Name: 骨格筋からの前駆体の精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学ぶマウス骨格筋からの前駆細胞精製法。FACSを用いて筋原性・脂肪原性前駆細胞を分離し、組織再生における細胞相互作用と分化能を解析する手法です。再生医療研究に応用可能です。

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1。組織のコレクション： <ol><li> 7〜12週齢のマウスを使用してください。通常、少なくとも二つの動物が使用されています：一つは補償のために、蛍光マイナスワンアイソタイプコントロールサンプルのための必要なFACS単色のコントロールを設定することです。他には、ソートのための実際のサンプルです。 </li><li> CO 2吸入によりマウスを安楽死させるかの選択の倫理のプロトコルに従って。場所を上に向けてペーパータオルの上でマウス、およびマウスの毛皮で汚染を防ぐために、徹底的に70％エタノールでスプレー。 </li><li>鉗子による腹部の皮膚を持ち上げ、鋭いはさみと小さな縦方向のカットを行います。 </li><li>反対方向に皮膚の二つフラップ（上下）ピール完全に下に後肢の筋肉を公開する。 </li><li>脛骨の両側に沿ってはさみを挿入して拡張することによって消費税筋肉組織。 </li><li>筋肉組織を抽出するために大腿骨のための同じプロセスを繰り返します。 </li><li>各マウスからの組織のために一皿を使用して、60ミリメートルペトリ皿内のすべての摘出した筋肉組織を置きます。 </li><li>すべてのマウスは、上記を繰り返します。 </li></ol> 2。酵素消化によって単一細胞に組織の関連付けを解除します。 プロトコルのこのセクション全体で、滅菌試薬およびツールを使用し、無菌条件下で動作する。 <ol start="9"><li>各ペトリ皿にコラゲナーゼIIの2 mLの（シグマ、カタログ番号6885、500U / mL）および250mmのCaCl 2の株式の20μLを追加。 </li><li>非常に汚染されたとして削除し、破棄する注意を払って、二つの鉗子（一鋸歯状、ファイン科学ツールから2歯を持つもの、、猫＃11051から10、11154〜10）の小さな断片（約1mm 3）に筋肉組織を引き裂く可能な限り、非筋肉組織。 </li><li>ペトリ皿を覆い、30分間37℃でそれらをインキュベートする。 </li><li>ペトリ皿を取得し、徹底的にマッシュ組織片に3 mLシリンジのプランジャーを使用してください。汚染を避けるために、サンプルごとに1つのプランジャーを使用してください。 </li><li>各ペトリ皿にいくつか（〜5mL）を滅菌冷PBSを追加し、（必要なすべての組織を回復する場合ペトリ皿を洗う）50mLのファルコンチューブに組織の汚泥を転送する</li><li>精力的にファルコンチューブを振る、PBSでチューブを埋める、遠心分離機@約800 rpm × 5分（エッペンドルフのベンチトップモデル：5810R）、そして上清を吸引（繰り返し3回） </li><li> 37℃でインキュベートし、各チューブにし、CaCl 2の10μL（250MM）：1mLのコラゲナーゼDの混合物（ロシュ、カタログ番号11088882001、1.5U / mL）を/ディスパーゼII（04942078001、2.4u / mLのロシュ、猫＃）を追加する1時間回転で摂氏。 </li><li>冷たい、滅菌PBS、渦と組織を均質化するピペットの5-10 mLを加え。 </li><li> PBSでチューブをいっぱいにしてよく混ぜる。 </li><li>組織の残りの大部分を除外するために50mlのファルコンチューブの上に配置さ40μmのセルストレーナーに液体を移す。均等にthree 50mLのファルコンチューブに各サンプルを分ける。 PBSで各チューブを埋めるには、摂氏8度で5分間@ 1600rpmを遠心してください。 </li><li>上清を捨て、染色用の細胞を収集する。 </li></ol> 3。抗体染色およびソート： プロトコルのこのセクション全体で、無菌のFACSおよびコレクションのバッファを使用し、無菌条件下で動作する。適切に取り扱えば商業抗体は一般に、無菌と考えられている。 <ol start="20"><li>単一の色やアイソタイプコントロールサンプルの場合は、1mLのFACS緩衝液でサンプルを再懸濁し、9つの1.5mlのプレ標識したエッペンドルフチュー​​ブ（100μLを各試験管）に懸濁した細胞を分ける。 <ol><li>単一の色の染色を設定し、次の表にしたがってミックス。 注意：染色のアイソタイプコントロール抗体の終濃度は、一次抗体の彼らはのための制御であることと一致していなければなりません。抗Sca - 1が1μg/106セルに使用されている場合例えば、、その対応するアイソタイプは、同じ濃度で使用されている必要があります。 <table border="1"><tbody><tr><td>チューブ＃ </td><td>チューブの名前</td><td>会社</td><td>猫＃ </td><td>クローン</td><td>アイソタイプ</td><td>希釈</td></tr><tr><td> 1 </td><td>非染色</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Hoechst33342 </td><td>シグマ</td><td> B2261 </td><td></td><td></td><td> 2-5ug/ml </td></tr><tr><td> 3 </td><td> PI </td><td>シグマ</td><td> P4864 </td><td></td><td></td><td> 1ug/ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> 4 </td><td rowspan="2"> CD31 - FITC CD45 - FITC </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 11-0311-85 </td><td> 390 </td><td>ラットIgG2a </td><td> 500 </td></tr><tr><td>ハウスは作ら</td><td></td><td> I3 / 2 </td><td>ラットIgG2b </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> SCA1 - PECY7 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 25-5981-82 </td><td> D7 </td><td>ラットIgG2a </td><td> 5000 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> α- 7 APC </td><td>ハウスは作ら</td><td></td><td> R2F2 </td><td>ラットIgG2b </td><td> 1000年</td></tr></tbody></table></li><li>アイソタイプコントロール染色には、次の表を使用して混在させる設定します。 <table border="1"><tbody><tr><td>チューブ＃ </td><td>の名前 チューブの</td><td>ヘキスト</td><td> PI </td><td> CD31 - FITC </td><td> CD45 - FITC </td><td> SCAL - PE - CY7 </td><td> -7 - APC </td><td>ラット、 IgG2b - APC </td><td>ラット、 的なIgG2a - pecy7 </td><td>ラット、 的なIgG2a - FITC </td><td>ラット、 IgG2b - FITC </td></tr><tr><td> 7 </td><td> ISO - CD31 / CD45 </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> 8 </td><td> ISO - SCAL - pecy7 </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 9 </td><td> ISO - α- 7 - APC </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table></li><li>ステップ20から適切なエッペンドルフチュー​​ブにピペットで単一色と同位体制御の染色ミックスを（我々は通常ミックスを染色の5〜10μLを各サンプルに追加されているので、抗体の濃度を調整する）。よく混和して、1時間氷上でインキュベートする。 </li></ol></li><li> FACSの細胞選別のための抗体のカクテル（下）の800μLを持つサンプルのマウスから細胞を染色。よく混和して、1時間氷上でインキュベートする。 抗体のカクテル：ヘキスト、PI、CD31 - FITC、CD45 - FITC、SCA1 - PECY7、α- 7 APC 注意：重要な違いがバッチ間に存在する可能性があるため、細胞への抗体の最適比は、個別に各抗体を滴定によって決定される必要があります。使用する抗体の最適量は10 6の標的細胞当たりの抗体のμgsで発現し、抗体の同じバッチを使用する際に一定に保つ必要があります。明らかに、標的細胞の数は、実験間で著しく変化しない場合、または染色液は細胞の数を拡大縮小する場合、各抗体の固定希釈にも使用することができます。 </li><li>洗って：9コントロールチューブの各々にFACS緩衝液の約1mLの追加、サンプルチューブにFACS緩衝液の約20mlのを追加。 </li><li> 5分間エッペンドルフチュー​​ブ@ 3000rpmのを遠心（エッペンドルフベンチトップ遠心機、モデル：5417C）。サンプルチューブを5分間@ 1600rpm（：5810Rエッペンドルフのベンチトップ遠心機、モデル）心する。 </li><li>すべてのチューブから上清を吸引して捨てます。 </li><li> FACS緩衝液（コントロールの各1mLの、ソートサンプルの4mlの）に再懸濁し、細胞は、"FACSチューブ"セルストレーナーキャップを通して（BDファルコンの猫＃352235、40μmの孔径）にピペットの細胞は、本資料の残りの塊を除去するサイトメーターに影響を及ぼす。 </li><li>単一のカラーコントロールおよびアイソタイプコントロールによるFACSソーターを設定します。 </li><li>別々に3.5mLの収集バッファー（95％DMEM、5％FBS）で、次の表にしたがってソートされた細胞を集めます。通常は、両方の後肢を収穫するときに、単一の野生型のマウスは95％以上の生存率で、15万筋前駆細胞または100,000脂肪細胞前駆細胞について得られることができる、などの手続きの終わり（図1をFACSで再測定し選別された細胞で判断） 表面染色に基づいて、筋原性と脂肪細胞前駆細胞の定義 <table border="1"><tbody><tr><td>抗体/染色</td><td>筋原性前駆細胞（MP） </td><td>脂肪生成前駆細胞（AP） </td></tr><tr><td>ヘキスト</td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> PI </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD31 - FITC </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD45 - FITC </td><td>- </td><td> - </td></tr><tr><td> SCA1 - PECY7 </td><td> - </td><td> + </td></tr><tr><td> α- 7 APC </td><td> + </td><td> - </td></tr></tbody></table></li></ol> 4。移植： <ol start="28"><li> @ 1500RPMで5分間、オートクレーブエッペンドルフチュー​​ブ（1.5 mL）に上清および転送細胞を除去ソートした細胞を遠心、5分間@ 3000rpmのを遠心分離し、滅菌PBS（血清フリー！）の500μLで細胞をリンス。滅菌条件下で、すべての試薬 ​​を維持し、組織培養フードで働いて、約10 6細胞/ mLのPBSで筋原性前駆細胞、またはマトリゲルで脂肪細胞前駆細胞（BDの猫＃354234）を懸濁します。 </li><li>レシピエントマウスに筋原性前駆細胞または脂肪細胞前駆細胞を移植。 <ol><li> isoflouranはあなたの機関のポリシーにしたがってマウスをAnaesthetize。 </li><li>注入領域の周りの毛を剃る、その後70％エタノールでこすって皮膚を消毒する</li><li> 3月10日CCのインスリン注射器（BDの猫＃309300）を使用して、筋原性前駆細胞または脂肪細胞前駆細胞（= 20K細胞）の20μLを注入する。 </li></ol></li><li>適切な時間（3週間も動作しますが、ドナー由来のトランスジェニックマーカーを発現する筋線維は、移植後一週間以内に通常明らかである）の後に、（Sigmaカタログ＃T04840 - 2、400μLAVERTINの腹腔内注射することにより、ステップ29からのレシピエントマウスをanaesthetize 25 mg / mL）は、その後、4％PFAの15mlのに続いて50mLのPBS（EDTAの10μMを含む）最初の、とtranscardially灌流。必要に応じて、一晩20％ショ糖に転送し、一晩4％PFAで標的組織、ポストフィックスを収集する。 OCT、凍結および凍結切片に埋め込みます。 </li></ol> 5。代表的な結果： MPがマウス骨格筋に移植されると、彼らは容易に既存の筋線維と融合。したがって、ドナー細胞中に存在する遺伝子のラベルは、それを受信した繊維で容易に検出可能となります。図2に移植された細胞は、ヒトアルカリphostphataseを発現する組織化学的に明らかにした例を示しています。 APが移植されている場合、結果は移植部位の環境に大きく依存しています：（図2参照）これらの細胞は脂肪細胞や筋線維芽細胞に起源を与える皮下移植したとき。脂肪変性は3を誘導されていない限り、筋肉を含む他の多くのサイトで、で、彼らは生きていけない。 <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。骨格筋からの前駆細胞集団の分離のための戦略をソート （）戦略ソート：生存細胞は前方散乱と側方散乱に基づいて同定されたが。ヘキスト染色は、死細胞を除外するために無核の残骸とヨウ化プロピジウム（PI）染色を除外するために使用されました。造血（CD45）と内皮（CD31）の細胞をソーティングゲートから除外した。 α7+ヘキスト+ PI - CD45 - CD31 - SCAL -サブセットは、すべての筋原性前駆細胞（MP）が含まれています。 SCAL +ヘキスト+ PI - CD45 - CD31 - α7 -人口は、脂肪細胞前駆細胞（AP）が含まれています。 （B）蛍光マイナスワン（FMO）アイソタイプコントロール染色の特異性を確認する。 （C）純度は、ソート後のMPとAPのサブセ​​ットをチェックします。 <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 MPとAP移植後の代表的な結果。APは、皮下に移植（上部パネル）とMP筋肉内（下部パネル）された。どちらの場合も、ドナー細胞は、茶色の染色によって同定された遺伝子組換えヒトアルカリホスファターゼを発現するマウス由来。

