Name: 注射とエレクトロポレーションによりゼブラフィッシュ耳胞イントゥMIFモルフォの直接配信は、内耳の開発に影響を与える (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ内耳へのモルフォリノ標的導入法。マイクロインジェクションとエレクトロポレーションを組み合わせ、24時間後受精卵の耳胞に直接導入することで、内耳発生と神経発生の特異的効果を解析できます。

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この作品は、KFBの難聴の研究財団からYcをSとNSF（IOS 0930096）への補助金によって支えられている。 KFB：NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184、 <a href="https://commons.era.nih.gov/commons/genericStatus.do?actionRole=nonPI&amp;applID=7854446&amp;uhf-token=Ugf7JvudZTCbTUW9jSAR1snMUgg%3D">3R01DC004184 - 08W1</a> 、NSF DBI 0832862、NSF IOS 0930096

1。エレクトロポレーション用電極の作成<ol><li>適当な長さの75ミクロン径のタングステンワイヤーを（AMシステムズ社Carlsborg、ワシントン州）（約3〜5センチ）カット</li><li>モレックスケーブルコネクタ（ピンスタンプ真鍮）を介してタングステンワイヤーを置いて下さい</li><li>ワイヤーに縮小チューブを密封するためにタングステンワイヤと収縮チューブ付きモレックスケーブルコネクタ（SPC技術、シカゴ、IL）をラップし、ブンゼンのバーナーやヒートガンで熱を適用する</li><li>タングステン線の先端をシャープにする、1.0 N水酸化ナトリウムにワイヤーを浸し（コンラッドら、1993）と、他方の電極としてのペーパークリップを使用して、方形波のエレクトロでワイヤーを電解する。我々が使用する条件は、パルス間で50ミリとそれぞれ持続100 msの5ボルトのパルスである。電極には、15〜20ミクロンの直径にシャープされるべきである</li><li>エレクトロポレーションに使用する前に粘土に押された溝内のトレイに配線してください</li></ol> 2。エレクトロステーションの設定<ol><li>テープはマイクロマニピュレータ（世界の精密機器）に75μmのタングステン電極を削った。 </li><li>解剖顕微鏡のステージ（ライカ）の両側に配置マニピュレーター。 </li><li>プロテクトCUY - 21 [編集]矩形波エレクトロ（図1）に電極を接続してください。 </li><li>エレクトロの電源を入れ、電圧、パルス持続時間、及びパルス数を含む、エレクトロポレーションのパラメータを、設定します。この実験のための最も効果的なパラメータは、それぞれがそれぞれのパルス間で100ミリ秒で、5.0ms続いたthree 13ボルトのパルスであることがわかった。エレクトロポレーションは、胚中の気泡を作成する場合、パルスの長さを減らす。 </li></ol> 3。ゼブラフィッシュ耳胞イントゥモルフォのマイクロインジェクション<ol><li>繁殖タンクから収穫のゼブラフィッシュ胚。で胚をインキュベート胚啓発℃で一晩28.5で0.3 PPMメチレンブルー（ウェスター、2005）で培地を。 </li><li>サターP - 97電極プラーとガラス針を引っ張る</li><li> ℃の水浴中で37にアガロースゲル基剤（10mMのペトリ皿に魚の水中の1％アガロース）をウォームアップ</li><li>溶融までの魚の水の熱を1％低融点アガロース（LMPA）と37℃の水浴中で、冷えないように保管してください。 </li><li>モルホリノソリューション（GeneTools、コーバリス、OR）とガラスの針を記入し、適切な直径の先端をカット。マイクロマニピュレータ（クーン）に注射針をマウントします。 </li><li>約10μmの針の先端をカットし、先端がモルホリノソリューションの十分な配信を可能にすることを保証するためにミネラルオイルに注入する。 </li><li> 24時間のpostfertilization（HPF）で胚をDechorinate、0.3 PPMのメチレンブルー魚の水にMS222（tricaine、シグマ）でそれらを麻酔。 </li><li>便利な均一な分析のための右側面を上にしてアガロースゲルベースの​​上に3〜5麻酔胚の位置を合わせます</li><li>それぞれの胚を介して1％LMPAの1〜2滴を入れ、所定の場所に胚を固定するために固めることができます</li><li>耳胞が右側になるようにペトリ皿を回転させる</li><li>耳胞の内腔に針を置き、添付の窒素タンク（図2）でPV820空気圧PicoPump（世界の精密機器）とモルホリノソリューションを注入する</li></ol> 4。