Name: マウスの尾からのゲノムDNAの単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶマウスの尾生検によるゲノムDNA単離法。10日齢の仔マウスから約3ミリメートルの尾を採取し、個体識別と汚染防止の技術を含む完全なプロトコルを解説します。

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<ol style="margin-top: 0in"><li>テールピース（3mm）及びマークの耳をカット。 </li><li> 720 メートルリットルSTEおよび30 M LプロテイナーゼK（10 mg / mlストック）を追加します。 </li><li> 55℃でインキュベート加熱ブロックとボルテックス10秒最高速度で3時間毎正時C。 </li><li> ℃で5分間70℃プロテイナーゼKを不活性化する。 </li><li>氷上で5分間急冷する。 </li><li>フルスピードで10分間尾DNAを遠心します。 </li><li> 720 メートルリットルイソプロパノールを含む新しいチューブにデカント。 &nbsp; </li><li>チューブを反転させたり、ボルテックスでDNAを沈殿させる。 </li><li>フルスピードで5分間、DNAをスピンダウン。 上清を取り除く。 </li><li> 70％エタノールでペレットを洗浄します。 </li><li>フルスピードでゲノムDNA 5分間スピンダウン。 上清を取り除く。 </li><li> DNAは1〜2分間乾燥することができます。 </li><li>ペレットのサイズに応じて100〜200 メートルのlで再懸濁し、DNA。 </li><li> 55位のチューブ℃で1時間DNAの溶解を容易にする。 &nbsp; </li></ol>

<table><tbody><tr><td>STE</td><td>バッファー</td><td></td><td></td><td>100 mm Tris; pH 8.5 /5 mM EDTA /0.2% SDS /200 mM NaCl / in H2O</td></tr><tr><td>TE</td><td>バッファー</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris; pH 5.0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

マウスの尾からのゲノムdnaの単離

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

マウスの尾からのゲノムDNAの単離

こちらは生後10日のマウスの幼獣で、尾部の生検を行い、その後、尾部からゲノムDNAを抽出します。まず、尾部を約3 mmほど切り取り、その断片をエッペンドルフチューブに入れ、ドライアイス上に置きます。また、マウス間のコンタミネーションを防ぐため、通常はカミソリの刃の最後に切断した箇所に印を付けています。このように、次のマウスの尾部生検を行う際は、必ず新しいカミソリの刃を使用するようにします。同じリター内の個々のマウスを区別するためには、マウスを識別する方法が必要です。その一つの方法として、ここに示すイヤーパンチを用いて、耳に穴を開ける方法があります。このように、マウスの項皮をそっと掴んで仰向けにし、指で尾を挟んで固定します。もう一方の手で耳穴穿刺器を持ち、マウスの耳のその部分を素早く切り取ります。痛みがほとんどなかったことがわかりますか？さて、これらのエッペンドルフチューブに尾の断片が入っているのがわかります。ここに、消化を促進するための溶液を加えます。まず、720 µLのSTE溶液を加え、次に30 µLのプロテアーゼKを加えます。ここでは、消化前に切断した尾の断片を確認します。次に、尾部組織を55 °Cのヒーティングブロックに置きます。多くのプロトコルでは55 °Cで連続的にロッキングすることを推奨していますが、今回は尾部組織をボルテックスするため、その必要はありません。ここで、尾部組織を2秒間ボルテックスします。1、2。ボルテックス処理後、エッペンチューブの中を確認すると、尾部の断片が完全に溶解していることがわかります。続いて、70 °Cで5分間加熱し、プロテアーゼKを活性化させます。その後、氷上で5分間冷却して反応を停止させます。マイクロ遠心機を用いて、テイルピースを最大速度で10分間遠心分離します。このマイクロ遠心機における最大速度は13,000 RPMです。消化済みのテイルを遠心分離している間に、いくつかのエッペンドルフチューブにラベルを貼り、750 µLのイソプロパノールを満たします。消化した尾部組織を遠心分離すると、毛や未消化物がチューブの底にペレットとして形成されるため、上澄み液をデカンテーションで除きます。消化物質、STE、およびproteinase Kを含む溶液をイソプロパノールが入ったエッペンドルフチューブに移すと、DNAが溶液から析出し始め、幽霊や羽のような外観になります。この気泡の周囲に漂っているのが、マウスの尾から単離されたゲノムDNAです。イソプロパノールとSTE溶液を混合すると、ゲノムDNAが析出してこのように小さな塊として現れます。沈殿したゲノムDNAをマイクロ遠心機を用い、最大回転数で5分間遠心分離します。チューブの底に、ペレット状になったゲノムDNAが確認できます。ここで、チューブ内の溶液を吸引し、ゲノムDNAのペレットだけを残します。別のチューブを吸引するたびに、チップを交換します。このアスピレーターのチップにピペットチップを装着します。STEおよびイソプロパノールを吸引除去した後、ゲノムDNAペレットを洗浄するために70% ethanolを1 mL加えます。ゲノムDNAのペレットは通常、マイクロ遠心チューブの壁面に付着し、70% ethanolで十分に洗浄するために剥がすことが困難であるため、ここにあるマイクロ遠心チューブラックにチューブをこすりつける必要があります。次のように行います。ここでは、ペレット化し70% ethanolで洗浄した後のゲノムDNAを示しています。これを再び最大速度で5分間遠心分離し、その後70% ethanolを吸引して、洗浄後のゲノムDNAペレットを回収します。70% ethanolを用いて最大速度で5分間遠心分離し、70% ethanolを吸引除去した後、DNAを5分間乾燥させます。チューブの底にあるゲノムDNAペレットを確認してください。これで十分な乾燥状態になります。マウスの尾から抽出したゲノムDNAペレットを乾燥させたので、ここにpH 8の40 mM Trisを100 µL加えます。ゲノムDNAを50 °Cで保持します。これにより、室温で保存するよりも迅速に溶解します。50 °Cで約1時間ほど置いた後、冷凍保存するか、あるいは4 °Cで保存し、トランスジーン陽性のマウスを特定するためのPCR反応を行うまで保持します。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