<ol><li>Buckingham, M., Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle stem cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).</li>
<li>Relaix, F., Marcelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).</li>
<li>Joe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors%3A+A+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Cycle. 9, (2010).</li>
<li>Sherwood, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119, 543-554 (2004).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. , (2008).</li>
<li>Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309, 2064-2067 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルの目的は、高収率および精製した細胞の高い生存の間に合理的なバランスを取ることです。健康な細胞を回収されていることを確保する上で最も重要なステップは、予想通り、出発組織の酵素的解離です。組織の取扱いは、デモンストレーションや視聴覚の形式でも鑑賞するのは困難である、特に穏やかなはずです。もう一つの重要な要素は、プロシージャの長さです。もはやそれは、したがって、より低い生存率と、生着効率、ドナーからレシピエント動物に移動されます。すぐにソートした後、精製した細胞サンプル中のPI肯定的な出来事の頻度を見ることによって応答されていない実行可能性についての質問があるはず、私たちはclonogenicityを測定するために限界希釈アッセイは3を実行されることを示唆している。無傷の筋肉からの典型的なソートは、日常的にin vitroでの筋原性または線維/脂肪細胞コロニーを開始することのできる15から20まで細胞内で約1が得られる。国会議員から開始されたコロニーの本質的に100％は差別化された筋管を含んでいますが、FAPSから得られたコロニーの約3分の1は、平滑筋アクチン正の筋線維芽細胞に加えて脂肪細胞が含まれています。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>コラゲナーゼII </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C - 6885、 </td><td> 500 U / mlの</td></tr><tr><td>コラゲナーゼD </td><td>ロッシュ</td><td> 11088882001 </td><td> 1.5 U / mlの</td></tr><tr><td> IIを置き換える</td><td>ロッシュ</td><td> 04942078001 </td><td> 2.4 U / mlの</td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td> BD </td><td> 352340 </td><td> 40μmの</td></tr><tr><td>セルストレーナー付きチューブ</td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> 40μmの</td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B2261 </td><td> 2月5日ug / mlと</td></tr><tr><td> CD31 - FITC </td><td> Ebiosciences </td><td> 11-0311-85 </td><td>クローン390 </td></tr><tr><td> CD45 - FITC </td><td>ホームメイド</td><td></td><td>クローンI3 / 2 </td></tr><tr><td> SCA1 - PECY7 </td><td> Ebiosciences </td><td> 25-5981-82 </td><td>クローンD7 </td></tr><tr><td> α- 7インテグリンAPC </td><td>ホームメイド</td><td>ロッシラボにお問い合わせ</td><td> R2F2 </td></tr></tbody></table>

