Name: ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T20:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学ぶニューロスフェアアッセイによるマウスE14胎关脳神経幹細胞の単離と培養法。神経幹細胞の増殖と神経科学・発生生物学研究への応用を解説します。

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この作品は、オーバストリート財団からの資金によってサポートされていました。

1。基本的には、解剖に進む前に設定します。 <ol><li>完全なNSC媒体の適切な量はそれぞれ、9:1の比率でNeuroCult NSC基礎培地とNeuroCult NSC増殖サプリメントを混合して調製される。 </li><li>培地は37℃の水浴で暖めています。 </li><li>抗生物質の高濃度（10％）とコールドHEPES緩衝最小必須培地（HEM）は、解剖や洗浄を目的として作成されています。また、抗生物質の補充とNSC基礎培地はまた、この目的のために使用されることがあります。 </li><li>抗生物質を含む冷HEMの25〜30 mLを胚の収集のための滅菌50mLのチューブに分注しています。 </li><li>いくつかの10cmのプラスチック製のペトリ皿を解剖中の胚や脳を保持するため、また、解剖組織を保持するために必要とされる。 </li><li>胚（大はさみ、小さな尖ったハサミ、大型ピンセット、小さな湾曲鉗子）または胚の脳の解剖のための（小さな鉗子、湾曲した微細な鉗子、45 °傾斜細かい鉗子、そして小さなはさみ）を削除するために必要な手術器具は、使用して滅菌されています250ガラス玉滅菌器° Cまたは他の利用可能なオートクレーブ方法。 </li><li>解剖顕微鏡は、70％アルコールで拭き取ると層​​流またはPC2のフード内に設定されています。 </li></ol> 2。 E14マウス脳およびマイクロダイセクションを収穫。 <ol><li>妊娠中のマウスを交配時間は一日に自分の機関の承認された動物のプロトコルに従って、妊娠第 14 回麻酔です。 </li><li>頸椎脱臼は、動物が苦痛を被ることはないか確認されます。 </li><li>麻酔マウスは、吸収性ティッシュペーパーで、その後ろにレイアウトされ、そして腹部はエリアを殺菌するために70％エタノールでリンスする。 </li><li>腹部の皮膚は、大規模な鉗子を用いて把握しているし、皮膚および基礎となる筋膜は、腹腔内および子宮角を公開する大型ハサミで切断されています。 </li><li>子宮は小さな鉗子とはさみで除去し、50 mlコニカルチューブを含有する冷HEMをに転送されます。 </li><li>子宮組織は、フードに転送され、血液や髪の毛のような可能性汚染物質を除去するために、新鮮な無菌冷たいHEMの十分な量で一度か二度洗浄する。 </li><li>子宮組織は、その後コールドHEMを含む10センチメートルペトリ皿に移しています。 </li><li>子宮角を小さく湾曲鉗子や鋏を使用して開かれ、胚は冷たいHEMを含む新しい10cmの皿に転送されます。 </li><li>胚の頭部は、頚髄レベルで分離し、冷HEMを含む別のペトリ皿に移しています。 </li><li>ペトリ皿は、頭蓋骨から脳を削除するには解剖顕微鏡下で転送されます。 </li><li>ヘッドは、ヘッドの背側が上向きに直面しているように尾側から細かい曲がったピンセットで保持されます。マイクロはさみを使用して、最初の水平カットは目の上に作られ、次に頭の後ろに向かって額から正中線に続いた。皮膚や頭蓋骨を介してカットすると、基礎となる脳を損傷しないようにしてください。 </li><li>脳は、湾曲鉗子を使用して後方にモーションで切断面の端を押して、頭蓋骨から削除されます。すべて脳が頭蓋骨から削除されるまでこの手順が続行されます。 </li><li>脳は、背側が上向きに直面してmicroscissorsカットが神経節隆起を公開するために、嗅球から半球の後ろに伸びる各半球の皮質を介して実行されるを使用しているように湾曲した鉗子を使用して着実に開催されます。 </li><li>片手で湾曲鉗子やその他の45 °傾斜鉗子を用いて、皮質のカットフラップが広がっていると神経節隆起が出解剖されています。 </li><li>解剖組織を無菌10センチメートルペトリ皿に配置され、すべて脳がマイクロ解剖されるまで、この手順が繰り返される。 </li><li>組織片は、1 mLのピペットチップでNSCの培地1mLを用いて採取し、15 mLの遠心管に移しています。 </li><li>組織はその後、徹底的に、かつ慎重にチューブの底にピペットチップを押すと上下サスペンションをピペッティングにより解離している。この方法では、凝集塊は、単一の細胞に分割されています。ピペッティングは乳白色のような懸濁液が得られるように3-4回行われます。