ヒト肝細胞癌細胞からのE型肝炎ウイルス粒子の回収

ウイルス粒子を産生させるため、E型肝炎ウイルス（HEV）RNAを導入したヒト肝がん細胞の培養物を用いて開始します。

一部のHEVは宿主由来のエンドソーム膜を獲得して細胞外へ放出されますが、 l他は非エンベロープHEVとして細胞内に留まります。

細胞外HEVを回収するには、培養上清を収集し、フィルターろ過して細胞デブリを除去します。

感染性を維持するため、超低温で保存してください。

細胞内HEVを回収するために、バッファーで細胞を洗浄します。

細胞を剥離させるためにtrypsin-EDTAを加え、その後、酵素活性を停止させるために培地を加えます。

懸濁液をチューブに移し、遠心分離します。

残留トリプシンを含む上清を廃棄します。ペレットを再懸濁し、チューブに移します。

細胞を液体窒素で凍結し、氷上で融解させます。

凍結融解サイクルを繰り返し、細胞を溶解させてウイルスを放出させます。

遠心分離を行い、ウイルスを含む上清を回収し、超低温で保存する。

6日目に、上清を0.45 µmのフィルターでろ過して細胞残 debris を除去し、回収した細胞培養由来の細胞外E型肝炎ウイルスを4 °Cで保存します。細胞培養由来の細胞内E型肝炎ウイルス粒子の回収には、細胞をPBSで洗浄し、37 °Cで0.05%トリプシン-EDTA 1.5 mLを用いて細胞を剥離させます。細胞が剥離したら、DMEM 8.5 mLを加えて反応を停止させ、細胞懸濁液を遠心分離用の50 mLチューブに移します。

エレクトロポレーション1回につき1.6 millilitersのDMEM完全培地を個々の2 milliliter反応チューブに加え、そのうち80 microlitersを用いて細胞を再懸濁させ、細胞をチューブに移します。細胞を液体窒素で凍結し、その後、氷上で3回凍結融解を繰り返した後、得られた溶解物を10,0 times gで10分間高速遠心分離します。次いで、細胞デブリのペレットを乱さないように上清を新しいチューブに移し、-80 degrees Celsiusで保存します。