JoVE 実験百科事典
微生物学
0 回視聴 • 2:32 分 • February 26th, 2026
包嚢性線維症患者由来の痰ろ過液を補足した培地で、付着した細菌を含むチャンバー付きカバーグラスを培養し、培地のみで培養します。
喀痰ろ過液には宿主由来成分が含まれており、細菌のシグナル伝達経路を刺激し、マトリックスの生成やバイオフィルム形成を促します。
バイオフィルムが形成されたら、遊離細菌や残留宿主由来成分を含む培地を廃棄します。
緩く付着した細菌を取り除くためにバッファーで洗いましょう。
膜透過性と膜不透性蛍光染料を含む染色混合物を加え、暗闇で培養します。
膜透過性染料は完全な膜を横断し、生存可能な細菌と非生存細菌の両方を標識します。対照的に、不透水性染料は損傷した膜にのみ侵入し、生存できない細菌を選択的に標識します。
培養後、染色液を取り除きバッファーで洗浄し、余分な染料を除去し背景蛍光を軽減します。
新しい培地を加え、共焦点顕微鏡で画像を取得します。
痰ろ過液で培養されたバイオフィルムは厚さが増し、宿主由来成分がバイオフィルム形成に果たす役割を強調しています。
成長後、チャンバーウェルから培地を取り出し、各チャンバーを300マイクロリットルの滅菌PBSで優しく2回洗います。
次に、バイオフィルム染色混合物を準備するには、バイアビリティキットに付属する各染料を必要な溶液1ミリリットルに1マイクロリットル加え、溶液を混ぜます。
最適な染料量と染色時間は、各生物ごとに経験的に決定されます。
チャンバー付きカバーガラスの各ウェルに200マイクロリットルの染色液を加えます。カバーガラスを孵化させてください。
培養後、チャンバーから染色混合物を取り出し、各ウェルを300マイクロリットルの無菌PBSで洗浄します。
PBSを新しいメディアに置き換えましょう。最後に、共焦点顕微鏡による可視化を進めます。