Name: 器官型海馬切片培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学ぶ器官型海馬切片培養法。海馬の解剖、切片、分離、培養の手順を習得し、2週間の組織構造保持とシナプス結合の維持を実現する神経科学研究の基盤技術です。

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この作品は、NINDSによって賄われていた - NIH R01NS060756を

1。海馬スライスの準備を開始する前に。 <ol><li>テフロンシートの部分を置き、新​​しいブレードを取り付けることで、組織スライサーを準備します。 </li><li> 70％エタノールで組織培養（TC）フードを拭き、解剖顕微鏡の内部に設定してください。フード、顕微鏡、組織スライサーおよびUV光で15分間すべての解剖器具を滅菌する。 </li><li>シックスウェルTCプレートを準備します。各ウェルに750μLのスライス培養培地（SCM）ウェルあたりと場所​​細胞培養インサートを追加。膜が下にない泡で十分に濡れていることを確認してください。 35℃インキュベーターでプレートを置きます°必要になるまで、5％CO 2でガス処刑。 </li><li> 100mLのビーカーに50mLの低Na +の ACSFを（解決策を解剖）注ぎ、氷塩ミックスの上に置きます。色の変化とACSFが凍結し、液体溶液（10〜20分）のスラリーの混合を形成するまで5％CO 2 / 95％O 2とバブル低Na +の ACSF。 </li><li> P5 - P7のラットは、子犬得る。最大3つの仔を使用することができます。 </li></ol> 2。海馬スライスの準備。 <ol><li>シャープのユーティリティはさみで動物の頭をカット。皮膚をカットし、頭蓋骨を公開。両耳間のラインに沿って、その後、小さなはさみで矢状縫合に沿って左右にカットして頭蓋骨を開きます。フロントの左右にオプションのカットは、骨と脳の露出を除去する容易にするために行うことができます。丸いスプーンミクロスパチュラで迅速に脳をかき出すと、約1分間冷却する為のソリューションを解剖のスラリーに入れてください。 〜60mmの皿に氷冷解剖溶液10 mLを入れ、ビーカーから皿に脳を転送する。脳は、解剖ソリューションでカバーされるべきである。 </li><li>解剖顕微鏡の下：脳を置き、60mmの皿の底に押さ解剖ピンセットで正中線でそれを保持する。中脳を残して半球を分けるために海馬解剖ツールを使用してください。海馬は、それぞれの半球で公開されています。その後そっとツールを解剖海馬と海馬をかき出す。完全に海馬を分離し、可能な限りそれをきれいに解剖針を使用してください。 </li><li> P1000フィルターピペットチップのsnipped先端を使用して、ゆっくりと海馬を吸引除去し、組織のスライサーにテフロンシートに転送します。その凹面側の海馬を置きます。 </li><li>冠状のセクションを取得し、液体の過剰を排出するためにブレードに海馬の垂直位置を合わせます。 </li><li>海馬は、400μmのスライス。 </li><li>別のsnipped P1000フィルターチップとコールドSCMを使用してスライサーから海馬をスライスした60mmディッシュと転送に約10 mLの冷SCMを注ぐ。泡を作ることは避けてください。 </li><li>アイリスのヘラとストレートヘラの助けを借りてそっとお互いのスライスを切り離す。 </li><li>明確に定義し、破損していないスライスは、破損したスライスから区切ります。 </li></ol> 3。海馬スライスの文化<ol><li>インキュベーターからSCMや細胞培養インサートで6 - ウェルプレートを持参。別のsnipped P1000フィルターチップの助けを借りて、メンブレンに個々のスライスを転送する。膜4〜5のスライスを置きます。スライスのいずれかのインサート壁に近づけたり、互いに近くに配置しないように注意してください。必要な場合には、別のスライスにアイリスのヘラを使用してください。余分な培地を取り外します。彼らは細胞膜上に存在したら、できるだけ少ないとしてスライスをタッチ。 </li><li> 35でバックインキュベーターにプレートと文化を移動℃、5％CO 2。 </li><li>パスツールピペットでSCMを吸引することによってTCのフード内SCM、48時間毎に変更する。ウェル当たりの新鮮予め温めておいたSCMを750μLを加える。は気泡が膜の下に形成されていないことを確認してください。 </li></ol> 4。ソリューション<ol><li>ローのNa + ACSF -スライス培養のための解剖ソリューション イオンと滅菌H 2 Oを追加するには： <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 500mLのための </td><td> 1000mLのための </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td>のCaCl 2（1 M） </td><td> 0.5mLの</td><td> 1 mLの</td><td> 1mMの</td></tr><tr><td> D -グルコース</td><td> 0.901グラム</td><td> 1.802グラム</td><td> 10 mMの</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 0.149グラム</td><td> 0.298グラム</td><td> 4mMの</td></tr><tr><td> MgCl 2の （1 M） </td><td> 2.5mLの</td><td> 5 mLの</td><td> 5mMの</td></tr><tr><td> NaHCO 3の </td><td> 1.092グラム</td><td> 2.184グラム</td><td> 26mmの</td></tr><tr><td>スクロース</td><td> 40グラム</td><td> 80グラム</td><td> 234 mMの</td></tr><tr><td> DPBSでフェノールレッド溶液0.5パーセント</td><td> 0.5mLの</td><td> 1 mLの</td><td> 0.1パーセントV / V </td></tr></tbody></table> ミックス〜30分 滅菌0.22μmフィルターを通過させることによってIZE 2ヶ月以上を50mL分注し、4℃で保存されなくてください。 </li><li>スライス培養培地（SCM） <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 500mLのための </td><td> 1000mLのための </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> MEMイーグル培地</td><td> 4.2グラム</td><td> 8.4グラム</td><td> 8.4グラム/リットル</td></tr><tr><td>不活化ウマ血清熱</td><td> 100mLの</td><td> 200 mLの</td><td> 20パーセント</td></tr><tr><td> L -グルタミン（200mMの） </td><td> 2.5mLの</td><td> 5 mLの</td><td> 1mMの</td></tr><tr><td>のCaCl 2（1 M） </td><td> 0.5mLの</td><td> 1 mLの</td><td> 1mMの</td></tr><tr><td> MgSO 4を （1 M） </td><td> 1 mLの</td><td> 2 mLの</td><td> 2mMの</td></tr><tr><td>塩酸0.01 Nに溶解インスリン（1 mg / mL）は、 </td><td> 0.5mLの</td><td> 1 mLの</td><td> 1mg / lの</td></tr><tr><td>アスコルビン酸、溶液（25％w / v）の</td><td> 0.024 mLの</td><td> 0.048 mLの</td><td> 0.00125% </td></tr><tr><td> D -グルコース</td><td> 1.16グラム</td><td> 2.32グラム</td><td> 13 mmの</td></tr><tr><td> NaHCO 3の </td><td> 0.22グラム</td><td> 0.44グラム</td><td> 5.2 mMの</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 3.58グラム</td><td> 7.16グラム</td><td> 30mMの</td></tr></tbody></table> 完全に溶解するまで混合し、室温にもたらす。 1 N NaOHで7.27から7.28にpHを調整する 浸透圧を測定します。脱イオン滅菌H 2 Oで320ミリモル/ kgに調整する約25〜40 mLを追加する予定。再び浸透圧を確認してください。 浸透圧を調整しながら*** pHが若干変更される可能性がある、これはOKです、それは浸透圧が正しい範囲（317〜323）になっていることより重要です。 0.22μmフィルターを通過させることによって滅菌する。 4で二から三週間までに20 mLのアリコートとストアを行います℃に Gluatamineの株式：2.5 mLのアリコートで-20℃で200mmと店舗の濃度で準備する。 アスコルビン酸の株式：25％の濃度（w / v）で準備し、100μLのアリコートで-20℃で保存されている。 </li></ol> 5。代表的な結果： スライスは黒い斑点なし解剖範囲で白く見えるとよく定義されており、無傷のCA1、CA3、および歯状回領域があります。細菌汚染を簡単にSCMの培地や濁度に黒の斑点を移動すると見られている。顕微鏡下に置かれたとき、スライスの表面には、はっきりと目に見えて細胞体と培養中の4日後にきれいになるはずです。明確な細胞体は見られないと多くの破片が4日後に表面を覆っている場合は、健全なスライスではありません。

