Name: 診断と治療モニタリングのためのナノ材料の登録バイオイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 16 s
Description: 学ぶナノ粒子の生体分布評価法と治療効果モニタリング技術。磁気標識ナノ粒子を用いた非侵襲的バイオイメージングにより、神経変性疾患の診断と治療開発に貢献する研究手法を解説します。

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作品は、国立衛生研究所からの補助金1K25MH089851、1P01DA028555 - 01A1、2R01 NS034239、2R37 NS36126、NS31492 P01、P20RR 15635、P01MH64570、およびP01 NS43985によってサポートされていました。著者は、原稿と卓越したグラフィックと文学的支援の重要な読書のために氏ロビンテイラーに感謝。また、作者は彼らの技術サポートはエリンマッキンタイア、メリッサメロン、そしてリンゼイライスに感謝します。

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<li>Dou, H., Grotepas, C. B., McMillan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+delivery+of+nanoformulated+antiretroviral+drug+to+the+brain+in+a+murine+model+of+neuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS.</a> J Immunol. 183, 661-669 (2009).</li>
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<li>Hasan, K. M., Parker, D. L., Alexander, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gradient+encoding+schemes+for+diffusion-tensor+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson+Imaging%22%5BJournal%5D)">Comparison of gradient encoding schemes for diffusion-tensor MRI.</a> J Magn Reson Imaging. 13, 769-780 (2001).</li>
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<li>Neeman, M., Freyer, J. P., Sillerud, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+obtaining+cross-term-free+images+for+diffusion+anisotropy+studies+in+NMR+microimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">A simple method for obtaining cross-term-free images for diffusion anisotropy studies in NMR microimaging.</a> Magn Reson Med. 21, 138-143 (1991).</li>
<li>Uberti, M. G., Boska, M. D., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automatic+image+segmentation+method+for+extraction+of+brain+volume+from+in+vivo+mouse+head+magnetic+resonance+imaging+using+Constraint+Level+Sets%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A semi-automatic image segmentation method for extraction of brain volume from in vivo mouse head magnetic resonance imaging using Constraint Level Sets.</a> J of Neurosci Methods. 179, 338-344 (2009).</li>
<li>Liu, Y., Uberti, M. G., Dou, H., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Boska, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Image+Warping+Technique+for+Rodent+Brain+MRI-Histology+Registration+Based+On+Thin-Plate+Splines+with+Landmark+Optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Photo+Opt+Instrum+Eng%22%5BJournal%5D)">An Image Warping Technique for Rodent Brain MRI-Histology Registration Based On Thin-Plate Splines with Landmark Optimization.</a> Proc Soc Photo Opt Instrum Eng. 7259, 72592-K-72597-K (2009).</li>
<li>Uberti, M. G., Liu, Y., Dou, H., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Boska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registration+of+in+vivo+MR+to+histology+of+rodent+brains+using+blockface+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Photo+Opt+Instrum+Eng%22%5BJournal%5D)">Registration of in vivo MR to histology of rodent brains using blockface imaging.</a> Proc Soc Photo Opt Instrum Eng. 7262, 726213-726213 (2009).</li>