その後、懸濁液を非解離塊が沈殿するように1〜2分間静置しています。 </li><li>ほぼ全体の細胞懸濁液は、他のチューブに転送され、その後NSC媒体の別の1 mLを説明されているように、残りの塊と単一細胞に解離するために追加されます。 </li><li>チューブの含有量は、700rpm（110グラム）で、室温で5分のためにプールし、遠心分離されています。 </li><li>上清は、実際のペレットにダウンオフ真空引きされ、細胞は完全なNSCの培地1mLに再懸濁する。 </li><li>培地を穏やかに上下にピペッティングしています均質な単一の細胞懸濁液を持っている。 </li><li>細胞懸濁液の10μLを、細胞数を数えるために、トリパンブルーの90μLと混合される。 </li><li>最後に、細胞は、20ng / mLの上皮成長因子（EGF）を添加した完全なNSCの培地で2 × 10 5細胞/ mLの密度でプレーティングされています。 5 mLの培地は、T175フラスコ用T75および40mLのためのT25、20 mLのために使用されます。 </li><li> 37℃加湿インキュベーター中、5％のCO 2でインキュベートしたときにニューロスフェアは、5〜7日間に形成されています。 6-7日に、球は150から200ミクロンの間で測定する必要がありますし、サブカルチャー（通路）への準備が整います。 </li></ol> 3。継代と胚NSCの拡張： <ol><li>ニューロスフェアは、サブカルチャー（直径150から200ミクロン）のための準備ができたら、一時停止球と培地は、フラスコから除去し、適切なサイズの滅菌組織培養チューブに入れ、そしてで5分間、700rpmで（110 g）で遠心分離され室温。 </li><li>上清を捨て、球は％0.05トリプシン- EDTAを1 mLに再懸濁する。 </li><li>細胞懸濁液を2〜3分間37℃の水浴中でインキュベートされている場合、大豆トリプシンインヒビターの等量のトリプシン活性を停止するために使用されます。 </li><li>細胞懸濁液を穏やかにトリプシンが完全に不活化されていることを保証するために上下にピペッティングしています。 </li><li>細胞懸濁液を5分間700rpmで（110グラム）で遠心分離する。その後、上清を除去し、細胞は完全なNSCの培地1mLに再懸濁する。 </li><li>細胞懸濁液の10μLを、細胞数を数えるために、トリパンブルーの90μLと混合される。 </li><li>細胞は、適切なサイズの組織培養フラスコで20ng / mLのEGFを補充した完全なNSCの培地で5 × 10 4細胞/ mLの濃度で播種されています。 5 mLの培地は、T175フラスコ用T75および40mLのためのT25、20 mLのために使用されます。 </li><li> 37℃加湿インキュベーター中、5％のCO 2でインキュベートしたときの二次ニューロスフェアは、5〜7日間に形成されています。 </li></ol> 4。代表的な結果： 一次胚NSCの文化では、細胞の大部分は肥大になり、メッキ時に組織培養皿に付着する。細胞の大多数はどちらか死ぬかを区別しますが、2〜3日後、増殖細胞は、基板（図1）から切り離されて、細胞の小さなクラスターを作る。文化の最初の48時間の大球状凝集体の形成は、主球と誤解されるべきではない。凝集体形成は、主に破片や文化における非解離組織の塊の量に依存します。真のニューロスフェアは、位相明るく、サイズが大きくなる（図2）として、より球形になる。小さなmicrospikesは生存と健康な球体の外面（図3）に表示されます。 5〜7日後、球は丸いですが圧縮してはいけません、そして、直径150〜200μmを測定する必要があります。ニューロスフェアは、（文化9〜10日後）が大きすぎるを成長させるために許可されている場合、それらは、凝集体を形成するか（ビデオを参照）球の中心にいるため細胞死の色で暗くなることがあります。大規模なニューロスフェアは、最終的に（基板に装着し、周辺に向かって移行する） その場で差別化を開始することがあります。また、大規模なニューロスフェアを解離することは困難であり、それらをサブカルチャー。 <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。プライマリE14 NSCの文化は、めっき後の3日間。矢印は、NSCの増殖クラスタを示しています。オリジナルの倍率、20倍<img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。プライマリE14 NSCの文化めっき後の7日間。オリジナルの倍率、10倍<img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。めっき後のパッセージone E14ニューロスフェアを5日間を。球の周囲にマイクロスパイクを（矢印）に注意してください。オリジナルの倍率、20倍

