器官型海馬切片培養

本手順の全体的な目的は、海馬のオルガノタイプ切片を培養することです。まず、海馬を摘出します。次に、摘出した海馬を薄切します。

手順の第3ステップは、海馬スライスの分離および選別です。手順の最終ステップは、海馬スライスの培養です。最終的に、解剖顕微鏡または顕微鏡による可視化を通じて、健全な有機的海馬スライスが得られます。

こんにちは、私はワシントン大学のAndres bar博士の研究室で研究員を務めているJimena Opitzです。シアトルにて、海馬のオルガノタイピック切片培養の手順を実演します。一般的に、この手法に慣れていない方は、海馬を迅速に解剖・切片化する必要があること、および汚染を防ぐために滅菌した解剖溶液と切片培養を用いる必要があることから、困難に直面することがあります。

培地は書面によるプロトコルに従い、最大3週間前までに調製し、4°Cで保存することができます。海馬スライスを作成する前に、培養準備を行うことができます。組織培養フードおよび解剖に使用する器具の両方を適切に滅菌させることが不可欠です。

まず、組織培養フードの内面を70% ethanolで拭きます。次に、解剖顕微鏡とすべての解剖器具をフード内に配置します。ステージの上に清潔なテフロンシートを敷き、新しいブレードを装着して組織スライサーを準備します。

組織スライサーを組織培養フード内に設置し、UVライトを用いてすべての表面と器具を15分間滅菌します。UV滅菌プロセスが完了した後、ライトを消灯します。以降の操作は組織培養フード内で行います。

まず、海馬スライスを培養するために使用する6ウェル組織培養プレートを準備します。6ウェルプレートの各ウェルにSEMを750 µLずつピペットで分注します。次に、滅菌済みのピンセットを使用して、組織培養プレートの各ウェルにセルカルチャーインサートを配置します。

インサートの下に気泡が溜まらないように注意してください。各細胞培養インサートのメンブレンがスライス培養培液で濡れていることが重要です。メンブレンが乾いている場合は、気泡がないか確認してください。

メンブレンがSCMの液面に接していない場合は、ウェルに培地を追加してください。準備した培養プレートを組織培養インキュベーターに入れます。必要になるまで、35 °C、5% carbon dioxideに設定して保存します。

最後に、氷と塩の混合物を氷バケツに入れ、フード内の斬首作業エリアの隣に配置します。100 milliliterのビーカーに解剖液を満たします。ビーカーを氷塩混合物の中に押し込み、5%carbon dioxideと95%oxygenで10～20分間、溶液の色がピンクからオレンジに変わるまでバブリングします。

そして、解剖溶液が凍結状態と液体状態の混在したスラリー状になります。これで、解剖環境と組織培養プレートの解剖準備が整いました。P3からP7までラップします。

この手順では、幼鼠を使用します。スライス培養では、一度に最大3匹までの幼鼠から調製が可能です。ここでは、1匹の幼鼠を用いた手順を説明します。

斬首した蛹から脳を迅速に採取し、解剖溶液Slurry Chillを入れた100 milliliterビーカーに1分間浸します。その間に、60 millimeter組織培養皿の底に氷冷した解剖溶液を約10 milliliters加え、解剖皿を準備します。丸いスプーンまたはマイクロスパチュラを使用して、脳を100 milliliterビーカーから冷たい解剖用培地を満たした60 millimeter皿に移します。脳が解剖溶液に完全に浸っていることを確認してください。

脳を入れたディッシュを解剖顕微鏡の下に置きます。解剖顕微鏡をのぞき、脳の位置を確認してください。滅菌済みの解剖用ピンセットを使用して、脳を視野の中心に移動させます。

解剖用ピンセットで脳を正中線で保持し、ディッシュの底に押し付けます。海馬解剖用ツールを使用して、中脳をそのまま残しながら、大脳皮質の半球を中脳から慎重に剥離させます。理想的には、皮質半球を脳の他の部分から完全に切り離すことなく剥離させることで、海馬が露出します。次に海馬解剖用ツールを用い、片側の半球から海馬をすくい出します。

次に、解剖針を用いて、海馬以外の組織を可能な限り取り除きます。1つ目の海馬の単離と洗浄が完了したら、もう一方の半球の2つ目の海馬に対しても同様の手順を繰り返します。次に、滅菌済みの鋏を使用して、P 1000 フィルターピペットチップの先端を切り取ります。

滅菌済みのP 1000ピペットにピペットチップを取り付けます。海馬1つを穏やかに吸引し、組織スライサー上のテフロンシート上に滴下します。同様に、2つ目の海馬もスライサー上に配置します。

海馬の半分を凹面を下にして配置し、ブレードに対して垂直に合わせ、テフロンシート上の過剰な液体を吸引して除去します。ビブラトームまたはミクロトームをゼロ位置に設定します。海馬を400 µmの厚さでスライスします。

別の切断した P 1000 フィルターチップを用意し、滅菌済みの P 1000 ピペットに取り付けます。約 10 milliliters の冷えた SCM を 60 millimeter の滅菌済み組織培養皿に注ぎます。ピペットを使用して少量の培地を加え、海馬スライスをスライサーから培養皿に移します。

すべてのスライスの移送操作を繰り返した後、気泡が入らないように注意しながら、ディッシュを解剖顕微鏡の下に配置します。最後に、アイリススパチュラとストレートスパチュラを用いて、スライスを互いにゆっくりと分離させます。

輪郭が明瞭で損傷のないスライスを、損傷のあるスライスから分離します。これで、輪郭が明瞭な海馬スライスの培養準備が整いました。SCMおよび細胞培養インサートを入れた、あらかじめ準備しておいた6ウェル組織培養プレートをインキュベーターから取り出します。先端をカットして広げたチップを装着したP 1000を用い、各メンブレンに4〜5枚の個別のスライスを移します。

必要に応じて、アイリススパチュラを使用してスライスを分離してください。スライスをインサートの壁に近づけすぎたり、互いに近接させたりしないように注意してください。スライスに触れないように注意しながら、細胞培養の上表面から過剰な培地を吸引してください。

メンブレンを挿入します。最後に、海馬スライス培養を含むプレートを組織培養インキュベーターに戻します。設定は35°C、5% carbon dioxideとします。

48時間後、組織培養フード内でプレートをインキュベーターから取り出します。パスツールピペットで培地を吸引し、あらかじめ加温した新鮮なSCMを1ウェルあたり750 µL加えます。

繰り返しになりますが、セルカルチャーインサートのメンブレンの下に気泡が生じていないことを確認してください。これは、培養準備が整った健全な海馬スライスの例です。海馬の領域であるCA1、CA3、および歯状回が、損傷なく鮮明に確認できます。

ここでは、培養に使用しなかった損傷した海馬スライスを示しています。最後に、4日間の培養後の健全な海馬スライスの例を示します。解剖顕微鏡下でスライスが白く見え、スライスの表面がきれいであることに注目してください。

海馬の領域であるCA1、CA3、および歯状回が、損傷なく鮮明に確認できます。一度習得すれば、適切に実施することでこの手法は約1時間で完了させることができます。

この手順を行う際は、適切な滅菌操作を行い、組織を慎重に取り扱うことが非常に重要です。このビデオを視聴することで、海馬のオルガノタイプ培養およびライシス（細胞溶解）の方法について十分に理解できるはずです。

ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。