レンチウイルスベクターを用いたラット受精卵の形質導入

中心に胚培養液の滴を置き、蒸発を防ぐためにミネラルオイルで覆ったマイクロインジェクション用ディッシュを用意する。

ディッシュを倒立顕微鏡の下に配置します。

顕微鏡下で、マイクロインジェクション用キャピラリーとホールディングピペットをマイクロマニピュレーター装置に配置します。

マイクロインジェクション用キャピラリーに、トランスジーンを搭載したレンチウイルスベクターの懸濁液を充填します。

次に、受精したラット胚を培地に移します。

ホールディングピペットを用いて吸引し、胚を固定します。

高倍率下で、胚の細胞外糖タンパク質被膜である透明帯にマイクロインジェクション用キャピラリーを挿入し、レンチウイルス懸濁液を卵周隙に注入します。

その後、注入した胚を培養皿に移し、インキュベートします。

ウイルスが胚に進入し、導入遺伝子を含むゲノムを細胞質内に放出します。

その後、逆転写されてDNAとなり、胚のゲノムに組み込まれ、導入遺伝子が統合されます。

これで、導入済みの胚を処理する準備が整いました。

1細胞期胚の透明帯下へのレンチウイルスベクターの微量注入には、ピペットプラーを用いてフィラメントによるホウケイ酸ガラス製微量注入用キャピラリーを準備します。フィラメントを交換した後や新しいガラスキャピラリーを使用するたびに、Rampテストを行い、最適なパラメーターを設定してください。

次に、バイオセーフティ・ラミナーフローフード内で、マイクロローダーチップを使用して、マイクロインジェクション用ピペット1本あたり約 2 µL の解凍直後のレンチウイルス溶液をロードします。60 mm Petri dish の蓋の中央に M2 Medium を 100 µL 滴下します。培地をミネラルオイルで覆い、ホールディングピペットとウイルスをロードしたマイクロインジェクションキャピラリーをマイクロマニピュレーターに取り付けます。

マイクロインジェクション用ディッシュを倒立顕微鏡下に配置し、15〜20個の1細胞期胚をディッシュ内のM2液滴に転移させます。ホールディングピペットで胚を1つ捕捉し、400倍の倍率で、ガラスキャピラリーを用いてレンチウイルス溶液を透明帯下の卵周腔内に注入します。ウイルス注入後、キャピラリーを透明帯下に一瞬保持してください。すべての胚への注入が完了したら、微細ピペットを用いて注入済みの細胞を培養皿に戻し、移植まで細胞培養インキュベーター内で保持します。