エレクトロポレーションの手順<ol><li>すぐに注入した後、エレクトロポレーションステーションに取り付けられた胚を移動する</li><li>耳胞へのちょうど後方組織への正極を置きますが、浸透しない;耳胞にちょうど前脳に負極を挿入する</li><li>フットペダルを使用するか、スイッチを押すことにより電流を適用する。 </li><li>アガロースの魚の水を注ぎ、旋回とガラスピペットでアガロースから胚を削除します。胚を傷つけないように、注意してください。除去が困難な胚の場合は、軽く胚を取り巻くあらゆるLMPAを脱却するために針を使用。 </li><li>場所は、メチレンブルーの魚 ​​の水でプレートの胚および分析のための必要な段階（in situハイブリダイゼーション、etcと微視的anlaysis で 、免疫組織化学的、形態学的）に胚を発生させます。 </li></ol> 5。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1エレクトロステーション。電極は、シャープ75μmのタングステン線を使用して行われ保護CUY - 21 [編集]矩形波エレクトロにリード線で接続されていました。これらの電極は、マイクロマニピュレータにテープで固定されました。 <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。注入ステーション。すべての胚は、標準化の目的のために右耳に注入した。 <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3 3 DPFの胚とアクチンフィラメントのファロイジン染色。 （A）3 DPFの胚injecte制御MOとdは後部黄斑（PM）のファロイジンの強い染色を持っています。 （B）コントロールMOを注入し、エレクトロポレーションされた胚は、注射のみ胚で午後のファロイジン染色の同じようなレベルを持っていた。エレクトロポレーションと一緒にMIF MOの注入は、午後（D）のファロイジン染色の劇的な減少を引き起こした一方（C）単独で耳胞へのMIFのMOとのインジェクションは、ファロイジン染色の低下を引き起こさなかった。 、前黄斑です。 <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4 5 DPFの幼虫とアクチンフィラメントのファロイジン染色。標準コントロールモルホリノが（B）に使用されたエレクトロのみインジェクション（）と注入の間に差はなかった。しかし、MIFモルフォとエレクトロポレーションを注入された5 DPFの幼虫は、MIFモルフォ（Cを注入した胚と比べ3 DPFよりもそれほど劇的後黄斑の減少ファロイジン染色（午後）（D）を、、を示した）。 、前黄斑です。 <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5 3 DPFにおける胚のアセチル化チューブリン染色。 （A）中の胚は、任意の注射またはエレクトロポレーションを受信しませんでした。 （B）の胚は、エレクトロポレーションがない注射を受信しませんでした。 MIFモルフォと注射とエレクトロポレーション（C、D）の両方を受信する胚は、目に見えて、コントロールと比較してチューブリンの染色を減少していた。 （午後、後部黄斑）。 <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6。対照モルホリノ3 DPFにおける胚のアセチル化チューブリン染色。 （A）どんな治療をすることなく胚が後部黄斑（PM）と豊富な神経支配の強力なアセチル化チューブリンの染色を示した。 （B）胚は対照モルホリノを注入。 （C）エンブリオは、エレクトロポレーションで処理した。 （D）制御モルホリノとコントロール胚に注入し、エレクトロポレーションは、治療のコントロールなしに比べて後黄斑と神経支配のアセチル化チューブリンの同じようなレベルがあります。

<ol><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).</li>
<li>Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+essential+for+axis+formation+and+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development.</a> J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).</li>
<li>Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+placode+to+polarization%3A+new+tunes+in+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">From placode to polarization: new tunes in inner ear development.</a> Development. 131, 4119-4135 (2004).</li>
</ol>

