ストロメリシン、matrilysins、など）に基づいて6つのグループに分けられます。 MMPは、細胞浸潤、軟骨の劣化、組織の再構築、創傷治癒、および胚形成において重要な役割を果たす。したがって、それらは両方とも通常のプロセスで、そのような関節リウマチ、がん、または慢性閉塞性肺疾患1から6のような多くの疾患の病因に関与。ここで、我々は、MMP - 2（ゼラチナーゼA、IV型コラゲナーゼ）、広く発現MMPに焦点を当てます。私たちは、ザイモグラフィーは、まずC. HeussenとEBドゥードル70から10が1980年に記載されて一般的に使用される、シンプルな、そして非常に敏感な技術によって、細胞の培養上清中のMMP - 2を検出する方法を説明します。この技術は半定量的である組換えMMPの既知の濃度は同じゲル11の上にロードされるとき、それは、したがって、試験サンプル中のMMPレベルを決定するために使用することができます。 とゼラチン（MMP - 2の基質）、MMPを（例えば細胞培養上清、尿、または血清）を含むソリューションは、ドデシル硫酸ナトリウム（タンパク質を線形化するためにSDS）を含むポリアクリルアミドゲル上にロードされています。サンプルのバッファは（ゲルローディングを容易にする）サンプルの粘度を高めるために設計されて、追跡用色素（ブロモフェノールブルー、サンプルの移行を監視する）を提供する、変性分子（タンパク質を線形化するために）提供し、サンプルのpHを制御する。タンパク質は、その後、一定の移行率を提供するように設計された実行中のバッファで電流下での移行が許可されています。移行の距離は反比例タンパク質の分子量（小さなタンパク質は大きなタンパク質に比べゲルを介して高速に移動するため、ゲルの下方に移行）と相関している。移行後は、ゲルは、タンパク質が酵素活性に必要なそれらの三次構造を、回復できるようにrenaturingバッファに置かれます。次いでゲルをプロテアーゼはその基質を消化できるように設計開発をバッファに置かれます。発展途上バッファはまた、アクティブなMMPをに非タンパク質分解プロMMPを活性化するためのp - aminophenylmercuric酢酸（APMA）が含まれています。次のステップは、基板を（この例ではゼラチン）染色で構成されています。ゲルから余分な色素を洗浄した後、プロテアーゼ消化の領域は明確なバンドとして表示されます。明確なバンドは、より濃縮されたプロテアーゼは、それが含まれています。バンドの染色強度は、サンプルの比較を可能にする、などのImageJなどのソフトウェアを使用して、デンシトメトリーによって測定することができる。

このプロトコルは、アクティビティベースの培養上清や体液中マトリックスメタロプロテアーゼを検出するためのアッセイを説明します。

マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）は、亜鉛含有エンドペプチダーゼである。これらはペプチド結合を切断することでタンパク質を分解する。20種類以上のMMPが…