<li>Basser, P. J., Mattiello, J., LeBihan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+effective+self-diffusion+tensor+from+the+NMR+spin+echo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson+B%22%5BJournal%5D)">Estimation of the effective self-diffusion tensor from the NMR spin echo.</a> J Magn Reson B. 103, 247-254 (1994).</li>
<li>Hasan, K. M., Narayana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+measurement+of+the+diffusion+tensor+eigenvalues+from+diffusion+anisotropy+and+mean+diffusivity+in+DTI%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Retrospective measurement of the diffusion tensor eigenvalues from diffusion anisotropy and mean diffusivity in DTI.</a> Magn Reson Med. 56, 130-137 (2006).</li>
<li>Ratiney, H., Sdika, M., Coenradie, Y., Cavassila, S., Ormondt, D. van, Graveron-Demilly, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-domain+semi-parametric+estimation+based+on+a+metabolite+basis+set%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Time-domain semi-parametric estimation based on a metabolite basis set.</a> NMR Biomed. 18, 1-13 (2005).</li>
<li>Naressi, A., Couturier, C., Castang, I., Beer, R. de, Graveron-Demilly, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Java-based+graphical+user+interface+for+MRUI%2C+a+software+package+for+quantitation+of+in+vivo%2Fmedical+magnetic+resonance+spectroscopy+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Java-based graphical user interface for MRUI, a software package for quantitation of in vivo/medical magnetic resonance spectroscopy signals.</a> Comput Biol Med. 31, 269-286 (2001).</li>
<li>Boska, L. ewis, Destache, T. B., J, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+1H+magnetic+resonance+spectroscopic+imaging+determines+therapeutic+immunization+efficacy+in+an+animal+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Quantitative 1H magnetic resonance spectroscopic imaging determines therapeutic immunization efficacy in an animal model of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 25, 1691-1700 (2005).</li>
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<li>Nelson, J. A., Dou, H., Ellison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coregistration+of+quantitative+proton+magnetic+resonance+spectroscopic+imaging+with+neuropathological+and+neurophysiological+analyses+defines+the+extent+of+neuronal+impairments+in+murine+human+immunodeficiency+virus+type-1+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Coregistration of quantitative proton magnetic resonance spectroscopic imaging with neuropathological and neurophysiological analyses defines the extent of neuronal impairments in murine human immunodeficiency virus type-1 encephalitis.</a> J Neurosci Res. 80, 562-575 (2005).</li>