記事の生産は、ビデオとテキストに記載されている試薬を生成する遺伝子のツール、LLCによって後援されています。

私たちは正常に24 HPFのゼブラフィッシュ胚の耳にアンチセンスオリゴヌクレオチドのMOを導入している。注射とエレクトロポレーション後に発生した胚は生存可能であった。胚のエレクトロポレーションを生き延びた場合、それらは通常の治療を受けておらず、胚に比べて速度だけでなく、唯一の注入した胚とのみエレクトロされて​​いた胚に成長した。 我々は、ファロイジンとアセチル化チューブリンで標識を通して耳の注射とエレクトロポレーション後MIFとMIFのような MOの効果を観察した。後黄斑の感覚有毛細胞のアクチンフィラメントのファロイジン染色は、MIFのそのエレクトロポレーションを示しており、唯一のMOを注入した胚と比較した場合、24 HPF段階でMIFのような MOは、有毛細胞および/ ​​または不動の数値の変化を引き起こした（図3）。有毛細胞の数のこの減少は、Shen らの調査結果と整合的である。（提出）MIFとMIFのようにMOSは球形嚢斑における有毛細胞数の減少を引き起こすこと。このエレクトロポレーションを示すMOSとエレクトロポレーションを注入した胚における毛細胞数の減少は、それによって耳胞にのみ注入された胚に比べて形態学的効果の程度を増加させる、細胞膜を横切ってMOを移動するには助けることができる。 statoacoustic神経節の形態の変化は、アセチル化チューブリン染色で観察された。 statoacoustic神経節から神経支配の程度は、神経突起（図5）の分岐減少ショーを注入し、エレクトロポレーションした胚として、影響を受けていた。アセチル化チューブリンの染色が大幅に注入し、エレクトロポレーションした両方の胚に減少するため、また、神経節細胞および/または神経節細胞数の減少の結露をそこに減少させることもできます。 MIFは、神経系の開発（鈴木ら 、2004）ために重要であることが示されているので、エレクトロポレーション後に見られる変化は、MIFとMIFのような神経芽細胞へのMOソリューションの増加トランスフェクションの結果である可能性があります。 直接開発組織へのアンチセンスオリゴモルフォのエレクトロポレーションは、胚に、両方の空間的及び時間的に、その組織の開発中に遺伝子の発現を制御するのに便利なツールです。内耳の組織にMIFとMIFのような MOのエレクトロポレーションは、後黄斑とstatoacoustic神経節の両方の異常形態をもたらした。何の治療を受けておらず、胚を持つかのどちらかのみを注入されているか、あるいは唯一のエレクトロした胚と比較して注入し、エレクトロポレーションされていた胚の後部黄斑の感覚有毛細胞数の減少があった。 statoacoustic神経節から後部感覚パッチの神経支配の程度の低下とSAGの大きさもあった。エレクトロポレーションは、所望の組織で、特定のDNA、RNA、またはMOの主効果を観察し、他の組織上の二次的影響からこれらを区別すること、脳、神経堤とを含むことの利点と、特定の組織に巨大分子をトランスフェクションするための貴重な方法です。内耳の開発に関する耳周囲の間充織（Baraldとケリー、2004）。

<ol><li> MOは：0.3 MIF、MIFのような MO1のための組み合わせのmm、およびMIFのような MO2使用されていた。 5&#39; - acatcggcatgactgcgacagagat - 3&#39;：MIF MOは、ゼブラフィッシュのMIF mRNAの開始コドンに無料です。二つのMOはMIFのように使用したMO1 MIFのような翻訳開始部位に無料です。MO2 MIFのような intron1/exon 2境界でシーケンスASから派生しながら、5&#39; - GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA - 3&#39;：5&#39; - GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC &#39;-3。 5&#39; - CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA - 3&#39;：コントロールMOは、遺伝子のツールから塩基配列をスクランブルされた。 </li><li>魚の水にメチレンブルー（0.3 ppm）の</li><li> MS222（tricaine、シグマ、魚の水中で0.64 mM）を</li><li>低融点アガロース（LMPA、ロシュ） </li><li>フェノールレッド（シグマ） </li><li>抗アセチル化チューブリン（シグマ） </li><li>のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗マウス二次抗体（分子プローブ） </li><li>テキサスレッド-ファロイジン（Molecular Probes社） </li></ol>

