日立F - 7000蛍光分光光度計とPicoGreen色素を使用してdsDNAの定量化

この手順の全体的な目標は、マイクロプレートリーダーを備えたF 7, 000蛍光分光光度計が、ピコグリーン色素を使用して二本鎖DNA定量を行う能力を実証することです。これは、最初にサンプルと試薬を調製することによって達成されます。手順の2番目のステップは、機器のセットアップです。

手順の 3 番目のステップは、サンプルをマイクロプレートリーダーにロードすることです。手順の最後のステップは、標準とサンプルの測定を行うことです。最終的には、線形の検量線を示す結果を得ることができ、未知サンプルの二本鎖DNA定量に使用できます。

日立F 7, 000スペクトル蛍光計をオンにして、Excelでキセノンランプを1時間ウォームアップします。標準データとサンプルデータを含むファイルを作成し、カンマ区切りまたはCSV形式で保存します。最初に蛍光計を設定するには、分析メソッドウィンドウを開くメソッドボタンをクリックします。

測定フィールドで、プルダウンメニューから測光を選択します。次に、定量タブをクリックします。定量タイプフィールドで、指定した波長を使用して蛍光読み取りが行われることを示す波長を選択します。

キャリブレーションタイプには first order を選択し、波長数には 1 つを選択します。濃度の単位はナノグラム/ミリリットルで入力します。ゼロ ボックスを通した手動口径測定および力のカーブが小数点の後で数字のために点検されていないことを確かめて下さい、2つを選びなさい、低い集中限界のためのゼロおよび上限の集中限界のための000およびのための10、000を入力して下さい。

次に、装置タブをクリックし、データモードフィールドで蛍光を選択します。チョッピング速度フィールドは、燐光測定にのみ使用されるため、非アクティブであることを確認します。波長モードフィールドで、両方のWLをexWL1フィールドで固定し、EM WL1フィールドに480ナノメートルを入力します。

520ナノメートルを入力します。EX と EM の下にある他のすべてのフィールドは非アクティブのままにします。exスリットとEMスリットの両方を5.0ナノメートルに設定します。

プルダウンメニューを使用して、PMT電圧1〜1000ボルトフィールドの前にあるボックスをオフのままにします。PMT電圧は、プルダウンメニューから700Vを選択します。また、自動統計計算には 2 つ、反復には 1 つ、積分時間には 0.1 秒、遅延には 0 を選択します。

次に、モニタータブを開き、軸の最大フィールドを10, 000に、軸の最小値をゼロに理由を設定します。次に、データ取得後のオープンデータ処理の左側にあるボックスを選択し、必要に応じて、読み取りの完了時に自動的に印刷されるレポートのデータ収集後の印刷レポートの左側にあるボックスを選択します。最後に、選択したすべてのパラメータを解析方法ウィンドウの異なるタブに保存するには、一般タブをクリックし、指定した場所に新しいファイル名で保存します。

[OK]ボタンをクリックして、このウィンドウを閉じます。これで、測定器のテストパラメータの設定は完了です。マイクロプレートリーダーをセットアップするには、MPRボタンをクリックしてMPRセットアップウィンドウを前面に表示します。

まず、基準となるウェルを選択します。たとえば、Aの位置をクリックし、マウスをEの位置にドラッグします。次に、標準セットボタンをクリックします。

これにより、標準に使用する位置が緑色で強調表示されます。次に、サンプルの位置を選択します。同様に、プレート上の対応する位置にマウスをクリックしてドラッグし、サンプルセットボタンをクリックすると、選択した位置が自動的に黄色で強調表示されます。

目的のサンプル測定位置について、同じ操作を繰り返し続けます。標準試料とサンプル情報を、あらかじめ用意したカンマ区切りの変数ファイルに読み込みます。MPRセットアップウィンドウのウェル情報タブをクリックします。

ウェル情報のロードボタンを選択すると、Windowsエクスプローラーウィンドウが開き、ウェル情報ドットcsvファイルを識別します。情報を読み込んだ後、ウィンドウはテーブルとして表示されます。Pico green試薬の作業溶液を調製するには、50マイクロリットルの200 X picoグリーン試薬を9.95 mLのTEバッファーに加えます。

標準曲線では、TEバッファー中のラムダ二本鎖DNAの段階希釈液を、各標準品の150マイクロリットルのピペット1ミリリットルあたり1〜100ナノグラムの範囲の最終濃度で、96ウェルプレートプレートの指定ウェルに調製します。次に、各試験サンプルの150マイクロリットルをプレートの対応する指定ウェルにピペットで移します。次に、マルチピペットを使用して、各ウェルに150マイクロリットルのPicoグリーン溶液を加え、溶液とDNAサンプルを混合します。

プレートを暗い場所で2〜5分間静かにインキュベートし、反応が進行します。MPRディスプレイ画面ボタンをクリックして、MPRセットアップウィンドウをディスプレイの上部に移動し、交換ポジションボタンをクリックします。マイクロプレート保持プラットフォームは、機器の前方に移動し、マイクロプレートリーダーのドアを開き、96ウェルプレートを保持プラットフォームに置き、Aウェルを前方に向けてマイクロプレートリーダーのドアを閉じます。

初期位置ボタンをクリックして、マイクロプレートの1つに位置Aを測定位置に配置します。モニターの表示ボタンをクリックして、測定ウィンドウをディスプレイの上に移動します。測定ボタンをクリックすると、標準試料と未知試料の測定が開始されます。

良好な検量線は、F 7, 000ソフトウェアが提供するさまざまなパラメータを使用して評価されます。例えば、Pico 緑色色素を使用した二本鎖 DNA の定量で得られたこの理想的な検量線は、0.99993 と決定係数を計算しました。説明されているハイスループットシステムは、ピコグリーンダイ、日立F 7、000蛍光分光光度計、マイクロプレートリーダー、データ収集、保存分析、プレゼンテーションを自動化するソフトウェアプログラムを備えた技術のシリアルアセンブリです。

強力な技術の組み合わせにより、少量の二本鎖を正確に分析するニーズの高まりに対応できます。デオキシリボ核酸。