<li>Boska, H. asan, Kibuule, K. M., D, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+diffusion+tensor+imaging+detects+dopaminergic+neuronal+degeneration+in+a+murine+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Quantitative diffusion tensor imaging detects dopaminergic neuronal degeneration in a murine model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 26, 590-596 (2007).</li>
<li>Liu, W., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+magnetically+labeled+cells+by+cellular+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI.</a> Eur J Radiol. 70, 258-264 (2009).</li>
<li>Balchandani, P., Yamada, M., Pauly, J., Yang, P., Spielman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-refocused+spatial-spectral+pulse+for+positive+contrast+imaging+of+cells+labeled+with+SPIO+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Self-refocused spatial-spectral pulse for positive contrast imaging of cells labeled with SPIO nanoparticles.</a> Magn Reson Med. 62, 183-192 (2009).</li>
<li>Stuber, M., Gilson, W. D., Schar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+contrast+visualization+of+iron+oxide-labeled+stem+cells+using+inversion-recovery+with+ON-resonant+water+suppression+%28IRON%29%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Positive contrast visualization of iron oxide-labeled stem cells using inversion-recovery with ON-resonant water suppression (IRON).</a> Magn Reson Med. 58, 1072-1077 (2007).</li>
<li>Suzuki, Y., Cunningham, C. H., Noguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+serial+evaluation+of+superparamagnetic+iron-oxide+labeled+stem+cells+by+off-resonance+positive+contrast%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo serial evaluation of superparamagnetic iron-oxide labeled stem cells by off-resonance positive contrast.</a> Magn Reson Med. 60, 1269-1275 (2008).</li>
<li>Kim, Y. B., Bae, K. H., Yoo, S. S., Park, T. G., H, P. ark <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+contrast+visualization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging+using+susceptibility-weighted+echo-time+encoding%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Imaging%22%5BJournal%5D)">Positive contrast visualization for cellular magnetic resonance imaging using susceptibility-weighted echo-time encoding.</a> Magn Reson Imaging. 27, 601-610 (2009).</li>
<li>Zhou, R., Idiyatullin, D., Moeller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWIFT+detection+of+SPIO-labeled+stem+cells+grafted+in+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">SWIFT detection of SPIO-labeled stem cells grafted in the myocardium.</a> Magn Reson Med. 63, 1154-1161 Forthcoming.</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

