バイオフィルムマトリックスの完全性を評価するためのエタノール耐性アッセイ

栄養寒天で培植された病原性細菌由来のバイオフィルムを例に挙げましょう。

未処理のバイオフィルムは、保護的な細胞外マトリックス内に密集した細菌を特徴としています。

阻害剤処理バイオフィルムは、まばらなマトリックス内に緩やかに結合した細胞を特徴としています。

各バイオフィルムを二分し、片方をバッファーに曝露して対照として、もう片方をエタノールに曝露して抗菌ストレスをかけます。

未処理のエタノール曝露バイオフィルムでは、高密度マトリックスがエタノール拡散を減らし、細胞の浸透を制限することで細菌の殺菌が減少します。

阻害剤処理されたエタノール曝露バイオフィルムでは、マトリックスが稀であるためエタノールがより容易に浸透し、細菌の殺菌率が高まります。

チューブを遠心分離し、上清液を取り除きます。バッファーを加えてソニック処理して細胞を分散させます。

希釈した懸濁液をプレートし、培養して生存可能な細菌の成長を許可します。

コロニー形成単位(CFU)をカウントします。阻害剤処理されエタノール曝露されたバイオフィルムからのCFUが少ないことは、マトリックスの完全性がエタノール耐性に不可欠であることを示しています。

きれいなカミソリの刃を使い、テンプレートを使ってバイオフィルムのコラボリーを等分に二つに切り分けます。きれいなヘラでコロニーの半分を慎重に持ち上げ、500マイクロリットルのPBSを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移します。

コロニーの後半分を取り、500マイクロリットルの50%エタノールを含むマイクロ遠心分離機チューブに移します。これらは滅菌剤に対する耐性を評価するために用いられます。同様に、D-ロイシン処理されたコロニーの前半分をPBSに置きます。

そして、この菌株の後半部分をエタノールに移します。バイオフィルム半分を含むすべてのチューブを室温で10分間培養します。そして、18,000倍gで5分間遠心分離します。

ピペットを使って上澄液を慎重に除去します。PBSを300マイクロリットル追加し、マイクロチップソニックケーターで低設定で細胞を超音波測定します。さらに700マイクロリットルのPBSを加え、最終的な1ミリリットルの体積にします。

次に、PBSで10のマイナス7の連続希釈を行います。希釈液のうち100マイクロリットルを取り、1.5%の寒天LBプレートに接種します。この工程をサンプルごとに2回の希釈で繰り返します。

接種液をガラスビーズで広げ、30度の温度で一晩培養します。プレートを調べ、コロニー形成ユニット(CFU)を数えてください。CFUを1ミリリットルあたり計算した後、PBSとエタノール処理の生存者の割合を計算します。