注射とエレクトロポレーションによりゼブラフィッシュ耳胞イントゥmifモルフォの直接配信は、内耳の開発に影響を与える

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

近年では、エレクトロポレーションは、眼、脳、およびゼブラフィッシュの体節を含む様々な組織、へのDNA、RNA、およびモルフォの in vivoトランスフェクションのための一般的な手法となっている。遺伝子操作の他の方法に比べてエレクトロポレーションの利点は、特定の組織が電流のアプリケーションによる巨大分子の導入のために、両方の空間的及び時間的に、対象とすることができるということです。ここでは、ゼブラフィッシュの開発内耳の組織にMIFとMIFのようなモルフォをトランスフェクトするためのエレクトロポレーションの使用について説明します。過去の研究では、1から胚に注入MIFモルホリノ- 8細胞期には、広範な形態学的神経系や眼の変化だけでなく、耳をもたらした。開発の後期段階で内耳の組織を標的とすることで、我々は他の組織の影響に起因する二次的効果とは対照的に、発展途上内耳でMIFの主要な効果を決定することができます。後黄斑に関連する神経細胞、神経細胞のプロセス、および毛の細胞の形態を調べるために染色ファロイジンとアセチル化チューブリンを使用することによって、我々はゼブラフィッシュ内耳における標的トランスフェクションのための方法として、エレクトロポレーションの有効性を評価することができた。 24hpf胚の耳小胞は、モルフォとエレクトロポレーションを注射し、その後も治療を受けておらず、または唯一の注入またはエレクトロポレーションされていた胚と比較した。注入とエレクトロポレーションした胚は、有毛細胞数の減少を示したstatoacoustic神経節（SAG）と対照群と比較して少ないSAGのニューロンによる神経支配の減少となりました。我々の結果は、後の段階でotocystsにモルフォの直接配信は、非特異的な神経系1〜8細胞期で配信モルフォの神経堤の影響を回避することを示した。また、脳、神経堤や耳周囲の間充織での主な影響から耳上の二次的な影響を内耳に向けとされていない効果の検討が可能になります。

24hpfでゼブラフィッシュの耳胞に直接モルフォを提供する方法が開発されている。耳胞と浸透をもたらすためにエレクトロポレーションの内腔にモルフォのマイクロインジェクションを使用して、我々は脳にモルフォのエフェクトをバイパスし、内耳に固有の効果を得ることができた。

注射とエレクトロポレーションによりゼブラフィッシュ耳胞イントゥMIFモルフォの直接配信は、内耳の開発に影響を与える

近年、エレクトロポレーションは、さまざまな組織へのDNA、RNA、およびモルフォリノのin vivoトランスフェクションのための普及した手法となっており、これには...

