マウスにおける伝統的な米航空宇宙局（NASA）後肢アンロードモデルへの交代方法

本手順の全体的な目的は、動物へのストレスを最小限に抑える、より簡便で直接的な方法を用いて、マウスの後肢除荷（hu）を行うことです。このテイルリング法は、全体的な健康状態や体重を損なうことなく、後肢の萎縮を正常に誘発します。最初のステップは、成マウスにテイルリングを植え込むことです。

研究期間を通じて、体重および健康状態の観察を記録することが重要です。次に、後肢除荷装置を組み立て、除荷を行うケージ内に設置します。動物の回復後、除荷手順のために装置内に配置します。

最終的に、体重と筋肉量の両方を測定することで、非荷重マウスの後肢における筋萎縮を確認することができました。Maori Holtonテーピング法などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、尾の皮膚が常に露出していることです。マウスが懸垂装置から脱出したりリングで遊んだりすることがなく、回復が早く、安定した体重を維持できるという特徴があります。

本手法は、筋骨格系の生理学分野、および重力および宇宙生物学分野における重要な問いへの回答に寄与することが期待されます。例えば、長期間の身体活動停止、ベッドレスト、肢の固定、微小重力、神経筋疾患、および加齢に伴って生じる骨格筋萎縮や骨量減少をどのように防ぐかといった課題が挙げられます。私たちがこのアイデアを初めて得たのは、Maury Holdenのテイルテーピング法で合併症が発生したときでした。後肢装置からマウスが脱走することで、動物や実験データが繰り返し失われていたため、本手法を考案し、実証しました。

本日は、私の研究室のシニアリサーチアソシエイトであるAndre Ferrara氏をご紹介します。アンドレ氏をサポートするのは、同研究室の博士課程学生であるJacqueline Chrissy氏と、同じく研究室の学部生であるAndrew Dunn氏です。まず、手術部位を滅菌し、成マウスをイソフルランで麻酔します。その後、マウスの体重を記録し、ヒーティングパッドの上に置きます。クロルヘキシジン溶液で洗浄し、手術に向けて尾を準備します。

尾の付け根にある体毛の末端から数え、尾にある2つの骨の突起の間にある第5、第6、または第7椎間腔を確認します。止血鉗子と20 5G針を用いて、2つの椎骨の間にある椎間腔にガイド穴を開けます。針を抜き、スチール縫合糸を挿入します。

穴を通して10 cmの長さに切断します。縫合糸が尾の両側から5 cmずつ突き出している状態にします。親指の先を尾に当て、もう一方の手を使って、親指にスチール縫合糸を巻き付けます。

端をねじって大きなループを作ります。巻き付け部分または円形部分の長さは±3mmにしてください。縫合糸の片方を止血鉗子で固定し、より小さなループ状に曲げます。その端を、元の大きなループのねじり部分にできるだけ近づけて固定します。

余分なワイヤーを切断し、ねじったワイヤーを後方に曲げます。硝酸銀スティックを用いて、過剰な出血を止めてください。手術後、後肢除荷（hu）を開始するまで、動物を5〜7日間回復させます。

テールリングが絡まるのを防ぐため、マイザーハウスを単独で設置します。1インチ幅、3/8インチ厚のメッキ付きスロット付き鋼棒をケージの上部に重ね、テープで固定します。さらにワッシャーとウィングナットを追加しますが、後で調整ができるよう、完全に締め付けないでください。

ボビンが脱落するのを防ぐため、ボビンの中心穴に小ねじを挿入します。小ねじの端にナイロンロックナットを締め付けます。ボビンが自由に回転することを確認してください。

フィッシングスイベルのスナップフックをボビンの下部に挿入します。ペンチを使用して、ペーパークリップをS字型のフックに成形します。S字型フックの一端をフィッシングスイベルの穴に通し、ペンチで挟んで固定します。

U字型のワイヤーをケージ内側の機械ネジに平行に配置し、端を側面に折り曲げます。ウォーターボトルを完全に固定するには、スパウトを下に向けてウォーターボトルをU字型ワイヤーに挿入し、底に触れないようにします。ダクトテープを使用して、ウォーターボトルをケージに固定してください。

2インチのバインダークリップを曲げて開き、後肢懸垂 procedure に先立って、ペレットを潰すことなく数個の餌を保持できる程度の張力を残しておきます。比較に用いるため、マウスの体重を記録します。その後、S字フックの開いた端を、尾から突き出ている小さなリングに通します。

装置の機械ネジにある下のウイングナットを締めるか緩めることで、マウスの高さを調整します。後肢に荷重がかからないようにしてください。最適な高さに達したら、上のウイングナットを締め、マウスが後肢で給水ノズルに登れないように、成形済みのワイヤーで水ボトルの位置を調整します。

研究期間中の食物摂取量を測定するため、ペレットをバインダークランプに入れる前に重量を量っておきます。1日あたり約5〜6 gの飼料を摂取できるよう、約8〜10 gを用意します。マウスが上に登れないよう、ケージの底に飼料を入れたバインダークランプをマウスの配置に合わせて置き、ダクトテープで固定します。

2×2インチのゴア（gore）を緩めに使用します。テイルをフィッシュスイベルに巻き付けます。ゴアの端にテイルを少量巻き付け、ゴアをテイルに固定します。

この工程は、尾が下方に垂れ下がり、先端に血液が溜まって尾が壊死することを防ぐために重要です。ケージの反対側にいる別の動物に対しても、同様の手順を繰り返します。1つのケージに2匹の動物を飼育する場合は、互いにほぼ触れ合うことができるように間隔を調整してください。

ケージの中央に配置します。マウスが盛り土を作るのに十分な量にならないよう注意しながら、少量のコーンコブ床材をケージに加えます。後肢除荷処置の後、動物を装置から取り出し、テールリングを外します。

ワイヤークッターを用いて体重を記録し、動物をホームケージに戻して回復させます。回復期間を経て、再度待機させた後、ヒラメ筋と副腎重量を測定します。尾部切断手術前の体重は、手術5日後およびhu前の体重と有意な差はありませんでした。

14日間および28日間の後肢除荷により、体重のわずかな減少が見られたものの、統計的な有意差はなく、マウスの体重は3日間の回復期間を経て完全に回復しました。ここでは、歩行コントロール群およびHU群のマウスにおける食物摂取量を示します。

28日間にわたるHU投与マウスの1日平均食物摂取量は、対照群と比較して差が認められなかった。HU投与14日後および28日後に有意なヒラメ筋萎縮が観察され、3日間の回復期間後の手順が有効であることが示された。ヒラメ筋質量は、いずれのHU投与群よりも有意に大きかったが、歩行可能な対照動物よりは依然として有意に少なかった。

動物のストレス指標とするため、左右両方の副腎を摘出して重量を測定しました。ここで示されているように、対照群とHUマウスの間で平均重量に差は見られませんでした。習熟すれば、尾端切除手術はマウス1匹あたり5〜10分で完了し、その後のケージのセットアップは15分で完了します。筋骨格系がどのように回復し、これらの長期的な不使用期間にどのように反応するかといったさらなる疑問を解消するために、後肢の再負荷や不使用性萎縮からの回復といった他の手法を併せて実施することが可能です。

このビデオを視聴したことで、マウスの後肢除荷（hind limb unloading）の実施方法について十分に理解できたはずです。この手法を用いることで、心血管系、筋骨格系、間質などの複数の組織やシステムを、除荷および再負荷条件下で、またノックアウトマウスやノックインマウスなどの多様なマウスモデルを用いて研究することが可能になります。