骨格筋からの前駆体の精製

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

骨格筋は、別個の胚起源と発達の可能性の複数の前駆細胞集団が含まれています。筋原性前駆細胞、通常ensheathsそれは、単に筋系統の1,2にコミットしている自己複製細胞であること。筋線維形質膜とラミニンが豊富な基底膜の間に&quot;人工衛星細胞の位置&quot;に常駐している我々は最近、効率的に増殖を入力して、損傷に応答し、組織再生3,4中に筋原細胞への栄養サポートを提供する筋線維芽細胞と白色脂肪細胞を生成することができる容器関連する前駆細胞、第二のクラスを記載している。特定の細胞集団の発達と再生の可能性を判断する最も信頼されるアッセイの一つは、彼らの分離および5-7移植に依存しています。この目的のために我々はこの記事で概説する酵素的に解離した筋肉からのフローサイトメトリー、で、その精製のためのプロトコルを最適化してきました。この方法を用いて得られた個体群は、筋原性または線維/脂肪細胞コロニー形成細胞のいずれかが含まれます：他の細胞型は、in vitroで拡大またはin vivoでの配信で生き残ることができるではありません。ただし、これらの集団は、1つは、新しくソートされたサブセットは、コロニーを形成するか、受信者の生着の能力を欠いている他の汚染物質の細胞を含んでいる可能性があることに留意する必要が分子解析のためのソート（例えば定量RT - PCR）の直後に使用されています。