<ol><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+memory%3A+an+evaluation+of+the+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).</li>
<li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+and+structure+of+the+issue%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation and structure of the issue.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).</li>
<li>Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShepherd%2C+GM+%22The+synaptic+organization+of+the+brain%22">The synaptic organization of the brain</a>. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).</li>
<li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+enhancement+shown+by+whole-cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346, 177-180 (1990).</li>
<li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+green+fluorescent+protein+%28GFP%29+into+hippocampal+neurons+through+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-specific+rules+governing+AMPA+receptor+trafficking+to+synapses+in+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons.</a> Cell. 105, 331-343 (2001).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Esteban, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKA+phosphorylation+of+AMPA+receptor+subunits+controls+synaptic+trafficking+underlying+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity.</a> Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).</li>
<li>Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+in+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging in living brain slices.</a> Methods. 18, 231-239 (1999).</li>
<li>Barria, A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-specific+NMDA+receptor+trafficking+to+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses.</a> Neuron. 35, 345-353 (2002).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices%3A+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> J Physiol. 550, 135-147 (2003).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このメソッドは、 最初のStoppini らの方法に基づいて11および文化海馬スライスへの迅速な方法を提供しています。このプロトコルの最も重要な側面は、スライスが無菌維持することであるため、それは適切な無菌テクニックを使用するために、適切に組織と接触するすべての素材を消毒殺菌することが重要です。 異なる血清源は、スライスの品質に影響を与えることができる。まず、いくつかのバッチをテストすることをお勧めします。汚染が再発問題がある場合は、インキュベーターや汚染源となる可能性のための組織培養フードを確認してください。全体の手順の実行中に無菌テクニックの適切な使用が不可欠です。 断頭から膜上とインキュベーター内のスライスを配置する合計時間は1.5時間を超えるべきではない。手続きに時間がかかりすぎると、それは、スライスの健康が損なわれます。 毛管現象によって形成されているSCMの薄い層を介して多孔質膜の保証適切な酸素と栄養上...