本実験の全体的な目的は、受精後1日または24時間後の段階で、アンチセンス、オリゴヌクレオチド、モルフォリノ、またはその他の発生摂動分子をゼブラフィッシュの耳胞に直接導入することです。この例では、耳神経節の発生に関与する最古のニューロトロフィンである、マクロファージ遊走阻止因子（MIF）と呼ばれる免疫系サイトカインに対するモルフォリノを使用し、この分子へのモルフォリノ投与が内耳の発生または神経新生に影響を与えるかどうかを判定します。これは、まずマイクロインジェクションを用いて耳胞の腔内にモルフォリノを導入し、次にエレクトロポレーションを行うことで、腔内から耳胞の細胞内へのモルフォリノの浸透を促進させることで達成されます。次に、形態形成因子（morphos）が内耳の発達および神経発生に及ぼす影響を観察するため、胚を28.5 °Cで育成します。その後数日間にわたり、免疫組織化学および染色による解析を行った結果、内耳の感覚有毛細胞の減少と、前庭蝸起神経節による神経支配の減少が認められました。これらの解析では、それぞれキノシリアの酢酸化チューブリンおよび有毛細胞表面のステレオシリアのアクチンを標識しています。私たちは、鶏胚へのmorphosの注入およびエレクトロポレーションというこの手法を、研究室の非常に優秀な学部生と共に開発しました。Katie Holmesは、これをゼブラフィッシュのサイズにまで縮小することに成功しました。ポストドクターのYuchi、大学院生のMatt Wyatt、そして元ポストドクターのDeb Thompsonを含む現在の研究チームが、ゼブラフィッシュ向けにこの手法を改良しました。この手法により、発生生物学および聴覚研究における重要な問いに答えが出ることを期待しています。例えば、耳のような器官系に対する特定の形態形成因子の影響を、多くの器官系に影響を及ぼし、結果として耳に波及するような全般的な発生への影響（例えば、脳への影響が二次的に耳に影響を与える場合など）と区別できるかどうか、といった点です。1〜4細胞期のマイクロインジェクションなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、より後期の段階で形態形成因子（morphogens）を耳に直接導入できる点にあります。これにより、形態形成因子が脳に及ぼす直接的な影響や、内耳を介した二次的な影響を避けることができます。電極を作成するには、まず直径75 µmのタングステン線を約3〜5 cmの長さに切断します。次に、そのタングステン線をMolexケーブルコネクタに通します。次に、タングステン線とMolexケーブルコネクタを熱収縮チューブで巻き、ブンゼンバーナーまたはヒートガンで加熱して、チューブを線に密着させて封止します。続いて、タングステン線の先端を鋭利にするため、線を通常の水酸化ナトリウム溶液に浸し、ペーパークリップをもう一方の電極として、スクエアウェーブ電気化学的に電解します。使用する条件は、電圧50 Vのパルスを5回、各パルスの持続時間を100 msとし、パルス間に50 msの間隔を設けます。電極の先端を1.0 N 水酸化ナトリウム溶液に浸し、3回繰り返し測定します。電極を水酸化ナトリウム溶液へわずかに深く挿入し、さらにもう1回繰り返し測定します。電極をさらに深く挿入し（2回ともほぼ同じ距離だけ電極を進めてください）、最後にもう1回繰り返し測定します。この段階的な研磨により、電極の先端が非常に細くなり、発達中のゼブラフィッシュ胚への電極挿入において、より正確で組織へのダメージが少ない挿入が可能になります。ゼブラフィッシュの耳胞へモルフォリノを微量注入するためのエレクトロポレーションに使用するまで、ワイヤーはトレイの中の造形粘土に押し込んだ状態で保持してください。まず、夜間にオスとメスを分けるためのプラスチック製仕切りを設置し、繁殖タンクを準備します。オス4匹とメス4匹をタンクに入れ、14時間明期・10時間暗期のサイクルに設定した培養室に一晩置いておきます。翌朝、点灯後にディバイダーを抜き、約20分から30分間、魚に刺激を与えずそのままにします。その後、オスとメスを分け、親魚を繁殖タンクから取り出します。新鮮な飼育水が入ったタンクに移します。卵を含む水をストレーナーでろ過し、ブリーディングタンクから胚を回収します。ストレーナー内の卵を新鮮な卵水で数回すすいだ後、ペトリ皿に排出します。未受精卵または不透明な卵を取り除き、0.3 PP m メチレンブルーを含む胚育成培地にて、28.5 °Cで一晩胚を培養します。注入の直前に、Sutter P 97 電極プラーを用いてガラスニードルを作成します。