酵素的解離、線維/脂肪細胞とマウス骨格筋からの筋原性前駆細胞のフローサイトメトリーによる表面標識および精製方法。

骨格筋には、異なる胚由来と分化能を持つ複数の前駆細胞集団が存在する。通常、...に留在する筋原性前駆細胞は、

本実験の全体的な目的は、鏡像的な骨格筋から生存可能な筋原性および脂肪原性前駆細胞を単離することです。まず、安楽死させたマウスから筋肉組織を採取します。次に、サンプルを酵素消化することで、組織を単一細胞に解離させます。次に、前駆細胞を単離するために、蛍光活性化細胞選別（FACS）を用います。単離した細胞をレシピエントマウスに移植し、遺伝子ラベル（本例ではヒトアルカリホスファターゼ）の組織化学的染色に基づいて、単離細胞の生存能および分化能を示す結果を得ます。PREPLなどの既存の技術に対する本手法の主な利点は、異なる時点において動物から直接細胞を単離できることです。例えば、組織損傷を誘導した後では、細胞集団に選択圧がかからないため、細胞集団を分子レベルで解析し、生体内再生の過程で細胞が通過するさまざまな段階を調べることが可能です。したがって、この手法は組織再生分野における重要な問い、特に、生体内再生において各細胞型がどのような役割を果たし、これらの細胞型がどのように相互作用して健康な組織を再構築するのかという問いに答えるのに役立ちます。この手法の意義は、筋ジストロフィーなどの疾患の治療にまで及びます。これらの前駆細胞の研究は、最終的にこの種の疾患に対する再生戦略を可能にするためです。さらに、この手法の意義は心臓から脂肪組織に至るまで多くの他の組織に及びます。なぜなら、少なくとも線維脂肪前駆細胞は、これまでにテストしたすべての組織で発見されているからです。一般的に、この手法を初めて行う方は苦労されるでしょう。激しい解離手法を用いると細胞生存率が低下し、過剰なデブリが発生するため、その後の細胞のクリーンな分離を妨げることになります。我々がこの手法を考案したのは、通常APOE細胞に使用されるフローサイトメトリーを、固形組織内の幹細胞研究に応用しようと考えたときでした。組織解離のステップは適切に記述することが非常に困難であり、習得しにくいため、この技術を視覚的に提示することが重要です。本技術の実演は、この手法を最初に開発し最適化した私の研究室のリサーチアシスタントであるlinkyが行います。この手順には、少なくとも2匹のマウスが必要です。1匹のマウスを細胞用に使用して、解析に必要なシングルカラーおよび抗体アイソタイプコントロールを用意し、もう1匹をソート用のサンプルとして使用します。まず、事前に安楽死させた7週齢から12週齢のマウスを、滅菌済みのラボ用フード内で用意します。安楽死させたマウスを滅菌ペーパータオルの上に仰向けに置き、片手にピンセット、もう片手に鋭利なハサミを持ち、汚染を防ぐために被毛に70% ethanolを十分にスプレーします。腹部の皮膚を持ち上げ、小さく縦に切開します。切開線の両側の皮膚をつかみ、皮膚を剥いで後肢の筋肉を完全に露出させます。次に、閉じた状態のハサミを筋肉の下、脛骨の上に挿入し、ハサミを開くことで筋肉組織を切り出します。ブレードの背面を用いて、筋肉を脛骨から慎重に剥離させます。脛骨の両側でこの操作を繰り返し、組織を60 mmのペトリ皿に入れます。同様の手順で大腿骨から筋肉組織を切り出し、ペトリ皿に加えます。マウス1匹につきペトリ皿1枚を使用し、各マウスで同様に繰り返します。次に、組織を単一細胞に解離させます。筋肉組織が入った各ペトリ皿に、2 mL（または1000 units）のコラゲナーゼと、20 µLの250 mM塩化カルシウムストック溶液を加えます。その後、迅速かつ慎重に作業を行います。1本の鋸歯付きピンセットと、もう1本の2歯付きピンセットという2本のグレーのピンセットを使用して、組織を1 mm³の破片に切り分けます。非筋肉組織を可能な限り取り除き、廃棄してください。ペトリ皿に蓋をし、37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、皿を取り出し、滅菌済みラボフードに戻します。3 mLシリンジからプランジャーを取り外し、それを用いて組織をすり潰します。交差汚染を避けるため、プレートごとに1本のプランジャーを使用してください。各ペトリ皿に冷やした滅菌PBSを約5 mL加え、皿の内容物を50 mLコニカルチューブに移します。さらに5 mLのPBSで洗浄してすべての組織を回収し、コニカルチューブに加えます。プロトコルに従い、サンプルを3回洗浄し、遠心分離します。次に、コラゲナーゼD dys space 2と塩化カルシウムを含む溶液を各チューブに1 mL加え、37 °Cで1時間回転させながらインキュベートします。インキュベーション後、チューブに冷やした滅菌済みPBSを5 mL加え、短時間ボルテックスした後、凝集塊を解離させるために数回トリチュレーションを行います。チューブにPBSを満たしてよく混ぜ、氷上に置きます。組織の大きな破片を取り除くため、氷上の50 mLコニカルチューブに40 µmのセルストレーナーを設置し、細胞懸濁液をろ過します。ろ過液を、冷やした滅菌済みPBSを満たした3本の50 mLコニカルチューブに均等に分注し、8 °Cで1600 RPMにて5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を慎重に除き、筋原性および脂肪原性前駆細胞の染色およびソートを行うため、細胞を氷上に置きます。まず、付属の書面プロトコルに従って、6種類の単色染色混合コントロールを準備します。これらのコントロールには、染色なし、hulk stain、propidium iodide、CD 31およびCD 45のFSE標識抗体、SC one P size 7標識抗体、およびalpha 7 A PC標識抗体が含まれます。次に、書面プロトコルに従って、3種類の抗体アイソタイプコントロール染色混合物を準備します。染色ミックスを調製したら、単色染色およびアイソタイプコントロールサンプルのための1.5 mLエッペンチューブ9本にラベルを貼ります。3本のコニカルチューブ内の細胞を再懸濁し、合計1 mLのFACSバッファーで合わせます。次に、ラベルを貼った各コントロール用エッペンチューブに細胞を100 µLずつ分注し、抗体濃度に応じて5〜10 µLの染色ミックスを対応するコントロールチューブにピペッティングします。サンプルマウスから得られた細胞を200 µLの FACSバッファーで再懸濁し、50 mLコニカルチューブのいずれかにまとめます。次に、抗体カクテル800 µLを添加します。コントロールチューブおよびサンプルチューブのそれぞれを混合してください。氷上で1時間インキュベートします。