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain%3A+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Craig, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+growth+factor+expansion+of+endogenous+subependymal+neural+precursor+cell+populations+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain.</a> J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).</li>
<li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+neural+colony-forming+cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay.</a> Stem Cells. 26, 988-996 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ニューロスフェアのアッセイは、そのシンプルさと再現性の神経幹細胞1-5の分離と拡大のための選択の方法です。このアッセイは、in vitroおよびin vivo試験の両方に使用できる未分化のCNS ​​前駆細胞、の大規模な世代のための貴重なツールです。それは、ニューロスフェアは、善意の神経幹細胞とより限定された前駆細胞の両方から生成することができることが強調されるべきである。したがって、ニューロスフェア形成頻度を計算すると、単に任意の神経細胞集団6の善意のNSCの数を過大評価する。善意のNSCの頻度を推定するために、それは強く、この目的の7で開発された細胞アッセイを形成ニューラルコロニー（N -シミュレーションプロジェクト）を、使用することをお勧めします。 E14 NSCの一貫した高品質のニューロスフェアの文化を持っているために、お勧め： <ol><li>胚を収穫を開始する前に必要な項目を準備する。 </li><li>解剖を通して冷たいHEMまたは基礎NSC培地に胚を保つた...

* HEMを行うには、1M HEPESのMEM and160mlの110Lパケットを混在させると蒸留水を使用して、8.75 Lのボリュームをもたらす。 7.4に最終pHを設定し、それは4℃で保存する

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

哺乳類では、幹細胞は、動物の寿命の間にさまざまな組織や器官の細胞の起源と更新を維持するために未分化細胞のソースとして機能します。彼らは潜在的に老化の過程で、または負傷し、疾病の過程で失われた細胞を置き換えることができます。神経幹細胞（NSC）の存在が最初の小説、無血清培養系を用いて成体哺乳類の中枢神経系（CNS）、ニューロスフェアアッセイ（NSA）にレイノルズとWeiss（1992）によって記述されていた。このアッセイを使用して、それは胚の中枢神経系のさまざまな地域からのNSCを分離し、拡大することも可能です。 in vitroでの拡張のNSC でこれらは多能性であり、中枢神経系の三大細胞型を生じさせることができる。 NSAが実行するのが比較的簡単に思えますが、信頼性と一貫性のある結果を達成するために必要とされるここで示す手順に注意が必要です。このビデオでは、実質的にNSAは、胚性14日目マウスの脳組織からのNSCを生成し、拡大を示し、1つが再現可能なニューロスフェア培養を達成できるように技術的な詳細を提供します。手順は、単一の細胞懸濁液を得るために神経節隆起、NSCの培地で収穫した組織の解離を収穫するために、脳の顕微解剖をE14マウス胚を収穫し、最終的にNSAの培養中の細胞をプレーティングが含まれます。文化の中で5〜7日後、得られた一次ニューロスフェアは、さらに将来の実験のためのNSCの数を拡大して継代されています。