魚用水に1% AGROSを含むAROSゲルベースを10 mmのペトリ皿に入れ、ウォーターバスで37 °Cに温めます。また、魚用水に1% 低融点AGROSまたはLMPAを加え、融解するまで加熱し、37 °Cのウォーターバスで保温しておきます。ガラス針にモルフォリノ溶液を満たし、先端を適切な直径（約10〜15 µm）にカットします。注入用針を、窒素タンクを備えたPV820ニューマティック・ピコポンプに接続されたマイクロマニピュレーターに取り付けます。受精後24時間の胚を脱外套し、0.3 PPMのメチレンブルーを含む魚用飼育水でトリカインを用いて麻酔します。次に、均一な解析を行いやすくするため、麻酔をかけた3〜5個の胚の右側を上にしてAROSゲルベース上に並べ、各胚の上に1% LMPAを1〜2滴滴下し、凝固させて胚を固定します。耳胞が右側にくるようにペトリ皿を回転させます。その後、針を耳胞の腔内に挿入し、フットペダルを使用してモルフォ溶液を注入します。マイクロインジェクション直後、固定した胚をエレクトロポレーションステーションに移動させ、準備を行います。まず、先端を研磨した75 µmのタングステン電極をマイクロマニピュレーターにテープで固定します。次に、マイクロマニピュレーターを解剖顕微鏡ステージの両側に配置します。電気穿孔装置（エレクトロポレーター）の電源を入れ、電気穿孔（エレクトロポレーション）のパラメータを設定します。本実験において最も効果的であったパラメータは、13 Vのパルスを2 msで3回、各パルス間に100 msの間隔を空けて印加する条件でした。電極を挿入し、耳胞の両側に電極が均等に配置されるようにします。一方の電極を耳胞の表層に、もう一方を耳胞の深層に配置してください。次に、フットペダルを使用するか、スイッチを押して電流を流し、エレクトロポレーションを完了させます。アガロース上に魚用水を注ぎ、ガラスピペットを用いてプレートをゆっくりと回しながら胚を回収します。取り出しにくい胚については、胚を損傷させないよう注意してください。針を用いて、胚の周囲にあるLMPAを慎重に取り除きます。胚をメチレンブルーを含む魚用飼育水が入ったプレートに移し、形態学的免疫組織化学染色のために目的の段階まで育成させます。Cの2つのハイブリダイゼーションおよび顕微鏡解析において、耳への注入およびモルフォリノのエレクトロポレーションの代表的な結果をここに示します。フェニルレッドで標識された後耳斑（PM）は、魚の聴覚器官の一つです。この写真では、感覚毛細胞上の立体毛にあるアクチン束が、赤い点として現れています。MIF morphsのみを注入した受精後3日の胚におけるPhalloidin蛍光染色で観察されたパドル状の丘（macula）では、注入とエレクトロポレーションの両方を行った同齢の胚と比較して、有毛細胞の立体絨毛（stereocilia）内に、より多くのアクチンフィラメントが認められました。しかし、標準的なコントロールmorphoを用いた注入およびエレクトロポレーションでは、morphoの注入のみの場合と比較して、F-アクチン染色の減少は見られませんでした。後方の丘においても同様の結果が得られましたが、MIF Morphosesのみを注入した胚と比較して、注入およびエレクトロポレーションを行った5日齢の幼魚では、その差はそれほど顕著ではありませんでした。標準コントロールモルフを使用した際、注入のみの場合とエレクトロポレーションを伴う注入の場合との間に差は見られませんでした。この胚は、アセチル化チューブリンに対する抗体で染色されており、MIFモルフォリノの注入およびエレクトロポレーションは行われていません。この胚は、エレクトロポレーションは行われましたが、注入は行われていません。どちらの胚も正常なアセチル化チューブリン染色を示しています。これらの胚は、いずれも注入およびエレクトロポレーションが行われました。対照群と比較してチューブリン染色が明らかに減少しており、耳に関連する神経突起および周囲の神経節に関連する神経突起が大幅に減少していました。コントロールmorphoを注入および電気穿孔に使用した際、morphoのみを注入した場合と比較して、α-tubulin染色の範囲の減少や、聴覚神経節による神経支配の低下は見られませんでした。この手法に習熟すれば、適切に実施することで約2時間で完了できます。この手法で最も習得が困難な部分は電気穿孔であり、脳を損傷させないよう細心の注意を払う必要があります。電極を鋭利にしておくことで、この問題は軽減されます。

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