この手順の目的は、機能的なマトリックスメタロプロテアーゼを検出することです。まず、還元剤を含まないローディングバッファーを添加してサンプルを調製します。次に、ゼラチンを含むZYグラハムゲルにサンプルをロードし、トラッキングダイがゲルの末端に到達するまで電気泳動を行います。電気泳動の後、ゲルの再自然化、展開、染色、および脱染色を行います。手順の最終ステップとして、データ解析のためにゲルをスキャンします。最終的に、バンド密度解析を通じて、サンプル中のマトリックスメタロプロテイナーゼの活性を示す結果を得ることができます。こんにちは。私はLER医科大学分子生理学・生物物理学部のKristin bitten博士の研究室から来ました。本日は、ザイモグラフィーによるマトリックスメタロプロテアーゼの検出手順をご紹介します。当研究室では、培養一次細胞から分泌されるマトリックスメタロプロテアーゼを研究するためにこの手順を用いています。それでは、学習に入りましょう。このプロトコルの開始前に、酵素の機能を維持するため、すべてのマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）を適切に準備してください。サンプルはすぐに使用するか、-80 °Cで保存してください。ここでは、ゼラチナーゼAまたは4型コラーゲナーゼとしても知られるMMP-2を用い、ザイモグラフィーによるMMP活性の可視化を実演します。MMP酵素の調製が完了したら、カセット内にゲルが入った10%ゼラチンザイモグラフィーゲルポーチを用意します。カセットを脱イオン水で洗浄してください。カセット底面の保護テープを取り除き、ゲルの上部からコームを取り出します。ウェル内を Tris-Glycine SDS 走行バッファーで3回洗浄します。カセットの短辺が内側を向くようにして、ゲルを小型セル電気泳動装置にセットします。ゲルテンションウェッジを使用して、ゲルを固定します。装置の上部チャンバーに、ウェルの液面を超えるまでtris glycine SDS泳動バッファーを満たし、漏れがないか確認します。ゲル電気泳動装置の下部チャンバーにも泳動バッファーを満たします。次に、10 µLのタンパク質分子量マーカーをロードします。還元剤を含まないゲルロードバッファーと同量をサンプルに混ぜ合わせます。通常のSDS-PAGEとは異なり、サンプルを煮沸させずに、そのままゲルのウェルにロードしてください。ゲルロード用チップを使用する場合、各ウェルには最大20 µLまでロード可能です。ミニセルに蓋をし、電極コードを電源装置に接続します。電源をオンにし、ゲルを125 Vの定電圧で90分間電気泳動させます。最初のゲルの泳動時には、下部チャンバーの電極に小さな気泡が発生しているかを確認し、電流が流れていることを確かめてください。各ゲルの泳動状況については、ローディングバッファーに含まれているブロモフェノールブルーを指標として、15分ごとに確認してください。1倍xmo gのRena緩衝液100 mLと、xmo gの発色緩衝液200 mLを、いずれも脱イオン水を用いて調製します。ブロモフェノールブルーのトラッキングダイがゲルの下端に到達したら、電源を切ってください。ミニセルを開き、ゲルを取り出します。カセットの両側を分離します。ゲルナイフを使用して、ゲルの方向を示すために角をカットします。カセットから慎重にゲルを取り出し、100 millilitersのRena Bufferを入れた容器に入れます。室温で30分間、緩やかに撹拌しながらゲルをインキュベートし、Renaバッファーを除去して、100 mLの展開バッファーをゲルに加えます。室温で30分間、緩やかに撹拌しながらインキュベートします。その後、展開バッファーを除去し、さらに100 mLの新鮮な展開バッファーをゲルに加えます。ゲルを37°Cで一晩インキュベートします。一substack一晩のインキュベート後、現像バッファーを除去し、脱イオン水中で緩やかに攪拌しながらインキュベートしてゲルを洗浄します。室温で5分間、この洗浄操作を2回繰り返します。ゲルをプラスチック製のシートプロテクターの上に置き、気泡を取り除きます。その後、タンパク質標準のバンドはゲル染色後にほとんど見えなくなるため、フォトスキャナーでゲルをスキャンして正確な位置を保存します。20 mLのSimply Blue Safe Stainを加え、ゲルを染色します。室温で1時間インキュベートします。緩やかに撹拌しながらSimply Blue Safe Stainを除去し、室温で100 mLの脱イオン水を用いて緩やかに撹拌しながらゲルを脱染色します。1時間後、新しい脱イオン水に交換し、ゲルをさらに少なくとも1時間インキュベートします。サイトメトリーを用いてデータを解析するには、まずゲルを水から慎重に取り出し、プラスチック製シートプロテクターに入れます。フォトスキャナーを用いて、解像度300 dpi以上の設定でゲルをスキャンしてください。画像をTIFF形式で保存します。Image Jまたは同様の定量ソフトでTIFFファイルを開き、バンド強度を測定します。画像タイプを8ビットに設定し、画像を白黒で表示します。長方形選択ツールを使用して、最初のバンドを囲むように、幅の2倍以上の高さを持つ長方形を描画します。[analyze gels]を選択します。[first lane]を選択すると、バンドが選択されます。すると、新しい長方形が表示されます。それを次のバンドに移動し、[Analyze gels]を選択して、[next lane]を選択します。すべてのバンドが選択されるまで、この操作を繰り返します。「analyze gels plot lanes」を選択し、各バンドのプロファイルプロットを生成します。直線選択ツールを使用してベースラインを引き、目的のピークが完全に囲まれた領域になるようにします。その後、マジックワンドツールを選択し、各ピークの内部をクリックして選択してください。「Analyze Gels」を選択し、「Label Peaks」をクリックして、選択した各ピークの面積を含むテーブルを取得します。これらのデータはそのままプロットすることも、選択したバンドの値で正規化することも可能です。この正規化は、結果の統計的有意性を決定するために、複数の反復ゲルの値を統合する場合に特に重要となります。ここに示すゲルの各ウェルには、異なる細胞培養液がロードされています。これらは、異なる量のMMP2を含む上清です。このゲルを直接観察すると、一部のウェル間でMMP2濃度の明らかな差があることがわかります。例えば、バンドの客観的な定量化を行うと、ウェル4および5の両方がウェル10および11よりもはるかに多くのMMP2を含んでいることは明らかです。Image Jソフトウェアを用いて密度サイトメトリーが行われました。このソフトウェアにより、mmpに約4倍の差があることが明らかになりました。ウェル11と、ウェル4および5の間で、2つの量が異なっていました。同様に、MMP2の量において、ウェル10とウェル4および5の間で2倍の差が観察されました。ここでは、機能的な指標を検出する方法を示しています。金属パーシスをxogで行います。この手順を行う際は、サンプルを沸騰させないことが重要です。さもなければ、ゲル上にバンドが全く現れません。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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精密質量測定は、タンパク質の研究における重要なステップである。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）質量分析法（MS）は、そのような決定のために使用することができ、その主要な利点は、塩、界面活性剤および汚染に対する耐性である。ここでは、MALDI-MSによって100kDaのより大きなタンパク質の分析のためにアクセス可能なアプローチを示している。...

フライトのマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間（MALDI-TOF）100kDaのより大きなインタクトタンパク質の質量分析

このプロトコルは、ゼラチンとコラーゲンIからなる2D混合マトリックスの調製法と、線状のinvadosomesを研究するための3DコラーゲンIプラグの作成方法を記載しています。これらのプロトコールは、線状のインベルソーム形成、マトリックス分解活性、および初代細胞および癌細胞系の浸潤能力の研究を可能にする。...

線状インベーゾームの形成および活性を研究するための2Dおよび3Dマトリックス

ここでは、飛行時間分析法を用いた抽出提案原油マウス組織におけるプロテアーゼの特異性を決定するためのプロトコル。...

MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

ここでは、代わりにネイティブ蛋白質分解性基質として蛍光ペプチドを使用する変更におけるザイモグラムの技術のための詳しいプロトコルを提案する.蛍光ペプチド手技で生体試料の電気泳動におけるザイモグラムの前の技術よりも幅広いプロテアーゼの検出が有効にします。...

蛍光ペプチド ザイモグラフィーによってプロテアーゼ活性の検出

カプセル化、poly(ethylene glycol) (PEG) ゲル修飾と蛍光マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) の細胞を培養するためのプロトコルを提示するここでは、-分解性ペプチド。携帯電話の MMP と代謝活性は、標準的なマイクロ プレート...

世界的な細胞のマトリックスメタロプロテアーゼと 3 D ゲルの代謝活性を測定

hisタグの精製、透析、および活性化は、細菌における可溶性で活性なマトリックスメタロプロテイナーゼ-3触媒ドメインタンパク質発現の収率を増加させるために用いられる。タンパク質画分は、SDS-PAGEゲルを介して分析される。...

アフィニティークロマトグラフィーを用いたヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の細菌発現と精製

プロテイナーゼは細菌の病因に不可欠であり、侵入と免疫回避を可能にします。細菌の細胞質タンパク質と膜タンパク質を活性型で一段階で抽出することは悲惨です。このビデオ記事では、ゼラチナーゼを検出および特性評価するためのザイモグラフィー分析のために 、レプトスピラ の全細胞タンパク質を抽出する方法を示します。...

細菌ゼラチナーゼのワンステップ抽出とザイモグラフィー分析

学ぶ ゼラチンザイモグラフィーを用いたマトリックスメタロプロテイナーゼ活性の検出法。培養上清や体液中のMMPを可視化し、バンド密度解析で定量的に評価する実験手法です。

ザイモグラフィーによる機能マトリックスメタロプロテイナーゼの検出

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