生体内イメージングの結果と組織の正確な登録は、神経疾患の検出と病期分類のためのイメージングバイオマーカーの開発における重要なステップです。いくつかのイメージングメトリックは、白質疾患と癌の存在を検出するために使用される組織の磁気緩和特性の変化を含めて総形態学的変化と相関している可能性があります。このようなDTIなどの他のより微妙な方法は、、病気によって引き起こされる組織学的変化が疾患の後期になるまで表示されないように検出されない場合があります初期の細胞の変化を検出する可能性があります。このような分光マーカーなど、まだ​​他のマー​​カーは、さらに微妙な細胞の変化に先行する早期かつ可逆的変化の兆候かもしれません。 生体内分布は、種々の方法を用いて非侵襲的に決定することができます。主要な非侵襲的な方法は、陽電子放射断層撮影（PET）、シングルフォトンエミッションCT（SPECT）、光イメージング、およびMRIです。イメージング（PETおよびSPECT）に基づく核医学は、多くの生体内分布のために長年にわたって使用されている、しかしこれらの方法は、特にPETトレーサーのために、化合物やナノ材料のラベルに使わ放射性トレーサーの半減期によって制限されます。光イメージングは​​、小型のげっ歯類に使用することができますが、このような光吸収と光散乱による表面の腫瘍のように簡単にアクセス可能な地域を除いて人間の使用に翻訳することはできません。また、これらの同じ理由により、光信号を定量化することは困難である。 MRIは、数週間の期間にわたって体内で追跡することができるようSPIOなどの永続的なタグを使用しています。ラベルが別のセルに転送することができますまたは体内で再吸収されるので、これは、あまりにも、、注意して使用する必要があります。 MRIにおけるSPIOの検出特異性は、種々の方法によって提供することができる。正と負の信号を提供する検出方法は、組織におけるSPIOの存在を検出するためのMRIの特異性を向上させるために使用されています。本研究で使用したサブトラクション法は、同様に28日 、他のユーザーによって使用されています。他のアプローチは、共鳴の検出29-31、SPIOのボイド32、およびSPIO 33の領域での正の信号強度を生成するためにT1加重を使用してゼロエコー時間の画像の近くに特定のパターンを生成する位相敏感画像をオフに含まれています。ラベルの定量を改善するためのこれらの方法の進歩、感度と特異性は、アクティブな研究分野は、今日です。

<table><tbody><tr><td>イソフルラン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>医療用酸素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>げっ歯類用ガス麻酔マスク</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRI対応ステレオタキシス頭部固定具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンカテーテルチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>非磁性針</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼用潤滑剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>テープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>灌流液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織包埋用OCTコンパウンド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRIシステム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織切片作製用クライオスタット</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

診断と治療モニタリングのためのナノ材料の登録バイオイメージング

Registered Bioimaging of Nanomaterials for Diagnostic and Therapeutic Monitoring 

Nanomedicationsは細網内皮系（RES、脾臓、肝臓、リンパ節）に血液を媒介と単球 - マクロファージによって行うことができ、臓器を終了する。後者は、肺、RES、および脳が含まれており、ヒト免疫不全ウイルスのいずれかを入力します（HIV - 1）感染時の手術です。組織へのマクロファージのエントリは、アクティブなHIV - 1複製や炎症の部位の分野で顕著である。ナノキャリアとしてのマクロファージの可能性を評価するためには、界面活性剤でコーティングされた超常磁性酸化鉄および/または薬剤を含んだ粒子が非経口HIV - 1脳炎マウスに注入した。これは、定量的に粒子と薬剤の生体内分布を評価するために行われました。磁気共鳴イメージング（MRI）検査の結果は、組織学的coregistrationと強化された画像処理によって検証された。変更された脳の組織学に代表されるようなエンドの臓器の疾患は、MRIにより評価した。限局性脳炎​​の分野にnanoformulationsの堅牢な移行のデモンストレーションは、&quot;マクロファージの遊走を監視する高度なバイオイメージング技術の使用のための&quot;概念実証&quot;を提供します。重要なことは、脳の病理組織学的異常は、実現可能な疾患の細胞の分布の研究ではMRIの一般的なユーティリティを作成するバイオイメージングのパラメータと相関する。このような方法を用いてヒトへの翻訳可能性のある疾患の負担と治療効果のリアルタイムのインデックスを提供できることを我々は仮定。

ナノ粒子の細胞の生体内分布を評価するために使用されるバイオイメージングの方法はnanoformulated化合物の治療と診断監視に適用できます。本明細書に記載の方法は、組織学的coregistrationで評価した場合、感度と特異性です。方法論は、げっ歯類から人間のアプリケーションへの翻訳経路を提供しています。

ナノ医薬品は、血中の単球・マクロファージによって網内系（RES；脾臓、肝臓、リンパ節）および末端へ運ばれることができ、

