マウスの尾からのゲノムDNAの単離
2007年7月29日
こちらは生後10日のマウスの幼獣で、尾部の生検を行い、その後、尾部からゲノムDNAを抽出します。まず、尾部を約3 mmほど切り取り、その断片をエッペンドルフチューブに入れ、ドライアイス上に置きます。また、マウス間のコンタミネーションを防ぐため、通常はカミソリの刃の最後に切断した箇所に印を付けています。
このように、次のマウスの尾部生検を行う際は、必ず新しいカミソリの刃を使用するようにします。同じリター内の個々のマウスを区別するためには、マウスを識別する方法が必要です。その一つの方法として、ここに示すイヤーパンチを用いて、耳に穴を開ける方法があります。
このように、マウスの項皮をそっと掴んで仰向けにし、指で尾を挟んで固定します。もう一方の手で耳穴穿刺器を持ち、マウスの耳のその部分を素早く切り取ります。痛みがほとんどなかったことがわかりますか？
さて、これらのエッペンドルフチューブに尾の断片が入っているのがわかります。ここに、消化を促進するための溶液を加えます。まず、720 µLのSTE溶液を加え、次に30 µLのプロテアーゼKを加えます。ここでは、消化前に切断した尾の断片を確認します。
次に、尾部組織を55 °Cのヒーティングブロックに置きます。多くのプロトコルでは55 °Cで連続的にロッキングすることを推奨していますが、今回は尾部組織をボルテックスするため、その必要はありません。ここで、尾部組織を2秒間ボルテックスします。
1、2。ボルテックス処理後、エッペンチューブの中を確認すると、尾部の断片が完全に溶解していることがわかります。続いて、70 °Cで5分間加熱し、プロテアーゼKを活性化させます。その後、氷上で5分間冷却して反応を停止させます。
マイクロ遠心機を用いて、テイルピースを最大速度で10分間遠心分離します。このマイクロ遠心機における最大速度は13,000 RPMです。消化済みのテイルを遠心分離している間に、いくつかのエッペンドルフチューブにラベルを貼り、750 µLのイソプロパノールを満たします。
消化した尾部組織を遠心分離すると、毛や未消化物がチューブの底にペレットとして形成されるため、上澄み液をデカンテーションで除きます。消化物質、STE、およびproteinase Kを含む溶液をイソプロパノールが入ったエッペンドルフチューブに移すと、DNAが溶液から析出し始め、幽霊や羽のような外観になります。この気泡の周囲に漂っているのが、マウスの尾から単離されたゲノムDNAです。イソプロパノールとSTE溶液を混合すると、ゲノムDNAが析出してこのように小さな塊として現れます。沈殿したゲノムDNAをマイクロ遠心機を用い、最大回転数で5分間遠心分離します。
チューブの底に、ペレット状になったゲノムDNAが確認できます。ここで、チューブ内の溶液を吸引し、ゲノムDNAのペレットだけを残します。別のチューブを吸引するたびに、チップを交換します。
このアスピレーターのチップにピペットチップを装着します。STEおよびイソプロパノールを吸引除去した後、ゲノムDNAペレットを洗浄するために70% ethanolを1 mL加えます。ゲノムDNAのペレットは通常、マイクロ遠心チューブの壁面に付着し、70% ethanolで十分に洗浄するために剥がすことが困難であるため、ここにあるマイクロ遠心チューブラックにチューブをこすりつける必要があります。
次のように行います。ここでは、ペレット化し70% ethanolで洗浄した後のゲノムDNAを示しています。これを再び最大速度で5分間遠心分離し、その後70% ethanolを吸引して、洗浄後のゲノムDNAペレットを回収します。
70% ethanolを用いて最大速度で5分間遠心分離し、70% ethanolを吸引除去した後、DNAを5分間乾燥させます。チューブの底にあるゲノムDNAペレットを確認してください。これで十分な乾燥状態になります。マウスの尾から抽出したゲノムDNAペレットを乾燥させたので、ここにpH 8の40 mM Trisを100 µL加えます。
ゲノムDNAを50 °Cで保持します。これにより、室温で保存するよりも迅速に溶解します。50 °Cで約1時間ほど置いた後、冷凍保存するか、あるいは4 °Cで保存し、トランスジーン陽性のマウスを特定するためのPCR反応を行うまで保持します。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本記事では、ゲノムDNAを抽出するために、生後10日のマウスパピーから尾部生検を行う手順について説明します。ここでは、コンタミネーションの回避と個体識別を徹底することの重要性を強調しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- ゲノムDNA抽出
- マウス遺伝学
- 生検技術
背景
- 尾切生検は、マウスから遺伝物質を採取するための一般的な手法です。
- サンプル間のコンタミネーションを防ぐには、適切な技術が不可欠です。
- 遺伝データの追跡には、個々のマウスの識別が極めて重要です。
- サンプルごとに清潔な器具を使用することで、クロスコンタミネーションを最小限に抑えることができます。
研究目的
- マウスの幼若個体における尾端生検の手順を実演する。
- ゲノムDNA抽出におけるベストプラクティスを強調する。
- 1腹の個々のマウスを識別するための方法を提示する。
使用方法
- 尾の一部（約3 mm）を切り取る。
- 切り取った尾のサンプルをエッペンドルフチューブに入れ、ドライアイス上に置く。
