ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

このビデオプロトコルの目的は、ニューロスフィアアッセイを用いて、マウス胚脳から神経幹細胞を単離し、拡大培養することです。手順には、E 14マウス胚の採取、それに続く神経節隆起を採取するための脳の微小解剖、単一細胞懸濁液を得るための採取組織の分散、そして最終的に細胞をニューロスフィア培養に播種する工程が含まれます。こんにちは、フロリダ大学マイト脳研究所のBrent Frensell博士の研究室のHassan Aliです。

本日は、ニューロスフィアアッセイを用いて、マウスの胚性脳からニューロスフィア培養を構築する方法について説明します。当研究室では、神経幹細胞の単離および増殖のために、日常的にこのアッセイを利用しています。それでは、始めていきましょう。

時間交代で交配させた妊娠マウスを麻酔します。妊娠14日目に頚脱を行い、腹部を70% ethanolで洗浄します。大きなピンセットで腹部の皮膚をつかみ、大きなはさみで皮膚と下層の筋膜を切開します。

腹腔と子宮角を露出させ、胚を含む子宮角を取り出して、冷たいHanks' Balanced Salt Solution（HBSS）を入れた50 mlコニカルチューブに移します。子宮組織をPC2フードに移した後、50 mlチューブからHBSSを除去し、十分な量の新鮮で冷たいHBSSで組織を洗浄して、血液や毛などの汚染物質を取り除きます。この洗浄操作を2〜3回繰り返します。その後、子宮組織を冷たいHBSSを入れた10 cmペトリ皿に移します。

小型の曲弯鉗子と鋏を用いて子宮角を開き、胚を冷HEMを含む新しいディッシュに移します。すべての胚を回収するまでこの手順を繰り返します。その後、胚を解剖顕微鏡下に置きます。

胚の頭部を頸髄レベルで分離し、冷たいHEMを含む別のペトリ皿に移します。微細な曲弯鉗子で頭部を固定し、マイクロシザーを使用します。まず、鼻の上に水平な切開を加え、次に前額部から後頭部に向かって正中線に沿って切開を続けます。

皮膚と頭蓋骨を完全に切断し、下層の脳を損傷させないように注意してください。湾曲鉗子を用いて、切断箇所の端を後方に押し出すようにして、頭蓋骨から脳を取り出します。すべての脳が頭蓋骨から取り出されるまで、この操作を繰り返します。

湾曲したピンセットで脳を固定し、背側が上を向くようにします。次に、マイクロシザーを用いて、嗅球から各半球の後方にかけて、両半球の皮質を切断します。神経節丘を露出させるため、脳を固定したまま、45度角度付きピンセットで神経節丘全体を切り出し、別のペトリ皿に移します。ここでは、内側部と外側部を伴う神経節丘が明確に示されています。

あるいは、微小鉗子を用いて周囲の組織を除去し、神経節丘を切り出すことも可能です。また、いずれかの領域から細胞を培養したい場合は、丘全体を内側と外側の半分に切断することもできます。

すべての脳の微小解剖が完了するまで、この手順を繰り返します。1 mLの神経幹細胞培地を用いて組織片を回収し、15 mL遠心チューブに移します。組織をすべて回収できるよう、15 mLチューブ内で組織塊を沈殿させてください。

上清培地の一部を取り除き、ペトリ皿の底を洗浄して、残っている組織を15 mlチューブに回収します。ピペットチップをチューブの底に当て、懸濁液を3〜4回ピペッティングして組織を分散させ、単一細胞懸濁液を作成します。

その後、凝集していない塊が沈殿するまで懸濁液を1分間静置し、細胞懸濁液のほぼ全量を別の15 mlチューブに移します。次に、残った塊に1 mlの神経幹細胞培地を加え、単一細胞に分散させます。チューブの内容物を回収します。

次に、懸濁液を700 RPMまたは110 Gで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を1 mLの完全神経幹細胞培地で再懸濁します。細胞懸濁液を10 µL取り、90 µLのトリパンブルーとよく混合します。

次に、この懸濁液を10 µL取り、ヘモサイトメーターに転送します。細胞数をカウントしてください。1枚のT80フラスコに播種するため、計20 mLの完全神経幹細胞培地を50 mLコニカルチューブに移します。

次に細胞懸濁液を混ぜ、1 mLあたり200,000個、またはT 80フラスコあたり400万個の総密度になるように適切な量の細胞を加えます。最終濃度が20 ng/mLとなるようにEGFを加えます。成長因子を含む完全神経幹細胞培地中の細胞を混ぜ、細胞懸濁液をT 80フラスコに移します。

フラスコにラベルを貼り、顕微鏡下で細胞を確認して、組織の塊がなく単一細胞懸濁液になっていることを確かめます。フラスコを37°C、5%CO2のインキュベーターに移動させ、5〜7日間培養します。5〜7日後、顕微鏡下でフラスコの状態を評価します。

この時点でニューロスフィアが形成されており、直径が150から200 µmになっているはずで、継代培養が可能な状態になります。フラスコの内容物を適切なサイズの滅菌組織培養チューブに回収し、チューブを遠心分離して上清を捨てます。スフィアを1 mLの予熱したトリプシンで再懸濁し、チューブを37 °Cのウォーターバスに2分間置きます。

次に、等量のトリプシン阻害剤を加え、トリプシン活性を停止させるために、穏やかに十分に混合します。再び遠心分離し、上清を除去します。その後、細胞を1 mLの完全神経幹細胞培地で再懸濁し、前述の方法で細胞数をカウントします。1本のT 175フラスコに播種するために、計40 mLの完全神経幹細胞培地を50 mLコニカルチューブに移します。

その後、細胞を混合し、M flaskあたり50,000 cells、またはT 1 75 flaskあたり2 million cellsの総密度になるように適切な量の細胞を添加します。次に、最終濃度が20 nanograms per milとなるようにEGFを添加します。完全神経幹細胞培地中の細胞を成長因子とともに混合し、細胞懸濁液をT 1 75 flaskに移します。

フラスコにラベルを貼り、インキュベーターに5〜7日間入れておきます。これは E 14 神経幹細胞の一次培養の例です。播種から3日後、矢印で示されているのが増殖している神経幹細胞のクラスターです。

基質に付着し、分化した細胞も見られます。これは、播種から7日後のプライマリーE 14神経幹細胞培養の例です。ご覧のように、さまざまなサイズのスフィアが形成されています。

また、分化した細胞も見られます。デブリの量は、成人一次神経球状体培養よりも大幅に少なくなっています。また、球状体は凝集しておらず、周辺にマイクロスパイクが形成されており、これは球状体が健全で生存可能であることを示しています。

中心部の細胞死により色が暗くなる可能性があるため、スフィアを大きく成長させすぎないようにしてください。また、大きなスフィアは基質に接着し、分化することがあります。これは、播種から5日後の継代1代目のE 14ニューロスフィアの例です。

ここでも、球体の周辺に微小なスパイク（突起）が見て取れます。ここでは、上述の手順に従って、E14マウスの神経節乳頭からニューロスフェアを培養する方法について説明しました。また、皮質や中脳など、脳の他の領域からもニューロスフェアを培養することが可能です。

ご視聴ありがとうございました。ニューロスフィア培養の成功をお祈りしております。