本手順の全体的な目的は、磁気標識または薬剤処方されたナノ粒子の分布をイメージングし、その治療有効性を評価することである。まず粒子を製造し、実験室モデルシステムを用いて細胞取り込みに関する生物学的特性を試験し、次に細胞を含有させた処方物を注入して、バイオイメージングにより組織分布を評価することでこれを達成する。ウイルス感染させた単球由来マクロファージの注入前後における、影響を受けた脳領域を可視化した。本手順の第2ステップは、細胞含有、磁気標識、または治療用ナノ粒子を含む脳の亜領域をイメージングすることです。これは、磁気標識ナノ粒子を含む細胞またはナノ製剤化された薬剤を注入した後の、さまざまな時間経過で行われます。本手順の第3ステップは、ナノ粒子の生体内分布および細胞変化に関するエンドポイント組織学的解析を行うことです。画像診断の結果と組織学的解析の共登録（co-registration）を行います。本手順の最終ステップでは、細胞注入後の経過時間に応じたナノ粒子の生体内分布の定量化および提示、分光学的異常の特定、および拡散テンソル異常の評価を行います。最終的に、磁気共鳴画像法（MRI）および分光法を用いて、組織学的解析と共登録させることで、治療および診断用ナノ材料投与の結果として生じる生体内分布、脳化学および細胞形態への影響を示す結果を得ることができます。こんにちは、ネブラスカ大学医療センターのバイオイメージングプログラム責任者のMichael Bosca博士です。この研究は、私の研究室とHoward Gendelman博士の研究室との継続的な共同研究の一環です。共焦点顕微鏡や蛍光ナノ粒子などの一般的に用いられる手法に対する非侵襲的イメージングの主な利点は、一度の検査で脳全体をカバーできること、そして同一動物での縦断的研究が可能であることです。これにより生物学的変動が抑えられ、使用する動物数を減らすことができ、多くの場合、ヒトへの応用に展開することが可能です。この手法は、生体内分布の薬物動態プロファイルや治療有効性など、新しく開発されたナノ粒子の主要な課題を解決するのに役立ちます。堅牢なイメージング手順と組織学的共登録の組み合わせはユニークであり、疾患の複雑な動物モデルにおいて時間分解生体内分布および薬効研究を実施するために不可欠です。これらの手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるLindseyとMelissa、および博士研究員のDr.Pです。彼女たちは研究室における動物からのイメージングデータの取得を担当しています。AaronとMarianoは、拡散テンソル画像法および組織学的共登録を含む画像処理を担当しています。こんにちは、私はネブラスカ大学医療センターのCarol Schwartz Emerging Neuroscience Laboratoryの責任者を務めているHoward Delman博士です。Basca博士およびその研究室とのこの学際的な共同研究は、さまざまな神経変性疾患の治療および診断に広範な影響を及ぼします。疾患中のニューロンおよび神経突起の損傷をモニタリングするために、磁気共鳴スペクトロスコピーおよび拡散テンソル画像における異常が利用されています。本プロジェクトでは、全身への薬剤分布や神経系に対する治療効果など、ナノ医薬品の生体内分布効率に関する手法を検討しています。疾患時の細胞分布の検出能を向上させるため、粒子サイズ、コーティング、および電荷の変更を含む、さまざまな粒子作製技術の開発が進められています。これらはすべて、当研究室における継続的な研究領域となります。まず、薬剤送達および生体内分布のためのナノ材料を調製する必要があります。これは本号の別の論文で取り上げています。まず、適切な界面活性剤でコーティングする前に、薬剤コアまたは液滴を同サイズの粒子または粉砕した超常磁性酸化鉄に置換し、in vivoで使用するための候補ナノ製剤を再現してください。次に、サイズ、電荷、形状、および細胞毒性を測定し、SPIOモデルシステムが候補ナノ製剤薬と同じ特性を持っているかを確認します。最後に、細胞への負荷アッセイを行い、候補SPIOモデルナノ製剤と共にインキュベートして、細胞内の活性を判定します。細胞内へのSPIO取り込みによる活性を定量化するため、標識細胞をアガロースゲルに懸濁させたファントムを、一連の濃度で3連（triplicate）で調製してください。これにより感度の指標が得られ、ナノ製剤が酸化状態、ひいては磁気共鳴画像法（MRI）スキャンにおけるSPIOの視認性に影響を及ぼすかどうかを判定できます。スキャン前に、麻酔ガスを充填した麻酔チャンバーに動物を入れます。これにより、麻酔の導入を早め、チャンバーから出した後に動物が覚醒しないようにするために必要な時間を最小限に抑えることができます。完全に麻酔がかかったら、動物をチャンバーから取り出し、呼吸数と体温をモニタリングできる装置を備えた定位固定ホルダーに設置します。動物の頭部をヘッドホルダーに固定し、イヤーバーを締め、体にガーゼでテープを貼ります。動物ホルダーには調整可能なトゥースバーが装備されており、頭部の垂直方向および水平方向の調整が可能です。頭部が吻側方向へ正しく配置され、回転していないことを確認してください。また、動物ホルダーの回転を妨げないよう、表面コイルが頭部に適切に配置されているかを確認してください。磁石内では、個体間で生じうるわずかな回転に対する補正が行われます。動物をホルダーに固定したら、ホルダーをMRIスキャナーに入れます。次に、表面コイルを装着したホルダーをスキャナーの中心まで移動させます。RFエネルギーを伝送して信号を生成するためにアクティブデカップリング処理を施した72 mmレゾネーターを使用し、信号受信にはヘッドコイルを使用します。次に、吻側方向へのリアルタイム1次元読み出しを用いて初期位置を決定します。表面コイルで受信することで、信号を表面コイル周辺の領域に限定できるため、観察される波形の解釈の手間を軽減できます。次に、3面局在化像（ローカライザー）を撮像し、スキャナー内における動物の正確な位置を特定します。続いて、磁場均一性を高めるためのシミングまたは調整が必要です。これを行うため、Dr.Hobie Heatheringtonによって開発されたマルチグラジエントエコーシーケンスおよびマッピングソフトウェアを使用し、各撮像法で検査する領域に合わせて均一領域を一致させます。シミングが完了したら、目的のスキャンを取得できます。SPIO含有ナノ粒子の生体内分布は、高解像度のT2*強調MRIにおける信号消失領域として検出可能です。まず、動物への投与前に、LOCALIZERスキャンからスキャンする脳領域を決定します。次に、150 µmの等方性解像度を持つ高解像度3Dグラジエント回帰エコーシーケンスを設定します。ベースラインスキャンを取得した後、動物に注入を行い、再度同じシーケンスを取得します。ナノ医薬品の治療有効性を決定するための並行研究は、拡散テンソル画像および水素磁気共鳴分光法検査を用いて実施することが可能です。まず、Sスカウト画像を取得し、スキャン対象領域のシム調整を行います。次に、呼吸ゲート付きスピンエコー拡散強調エコープラナーイメージングシーケンスを用いて、DTIデータを取得します。拡散エンコーディングには、背景拡散勾配カップリングを低減するように設計された、12方向のバランス回転変異・交互極性ISO cathedralスキームを使用しました。総撮像時間は呼吸数に応じて20〜40分でした。次に、Mr.Spectroscopyによるデータ取得を行います。以前に取得した画像上で関心領域（ROI）を特定し、選択した領域に対してシミングを実施した後、水抑制パルスの出力を最適化します。