<table><tbody><tr><td>細胞培養用インサート</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>組織スライサー</td><td>Stoelting Co.</td><td>51425/51415</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td>SZX7-ILLD2-100</td><td></td></tr><tr><td>海馬解剖用ツール</td><td>F.S.T.</td><td>10099-15</td><td></td></tr><tr><td>大型ユーティリティシザース (Perfection)</td><td>F.S.T.</td><td>37500-00/37000-00 右手用/ 左手用</td><td></td></tr><tr><td>アイリススパチュラ</td><td>F.S.T.</td><td>10093-13</td><td></td></tr><tr><td>ストレートスパチュラ</td><td>F.S.T.</td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>丸匙マイクロスパチュラ</td><td>VWR international</td><td>57949-039</td><td></td></tr><tr><td>解剖用単刃切断針</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72946</td><td></td></tr><tr><td>解剖用ピンセット</td><td>Dumont</td><td>#2</td><td></td></tr><tr><td>小型解剖用鋏</td><td>F.S.T.</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>MEM Eagle培地</td><td>Cellgro</td><td>50-019 PB</td><td></td></tr><tr><td>馬血清（非動化）</td><td>Invitrogen</td><td>26050-88</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>インスリン (1 mg/ml)、0.01 N HClに溶解</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸溶液 (25%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド溶液 (DPBS中 0.5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr></tbody></table>

器官型海馬切片培養

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

海馬、大脳辺縁系の構成要素は、長期記憶と空間ナビゲーション1の重要な役割を果たしている。海馬ニューロンは、強力な活性化の短い期間の後にその接続の強さを変更することができます。長期増強（LTP）と呼ばれるこの現象は、数時間または数日間続く ​​ことができますし、学習と記憶2の最良の候補メカニズムとなっています。さらに、海馬3のよく定義された解剖学との接続は、そのシナプス伝達とシナプス可塑性の4を研究する古典的なモデルシステムてきた。 海馬シナプスの生理学の理解が成長し、分子の選手は、識別されたになるにつれ、シナプスタンパク質を操作する必要性が不可欠となった。器官型海馬培養が容易な遺伝子操作と正確な薬理学的介入の可能性を提供しますが、日常的な文化解離ニューロンの方法よりも自然な文脈におけるシナプス機能を理解する上で重要であるシナプスの組織を維持する。 ここでは簡単に他の脳領域に適合させることができる海馬スライスを準備し、文化に方法を提示する。このメソッドは、ウイルス感染5,6またはbiolistics 7のようなさまざまなアプローチを用いて遺伝子操作のためのスライスに簡単にアクセスできます。さらに、スライスを簡単に生化学的ア ​​ッセイ8用に回収できる、またはイメージング9または電気生理学的実験10の顕微鏡に転送する。

我々は簡単に他の脳領域に適合させることができる器官型海馬切片を調製する方法を説明します。脳スライスは、インタフェースを形成するために許可されている多孔質膜と培地上に置かれている。このメソッドは、最大の文化の2週間までの海馬の総アーキテクチャを保持します。