インキュベーション後、9本のコントロールチューブそれぞれに1 mLのFAXバッファーを、サンプルチューブに約20 mLのFAXバッファーを加えて細胞を洗浄します。コントロールの遠心管を3000 RPMで5分間遠心分離します。サンプルのコニカルチューブを1600 RPMで5分間遠心分離します。その後、遠心分離後の上清を吸引して廃棄します。コントロール細胞は各エンドルフチューブ内で1 mLのfaxバッファーを用いて再懸濁し、サンプル細胞は4 mLのfaxバッファーを用いて再懸濁します。サンプル細胞、アイソタイプコントロール、およびPI単色コントロールチューブにプロピジウムヨードを加えます。サイトメーターに影響を及ぼす可能性のある残存凝集塊を除去するため、セルストレーナーキャップを用いて細胞をFACSチューブにピペットで移します。シングルカラーおよびアイソタイプコントロールを用いて、フローサイトメーターの設定を行います。付属の書面プロトコルに従ってサンプル細胞をソートし、各集団を個別に回収します。回収には3.5 mLの回収チューブを使用してください。生存 myogenic progenitors は、CD135+、α7-integrin+であり、かつPI-、CD31-、CD45-、Sca-1-である集団です。One PE size seven 陰性かつ生存可能な脂肪前駆細胞は、hulkedかつska one PE size seven 陽性、ならびにpi CD 31 FE CD 45 FEおよびalpha seven a PC 陰性です。野生型マウス1匹から、約1×10⁵個の脂肪前駆細胞と、生存率95%以上の1.5〜2×10⁵個の筋前駆細胞が得られます。宿主マウスへの移植に向けて細胞を準備するため、細胞の洗浄を行います。まず、変形した細胞を1500 RPMで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を500 µLのPBSで再懸濁させ、エッペンチューブに移します。チューブを3000 RPMで5分間遠心分離し、上清を除去します。次に、筋原性前駆細胞をPBSに、または脂肪原性前駆細胞をMatrigelに、約10⁶ cells/mLの濃度で再懸濁します。記載されたプロトコルに従って、各ドナー細胞型に対応する麻酔済み宿主マウスを準備した後、0.3 cm³のインスリン用シリンジを用いて、筋原性または脂肪原性前駆細胞（約20,000 cells）を20 µL注入します。移植した細胞が分化するまで、通常は約3週間という適切な時間を置きます。その後、標的組織を分離し、本図のプロトコルに記載されている通りに凍結切片作成の準備を行います。分取戦略により、脂肪前駆細胞および筋前駆細胞を分離することを実証しました。前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）に基づいて生存細胞を特定し、Hoechst染色を用いて核の残渣を除外しました。また、プロピジウムイオダイド（PI）染色を用いて死細胞を除外しました。さらに、造血細胞（CD45陽性細胞）および内皮細胞（CD31陽性細胞）をそれぞれ分取ゲートから除外しました。最終的に、α7陽性のサブセットを分取します。SKA1陰性分画にはすべての筋原性前駆細胞およびα7陰性の細胞集団が含まれます。SKA1陽性分画にはすべての脂肪原性前駆細胞が含まれます。蛍光マイナス1アイソタイプコントロールにより、染色の特異性を確認しました。さらに、脂肪原性および筋原性サブセットの純度検定を行いました。この代表的な例において、皮下注射されたトランスジェニックヒトアルカリホスファターゼを発現する脂肪細胞系前駆体ドナー細胞は、組織化学染色による茶色の染色によって宿主組織内で同定できます。また、筋細胞内注射されたトランスジェニックヒトアルカリホスファターゼを発現する筋原性前駆体ドナー細胞は、この組織切片において茶色に示されるように同定されました。組織化学的手法を用いて。この技術に習熟すれば、適切に実施した場合、5時間で完了させることができます。処理するサンプル数が増えれば、時間はさらに増加します。本手順を遂行する際は、迅速かつ慎重に作業することが重要です。したがって、一度に大量のサンプルを処理することは避けてください。処理時間が長くなると、本手順後の細胞の多様性が大幅に低下します。また、これらの前駆細胞が分化後に生体内でどのように損傷に反応するかといった追加の疑問を解決するために、定量的R-T-P-C-Rによるcolono SC OG発現解析などの他の手法を用いることも可能です。この手法は、組織再生分野の他の研究者が、損傷組織内の前駆細胞間のクロストークを探索するための道を切り開きました。このビデオを視聴することで、組織を損傷させることなく解離させる方法について十分に理解できるはずです。前駆細胞は、その表面マーカーに基づいて同定され、生体内における分化能が解析されます。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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筋衛星細胞の単離、培養、および移植

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基礎脊椎動物の系統からの一次筋原前駆細胞/筋芽細胞培養液の調製

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成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

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ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

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骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

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In vitro 筋形成研究のための骨格筋サテライト細胞の単離

学ぶマウス骨格筋からの前駆細胞精製法。FACSを用いて筋原性・脂肪原性前駆細胞を分離し、組織再生における細胞相互作用と分化能を解析する手法です。再生医療研究に応用可能です。

骨格筋からの前駆体の精製

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