組織の消化とPCRの読み出しを含むマウスの尾のサンプルの完全な遺伝子型は、、1とシグマのSYBRグリーンエキス- N -...

シグマのエキス- N - Ampの組織PCRキットを使用してマウス組織の急速なジェノタイピング

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初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

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マウスの耳としっぽの組織から生成初代線維芽細胞培養

マウス卵母細胞のマイクロインジェクションは、古典的なトランスジェネシス（ すなわち、トランスジーンのランダム組込み）およびCRISPR媒介遺伝子ターゲティングの両方に一般的に使用される。このプロトコールは、マイクロインジェクションの最新動向をレビューし、特に品質管理とジェノタイピング戦略を重視しています。...

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

トランスジェニックげっ歯類の培養細胞でラムダを選択cII突然変異試験または興味の化学/物理エージェントで治療対応する動物のための詳しいプロトコルについて述べる。このアプローチは、哺乳類細胞における発がん性物質の変異原性試験のため広く使用されています。...

ラムダを選択cII変異検出システム

ここでは、急速に下流の並列 RNA 配列のため新鮮なまたは冷凍組織から高品質の核を分離するためのプロトコルを提案する.我々...

並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離

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簡単で費用対効果の高いDNA単離法を用いたループス発生マウスの糞便微生物叢動態の解析(英語)

私たちは、遺伝子改変マウスモデルで発生した腫瘍の治療標的と対応するヒト腫瘍の種類を同定および比較するために、ゲノム解析と機能的ゲノムスクリーニングを利用した種間比較腫瘍ゲノミクスアプローチを開発しました。...

悪性末梢神経鞘腫瘍のマウスモデルにおける治療標的を特定するための遺伝子プロファイリングおよびゲノムスケールドロップアウトスクリーニング

学ぶマウスの尾生検によるゲノムDNA単離法。10日齢の仔マウスから約3ミリメートルの尾を採取し、個体識別と汚染防止の技術を含む完全なプロトコルを解説します。

マウスの尾からのゲノムDNAの単離

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