水信号が共鳴していることを確認するために水周波数を測定し、スペクトルの品質が不十分な場合には、品質管理のために短いテストスペクトルを取得してください。無線周波数、出力、およびシム設定を含むシステム設定を確認します。最後に、磁場ドリフトの影響を排除するため、測定ごとにシステム周波数をリセットしながら、短いブロックでスペクトルを収集します。収集の終了時に。単一パルスの水スペクトルを定義済みのプリアンプゲインとして使用し、定量的信号振幅の参照とします。一連の最後のMRIスキャン後、マウスを灌流し、脳を取り出して、インク一滴で黒色化したOCTコンパウンドのブロックに埋め込みます。その後、このブロックをクライオスタットに設置し、スライス作成および組織学的解析を行います。クライオスタットの前面に取り付けられたデジタルカメラを使用して、ブロック面の画像を撮影します。脳の全容積にわたって 50 µm ごとに画像を撮影し、容積内でのレジストレーションを可能にするスライスを作成します。組織学的処理および染色後、個々のブロック面スライスを整列させ、3D容積を再構築します。ブロックの輪郭を使用してクライオスタットヘッドの位置のジッターを補正し、次に解析ソフトウェアパッケージ内のシードベース領域成長アルゴリズムを用いて脳容積を自動的にセグメント化します。超常磁性酸化鉄はT2*強調MRIにおいて信号消失を引き起こすため、MRIの信号欠損はその存在を示す感度は高いものの特異性の低いマーカーとなります。脳内におけるSPIOの存在に対して感度と特異性の両方を提供するために。本研究では、造影剤注入前後の3D MRIスキャンから差分画像を作成する必要があります。スキャンデータは、当研究室で開発された制約付きレベルセット法を用いてサブイメージングされました。その後、サブイメージングされた脳体積の共登録および信号強度の正規化を行い、体積差分を算出することで、脳内の信号消失領域を検出しました。この際、サブピクセル登録誤差による偽陽性信号を排除するため、エッジ部分は除外しました。次に、ブロックフェイス画像を共通のリファレンスとして用いることで、組織学像とMRIの共登録（co-registration）を行います。これら2つの信号を正確にコロカライズさせることで、共登録および組織学像を元のスライス形状へと戻すワーピングの精度を評価できます。DTIスキャンでは、まず解剖学的な関心領域（ROI）を選択し、特定の解剖学的亜構造における組織の平均拡散特性を決定することで解析が可能です。我々の研究では、Cada Hassan博士より提供されたInteractive Data Languageで記述されたカスタムプログラムを用いて、拡散強調データの解析を行います。これらの解析により、テンソル拡散率、平均拡散率、および分数異方性のマップが作成されます。また、これらのマップが構築された後、拡散テンソルの横方向および縦方向の成分を得ることも可能です。カラーコード化された方向性マップを重ね合わせたT2強調MRI上に、関心領域（ROI）を描画します。ここでは、HIVマウスモデルの解析において我々の実験で選択した領域の例を示しています。各関心領域からのデータはテキストファイルとしてダウンロードされ、後ほどデータベースに入力されます。当研究室における、単一スペクトルからのMRSカーブフィッティング結果の例をここに示します。信号処理パッケージであるJ-M-R-U-Iに含まれる、Questと呼ばれる時間領域フィッティング法を用いています。Questは、個々の代謝物スペクトルの線形結合を用いてスペクトルフィッティングを行い、刺激スペクトルと実際のスペクトルの間で最小二乗法による最小化を実施します。ここでは、寄与因子となり得る22種類の個々の代謝物からなる基底セットを使用します。基底スペクトルは、個々の代謝物の溶液スペクトルを用いてシミュレーションおよび検証されています。これらの手法を用いたSPIOラベル化マクロファージの生体内分布の例をここに示します。MRIで検出されたラベル化細胞の位置を赤色、共登録した組織学的に検出されたラベル化細胞の位置を青色、およびそれらが重なる部分を黄色でオーバーレイ表示しています。マウスの尾静脈にラベル化された単球由来マクロファージを注入しました。5日後、T2*強調MRIを撮像し、上述の通りに処理しました。HIV感染ヒトマクロファージを脳内に注入してマウスを調製しました。これは、検出されたマウス単球由来マクロファージの列として観察されます。ラベル化細胞の検出および組織学的な共登録のさらなる例については、我々の過去の論文をご参照ください。粒子の製造者による、実験室モデルシステムにおける細胞取り込みなどの生物学的特性の検証が必要であり、これらの動物実験に使用するためには、無菌的な手順の下で実施される必要があります。細胞含有フォーミュレーションの注入は、静脈へのアクセスを損なうことなく行う必要があります。さもなければ、脳およびその他の組織領域への影響が出るためです。バイオイメージング技術を用いて細胞生物学的製剤の統合を可視化したこと、および強力な共同研究体制があったことが、プロジェクト全体の成功に不可欠であったことが証明されました。習得後であれば、手順の完了に要する時間は2時間ですが、これは処置の実施中にポジショニングの設定およびシステムの校正を行うための熟練した人員が確保できていることが条件となります。免疫不全の脆弱なマウスを、数ヶ月に及ぶこともある連続的な研究期間中、生存させ続けるために、無菌状態を維持することが極めて重要です。これらの手法は、組織学を用いて可視化された細胞の変化と、検出された形態学的、生理学的、および生化学的な異常との関係を研究者がどのように探究できるかという基盤を築きました。脳の共登録において組織学に神経画像法を用いることは困難であり、これまで少数のグループによってのみ達成されています。このビデオを視聴した後は、疾患のげっ歯類モデルにおいて、脳イメージング実験がどのように実施され、組織学的な解析とどのように共登録（コアジストレーション）されるかを理解する必要があります。この手法は、超常磁性酸化鉄粒子の生体内分布の測定に利用できます。あるいは、MRIおよび局所的なMR分光法を用いて、疾患プロセス中に見られる神経変性を追跡することも可能です。これにより、脳損傷を改善させる治療効果を連続的に評価することが可能になります。実験結果を検証するために、イメージングと組織学的な解析を併用することができます。総合的に見て、これらの手法は、ナノ粒子の生体内分布および治療有効性に関する動的かつ精密な一連の指標を提供するものです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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