マウスの尾からのゲノムDNAの単離

これは生後10日のマウスの子犬で、尾部生検を行い、その後、その尾からゲノムDNAを抽出します。そこで、尾を少し、約3ミリ切り落とし、尾の一部をアイノールチューブに入れ、アイノールチューブをドライアイスの上に置きます。さて、マウスからマウスへの汚染を避けるために、私は通常、最後にカットした部分にカミソリの刃に印を付けます。

そうすれば、次のマウスでは、次の尾生検を受けるためにきれいなカミソリの刃を必ず使います。あなたの同腹仔の異なるマウスを区別するためには、マウスを識別する方法が必要になります。そのための1つの方法は、ここに示されている耳穴あけ器を使用して耳に穴を開けることです。

マウスの首筋をそっとつかむように、裏返して尻尾を指で挟みます。もう一方の手で耳の穴に穴を開け、そこにマウスの耳をすばやく切り取ります。それがどれほど苦痛を伴わなかったかわかりますか?

さて、これで、これらのエイノールチューブに尾の部分がいくつかあることがわかりますので、今度はそれらを消化するのに役立つ溶液を追加します。まず、720マイクロリットルのSTE溶液を追加し、次に30マイクロリットルのタンパク質を追加します。エース K.So 消化前にカットした尻尾の部分を見てみましょう。

次に、テールピースを55度の加熱ブロックに配置します。多くのプロトコルでは、55 度で連続的なモーション ロッキングが必要ですが、私の目的では、テール ピースをボルテックスするため、これは必要ありません。次に、尾の部分を2秒間ボルテックスします。

1，2。ボルテックス後、エイノールチューブ内に何が残っているかを見ると、尾部が完全に溶解し、摂氏70度でプロテイナーゼKが5分間活性化されていることがわかります。氷上で5分間急冷します。

テールピースをマイクロ遠心分離機で全速力で10分間回転させます。このマイクロ遠心分離機では、フルスピードは 13 、 000 RPM です。消化器系の尾が回転している間、一部のアイノアチューブにラベルを付けて、アイノアチューブに750マイクロリットルのイソプロパノールを充填します。

消化された尾を回転させた後、髪の毛と未消化の材料はチューブデカントの底にペレットを形成します。イソプロパノールDNAを含むEINORチューブに消化された物質であるSTEとプロテイナーゼKを含む溶液は、溶液から出始め、幽霊や羽のように見えますが、その泡のすぐそばを泳いでいるのは、マウスの尾から分離されたゲノムDNAです。イソプロパノールとSTE溶液を混合した後、ゲノムDNAが溶液から出て、ここに小さなボールとして現れ、沈殿したゲノムDNAをマイクロ遠心分離機で5分間全速力でスピンダウンします。

チューブの底には、ペレット化されたゲノムDNAが描かれています。次に、チューブ内の溶液を吸引し、ゲノムDNAのペレットだけを残します。別のチューブを吸引するたびに、パイプを交換します。

この吸引器の先端にあるペットのヒント。STEとイソプロパノールを吸引した後、70%エタノールを1ミリリットル加えてゲノムDNAペレットを洗浄します。ゲノムDNAのペレットは通常、マイクロフュージチューブの側面に付着し、70%エタノールで完全に洗浄するために降りるのが難しいため、ここにあるマイクロフュージチューブラックにかき集める必要があります。

あなたはそのようにすることができます。そこで、ペレット化して70%エタノールで洗浄した後のゲノムDNAを見てみましょう。これを再び全速力で5分間スピンダウンし、洗浄後のゲノムDNAペレットから70%エタノールのスピンダウンを吸引します。

彼らの70%エタノールはフルスピードで5分間、70%エタノールを吸引し、DNAを5分間乾燥させます。チューブの底にあるゲノムDNAペレットを見ると、それはあなたがそれを手に入れたいのと同じくらい乾燥しています。そこで、マウスの尾からゲノムDNAのペレットを乾燥させ、次にpH8で100マイクロリットルの40ミリモルトリスを追加します。

つまり、ゲノムDNAは摂氏50度で得られ、室温で加えるよりも早く溶液に入るのです。50度で約1時間ほど経った後、凍結するか、4度に置いて、PCR反応を実行して、どのマウスが私の導入遺伝子に陽性であるかを実際に把握します。