大脳辺縁系の一部である海馬は、長期記憶と空間ナビゲーションにおいて重要な役割を果たしています 1。海馬ニューロンは、...を修飾することができます。

本手順の全体的な目的は、海馬のオルガノタイプ切片を培養することです。まず、海馬を摘出します。次に、摘出した海馬を薄切します。手順の第3ステップは、海馬スライスの分離および選別です。手順の最終ステップは、海馬スライスの培養です。最終的に、解剖顕微鏡または顕微鏡による可視化を通じて、健全な有機的海馬スライスが得られます。こんにちは、私はワシントン大学のAndres bar博士の研究室で研究員を務めているJimena Opitzです。シアトルにて、海馬のオルガノタイピック切片培養の手順を実演します。一般的に、この手法に慣れていない方は、海馬を迅速に解剖・切片化する必要があること、および汚染を防ぐために滅菌した解剖溶液と切片培養を用いる必要があることから、困難に直面することがあります。培地は書面によるプロトコルに従い、最大3週間前までに調製し、4°Cで保存することができます。海馬スライスを作成する前に、培養準備を行うことができます。組織培養フードおよび解剖に使用する器具の両方を適切に滅菌させることが不可欠です。まず、組織培養フードの内面を70% ethanolで拭きます。次に、解剖顕微鏡とすべての解剖器具をフード内に配置します。ステージの上に清潔なテフロンシートを敷き、新しいブレードを装着して組織スライサーを準備します。組織スライサーを組織培養フード内に設置し、UVライトを用いてすべての表面と器具を15分間滅菌します。UV滅菌プロセスが完了した後、ライトを消灯します。以降の操作は組織培養フード内で行います。まず、海馬スライスを培養するために使用する6ウェル組織培養プレートを準備します。6ウェルプレートの各ウェルにSEMを750 µLずつピペットで分注します。次に、滅菌済みのピンセットを使用して、組織培養プレートの各ウェルにセルカルチャーインサートを配置します。インサートの下に気泡が溜まらないように注意してください。各細胞培養インサートのメンブレンがスライス培養培液で濡れていることが重要です。メンブレンが乾いている場合は、気泡がないか確認してください。メンブレンがSCMの液面に接していない場合は、ウェルに培地を追加してください。準備した培養プレートを組織培養インキュベーターに入れます。必要になるまで、35 °C、5% carbon dioxideに設定して保存します。最後に、氷と塩の混合物を氷バケツに入れ、フード内の斬首作業エリアの隣に配置します。100 milliliterのビーカーに解剖液を満たします。ビーカーを氷塩混合物の中に押し込み、5%carbon dioxideと95%oxygenで10～20分間、溶液の色がピンクからオレンジに変わるまでバブリングします。そして、解剖溶液が凍結状態と液体状態の混在したスラリー状になります。これで、解剖環境と組織培養プレート

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神経科学

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FRETベースのセンサATeam1.03YEMKを用いたマウス脳の組織組織スライスにおける細胞内ATPのイメージング

ここでは、鼻皮質海馬の組織性スライスの調製について述べています。徐々に制御された血清の剥奪の下で、これらのスライスは進化するてんかんのような出来事を描写し、てんかん発生の元vivoモデルと考えることができる。このシステムは、自発的な活動のダイナミクスを監視するだけでなく、てんかん発生の過程を通じて神経炎症性の進行を評価するための優れたツールを表します。...

リナル皮質-海馬の組織性スライス培養におけるてんかん発生のモデル

このプロトコルは、自発的な鋭波波リップル活性を示すマウスからの水平海馬内皮質(HEC)スライスの調製を記述する。スライスは、簡略化されたインターフェース保持室でインキュベートされ、記録は、組織の酸素化とネットワークレベルの活動の自発的な出現を促進するために、流れの速い人工脳脊髄液と水没条件下で行われます。...

急性マウス脳スライスによる、海馬ネットワーク活動の調査

本稿は、マウスの水平海馬脳スライスを得るための体系的なプロトコルを説明することを目的としている。この方法論の目的は、穿角経路や苔むした繊維路などの海馬繊維経路の完全性を維持し、デンテート回関連の神経学的プロセスを評価することである。...

マウス脳の水平海馬スライス

学ぶ器官型海馬切片培養法。海馬の解剖、切片、分離、培養の手順を習得し、2週間の組織構造保持とシナプス結合の維持を実現する神経科学研究の基盤技術です。

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