このビデオプロトコルは、胚14日目マウスの脳の神経節隆起から神経幹細胞の単離と拡大のためのニューロスアッセイのアプリケーションを示しています。

哺乳類において、幹細胞は未分化細胞の供給源として機能し、生涯を通じてさまざまな組織や器官における細胞生成と更新を維持している。

このビデオプロトコルの目的は、ニューロスフィアアッセイを用いて、マウス胚脳から神経幹細胞を単離し、拡大培養することです。手順には、E 14マウス胚の採取、それに続く神経節隆起を採取するための脳の微小解剖、単一細胞懸濁液を得るための採取組織の分散、そして最終的に細胞をニューロスフィア培養に播種する工程が含まれます。こんにちは、フロリダ大学マイト脳研究所のBrent Frensell博士の研究室のHassan Aliです。本日は、ニューロスフィアアッセイを用いて、マウスの胚性脳からニューロスフィア培養を構築する方法について説明します。当研究室では、神経幹細胞の単離および増殖のために、日常的にこのアッセイを利用しています。それでは、始めていきましょう。時間交代で交配させた妊娠マウスを麻酔します。妊娠14日目に頚脱を行い、腹部を70% ethanolで洗浄します。大きなピンセットで腹部の皮膚をつかみ、大きなはさみで皮膚と下層の筋膜を切開します。腹腔と子宮角を露出させ、胚を含む子宮角を取り出して、冷たいHanks' Balanced Salt Solution（HBSS）を入れた50 mlコニカルチューブに移します。子宮組織をPC2フードに移した後、50 mlチューブからHBSSを除去し、十分な量の新鮮で冷たいHBSSで組織を洗浄して、血液や毛などの汚染物質を取り除きます。この洗浄操作を2〜3回繰り返します。その後、子宮組織を冷たいHBSSを入れた10 cmペトリ皿に移します。小型の曲弯鉗子と鋏を用いて子宮角を開き、胚を冷HEMを含む新しいディッシュに移します。すべての胚を回収するまでこの手順を繰り返します。その後、胚を解剖顕微鏡下に置きます。胚の頭部を頸髄レベルで分離し、冷たいHEMを含む別のペトリ皿に移します。微細な曲弯鉗子で頭部を固定し、マイクロシザーを使用します。まず、鼻の上に水平な切開を加え、次に前額部から後頭部に向かって正中線に沿って切開を続けます。皮膚と頭蓋骨を完全に切断し、下層の脳を損傷させないように注意してください。湾曲鉗子を用いて、切断箇所の端を後方に押し出すようにして、頭蓋骨から脳を取り出します。すべての脳が頭蓋骨から取り出されるまで、この操作を繰り返します。湾曲したピンセットで脳を固定し、背側が上を向くようにします。次に、マイクロシザーを用いて、嗅球から各半球の後方にかけて、両半球の皮質を切断します。神経節丘を露出させるため、脳を固定したまま、45度角度付きピンセットで神経節丘全体を切り出し、別のペトリ皿に移します。ここでは、内側部と外側部を伴う神経節丘が明確に示されています。あるいは、微小鉗子を用いて周囲の組織を除去し、神経節丘を切り出すことも可能です。また、いずれかの領域から細胞を培養したい場合は、丘全体を内側と外側の半分に切断することもできます。すべての脳の微小解剖が完了するまで、この手順を繰り返します。1 mLの神経幹細胞培地を用いて組織片を回収し、15 mL遠心チューブに移します。組織をすべて回収できるよう、15 mLチューブ内で組織塊を沈殿させてください。上清培地の一部を取り除き、ペトリ皿の底を洗浄して、残っている組織を15 mlチューブに回収します。ピペットチップをチューブの底に当て、懸濁液を3〜4回ピペッティングして組織を分散させ、単一細胞懸濁液を作成します。その後、凝集していない塊が沈殿するまで懸濁液を1分間静置し、細胞懸濁液のほぼ全量を別の15 mlチューブに移します。次に、残った塊に1 mlの神経幹細胞培地を加え、単一細胞に分散させます。チューブの内容物を回収します。次に、懸濁液を700 RPMまたは110 Gで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を1 mLの完全神経幹細胞培地で再懸濁します。細胞懸濁液を10 µL取り、90 µLのトリパンブルーとよく混合します。次に、この懸濁液を10 µL取り、ヘモサイトメーターに転送します。細胞数をカウントしてください。1枚のT80フラスコに播種するため、計20 mLの完全神経幹細胞培地を50 mLコニカルチューブに移します。次に細胞懸濁液を混ぜ、1 mLあたり200,000個、またはT 80フラスコあたり400万個の総密度になるように適切な量の細胞を加えます。最終濃度が20 ng/mLとなるようにEGFを加えます。成長因子を含む完全神経幹細胞培地中の細胞を混ぜ、細胞懸濁液をT 80フラスコに移します。フラスコにラベルを貼り、顕微鏡下で細胞を確認して、組織の塊がなく単一細胞懸濁液になっていることを確かめます。フラスコを37°C、5%CO2のインキュベーターに移動させ、5〜7日間培養します。