- 次回の生検に向けて清潔さを確保するため、カミソリの刃に印を付ける。
- マウスの個体識別のためにイヤーパンチを使用する。
主な結果
- 尾部生検からのゲノムDNAの抽出に成功すること。
- コンタミネーションを防止するための実証された技術。
- 個々のマウスを識別するための効果的な方法。
- 研究者が遵守すべき明確な手順。
結論
- 尾部生検は、マウスの遺伝子解析における信頼性の高い手法です。
- コンタミネーションを避けるためには、適切な手技が不可欠です。
- 遺伝子サンプルの追跡には、個体識別方法が重要です。
よくある質問
産業界における重要性
マウスの尾部からゲノムDNAを単離することで、初期の探索ワークフローにおける信頼性の高い遺伝学的スクリーニングが可能となり、トランスジェンの検証やコロニー管理を支援します。この手法は、ジェノタイピングのためのスケーラブルで汚染を制御したアプローチを提供し、ダウンストリームアッセイにおける偽陽性を減少させます。これは、サンプルの完全性がデータの信頼性に直接影響を与えるハイスループットのターゲット検証において特に有用です。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：PCRベースのジェノタイピングに不可欠な高純度のゲノムDNAを提供することで、トランスジェニックモデルの解析を可能にする。
- 運用的価値：標準化された尾部生検および抽出プロトコルにより、サンプル間の相互汚染を最小限に抑え、アッセイの再現性を確保する。
- 予測信頼性：信頼性の高いDNA収量により正確なトランスジーン検出がサポートされ、初期段階のターゲットバリデーションにおける偽陰性および偽陽性の判定を低減する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：精製されたゲノムDNAは、スクリーニングキャンペーンにおけるqPCR、エンドポイントPCR、およびジェノタイピングアレイの一貫したテンプレートとして機能します。
- 運用の価値：ドライアイスによる保存と標識付きカミソリ刃の使用により、オペレーターによる変動を最小限に抑えた、リター単位のバッチ処理が可能になります。
- アッセイの準備状況：DNA単離ワークフローにより、実験条件間での標準化および比較に適した、定量可能なアウトプットが得られます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳の連続性： 尾 biopsies から得られたゲノム DNA により、離乳期から前臨床試験への登録に至るまで、トランスジェニック・コロニーの長期的な追跡が可能になります。
- バイオマーカーの整合性： ジェノタイピングデータに基づき、トランスジェンの状態に従って有効性および安全性試験におけるマウスの層別化を行います。
- リスク調整後の推進： ポジティブおよびネガティブなリッタメートを正確に識別することで、表現型スクリーニングにおけるノイズを低減し、統計学的検出力を向上させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期のコロニー管理からリード同定に至るディスカバリー・コンティニュアムに適合するものであり、表現型スクリーニングやメカニズム解析の前段階として不可欠なジェノタイピングのステップを提供します。
- 探索生物学：機能解析の前にトランスジェンの存在を確認することで仮説検証をサポートし、メカニズム上の曖昧さを軽減します。
- スクリーニング：ジェノタイピングアッセイに標準化されたDNA入力を提供し、トランスジェニックモデルにおける拡張可能な化合物スクリーニングを可能にします。
- 分析：下流のアプリケーションに先立つQC判断の根拠となる、測定可能なDNA収量および純度指標を算出します。
- トランスレーショナルリサーチ：正確なモデル割り当てを確保することで、遺伝学的妥当性確認から前臨床試験への継続性を促進します。
- エンタープライズ再利用：本プロトコルはマウス系統やトランスジェニックラインを問わず適応可能であり、複数の探索プログラムにおける再利用をサポートします。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値： 高精度なゲノムDNA抽出により、遺伝型と表現型の相関に対する信頼性が向上します。
- 運用の価値： コンタミネーション管理（ドライアイス保存、ブレードのマーキング）により、ユーザー間およびサイト間での再現性が高まります。
- 戦略的価値： 遺伝型の判定ミスによる動物への資源浪費を削減し、コロニー維持における資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 確認済みの遺伝型に基づいたトランスジェニック系統のリスク調整済み優先順位付けが可能となり、Go/No-go判断をサポートします。
実施上の考慮事項
- 無菌操作および遠心分離に関する基礎的な分子生物学的トレーニングが必要です。
- 試薬操作のためのマイクロ遠心分離機、ヒーティングブロック、ボルテックスミキサー、およびピペットへのアクセスが必要です。
- 一定のDNA収量を得るためには、尾の長さ（3 mm）と溶解条件の標準化が不可欠です。
- 他の組織タイプに適応させる場合は、溶解バッファーとインキュベーション時間の最適化が必要になる場合があります。
- 手作業の工程があるため完全な自動化は困難ですが、リター単位でのバッチ処理を行うことでスループットを向上させることができます。