5〜7日後、顕微鏡下でフラスコの状態を評価します。この時点でニューロスフィアが形成されており、直径が150から200 µmになっているはずで、継代培養が可能な状態になります。フラスコの内容物を適切なサイズの滅菌組織培養チューブに回収し、チューブを遠心分離して上清を捨てます。スフィアを1 mLの予熱したトリプシンで再懸濁し、チューブを37 °Cのウォーターバスに2分間置きます。次に、等量のトリプシン阻害剤を加え、トリプシン活性を停止させるために、穏やかに十分に混合します。再び遠心分離し、上清を除去します。その後、細胞を1 mLの完全神経幹細胞培地で再懸濁し、前述の方法で細胞数をカウントします。1本のT 175フラスコに播種するために、計40 mLの完全神経幹細胞培地を50 mLコニカルチューブに移します。その後、細胞を混合し、M flaskあたり50,000 cells、またはT 1 75 flaskあたり2 million cellsの総密度になるように適切な量の細胞を添加します。次に、最終濃度が20 nanograms per milとなるようにEGFを添加します。完全神経幹細胞培地中の細胞を成長因子とともに混合し、細胞懸濁液をT 1 75 flaskに移します。フラスコにラベルを貼り、インキュベーターに5〜7日間入れておきます。これは E 14 神経幹細胞の一次培養の例です。播種から3日後、矢印で示されているのが増殖している神経幹細胞のクラスターです。基質に付着し、分化した細胞も見られます。これは、播種から7日後のプライマリーE 14神経幹細胞培養の例です。ご覧のように、さまざまなサイズのスフィアが形成されています。また、分化した細胞も見られます。デブリの量は、成人一次神経球状体培養よりも大幅に少なくなっています。また、球状体は凝集しておらず、周辺にマイクロスパイクが形成されており、これは球状体が健全で生存可能であることを示しています。中心部の細胞死により色が暗くなる可能性があるため、スフィアを大きく成長させすぎないようにしてください。また、大きなスフィアは基質に接着し、分化することがあります。これは、播種から5日後の継代1代目のE 14ニューロスフィアの例です。ここでも、球体の周辺に微小なスパイク（突起）が見て取れます。ここでは、上述の手順に従って、E14マウスの神経節乳頭からニューロスフェアを培養する方法について説明しました。また、皮質や中脳など、脳の他の領域からもニューロスフェアを培養することが可能です。ご視聴ありがとうございました。ニューロスフィア培養の成功をお祈りしております。

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Neuroscience

神経科学

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神経幹細胞（NSCは）自己再生および3神経系統に分化することができる細胞を指します。ここでは、クローン性条件下でニューロスフェア形成および分化を使用して、指定された細胞集団におけるNSCの周波数を決定するためのプロトコルを説明します。...

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最小限の脊髄損傷のマウス モデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ

E13マウス胚神経節隆起から顕微鏡下神経幹細胞の分離法を紹介します。...

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

本稿では、主マウス神経原性ニッチ由来の出生後マウス神経幹細胞から神経球培養を生成するためのプロトコルについて詳細に述べる。神経球は、脳組織から神経幹細胞を同定するために使用され、前駆細胞数の推定を可能にする。さらに、これらの3D構造は分化条件でメッキすることができ、ニューロン、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトを生じさせ、細胞運命の研究を可能にする。...

出生後(P1-3)マウス神経起源ニッチからの神経球の分離と拡大

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成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

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ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

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