dsRNAをインジェクションによるRNAiの干渉にショウジョウバエ胚

この手順の目的は、ショウジョウバエの胚に二本鎖RNAを注入して内在性遺伝子の発現をノックダウンし、器官の発達に必要な遺伝子を特定することです。まず、胚を回収し、直線状に並べます。次に、注射針を準備し、胚に二本鎖RNAを注入します。

最後に、胚を湿潤チャンバーに入れ、発生させます。最終的に、後期胚の抗体染色、または明視野顕微鏡下での幼虫の観察により、ショウジョウバエの気管分枝融合の欠損を示す結果を得ることができます。器官形成に必要な遺伝子を特定するための順方向遺伝学的スクリーニングなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、当該遺伝子の変異体が利用可能になる前に遺伝子機能を解析できる、比較的簡便かつ迅速な逆方向遺伝学的アプローチであることです。

この手法は、D気管系の発達に必要な重要遺伝子の特定など、発生生物学分野における主要な疑問の解明に役立ちます。これは、脊椎動物の気道、循環器系、腎管、および探索的上皮などの哺乳類器官の形態形成を研究するための優れたモデルとなります。一般的に、この手法に不慣れな方は、胚の整列、針の折断、胚へのストランドRNAの注入といった操作の習得に時間を要するため、苦労することがあります。

胚によって注入する二本鎖RNAの量が異なるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。また、シンシチウム胚（合胞体胚）の外見を文章のみで説明することは困難です。シンシチウム胚に適切な量の二本鎖RNAを注入することは、内因性遺伝子の発現を効果的にノックダウンさせるための極めて重要な工程であるため、これらの手順を習得することは容易ではありません。

まず、2〜4日齢のW1118個体を使い、25°Cでケージを準備します。1〜2日間にわたって卵収集を同期させるため、日中は1時間ごとにブドウジュース培地を交換してください。収集前、25°Cで1時間、シンシスト（syn city）またはブラストダーム（blaster derm）胚を収集します。長方形のブドウジュースアガールを用い、カミソリでアガールの中央に軽く線を引きます。

金属プローブを使用して、胚をグレープジュースプレートからグレープジュースアガーの断片へと転移させます。アガーの中央に、胚の長軸がラインに対して45度の角度になるように、約50個の胚を直線状に並べます。すべての胚が同じ方向を向き、後端がラインから離れる方向を向いていることを確認してください。

両面テープを長方形に切り、18 by 18 millimeterのカバーガラスに貼り付けます。カバーガラス上のテープを使用して胚を回収します。その後、カバーガラスをガラススライドの上に置きます。

胚を両面テープに軽く押し付け、約10分間自然乾燥させます。胚を700 haloカーボンオイルの薄い層で覆います。顕微鏡下で胚が透明になるまで、約10分間待ちます。

ガラスキャピラリー管を延伸することで、マイクロインジェクション用の針を作製します。World Precision Instruments社のニードルプラーを使用し、プログラム設定をHeat 1、Delay 4、Backで設定します。

Einor P 20ピペットとeinor micro loaderチップを用いて、2 µLの二本鎖RNAを針に充填します。清潔なカバーガラスを載せたスライドガラスを用意し、それらをテープで固定します。充填した針をカバーガラスの端に当て、鋭い先端を作ります。

二本鎖RNAがニードルチップから漏れ出します。ピコポンプのフットペダルを押し下げながら、スライドの中央にオイルを1滴垂らして準備します。そのオイル滴の中にニードルを挿入してください。

フットペダルを押した際に、ピコポンプから100～200 picolitersの二本鎖RNAが排出されるように設定を調整します。二本鎖RNAは、小さな液滴として確認できます。

最初の胚の後方に針先を置き、ピコポンプのフットペダルを押します。注入部位に二本鎖RNAが小さな点として現れます。

スライド上の胚への二本鎖RNAの注入を完了させます。 blastoderm（胞胚）段階に至っていない胚はすべて除去してください。カバーガラスを、プラスチック製ペトリ皿などの蓋付き加湿チャンバーに入れ、胚が目的の胚期または幼生期に達するまで18 °Cで保持します。

目的の胚ステージまで発育した胚について、プローブを用いて両面テープから胚を取り除き、カバーガラスの端まで移動させます。ヘプタンを用いて胚を洗い流し、底面にナイロンメッシュを備えた回収バイアルに回収します。胚をPBTで3回洗浄し、50%漂白剤で5分間処理した後、再びPBTで3回洗浄します。

ピペットを使用して、胚を回収用バイアルからナイロンメッシュに移し、ナイロンメッシュを固定液に浸します。胚を30分間固定します。固定液の下層を取り除きます。

その後、メタノールで固定します。胚をエッペンドルフチューブに移し、目的の幼生段階まで成長した胚に対する標準的な抗体染色プロトコルを用いて、2つのA 12およびdiffusion抗体で免疫染色を行います。スライドの中央にハロカーボン700オイルを1滴落とし、オイルドロップの両側に小さなカバーガラスを2枚用意します。幼生1匹をスライドに移し、オイルドロップの上にカバーガラスを被せます。

明視野顕微鏡下で幼虫を観察します。ここでは、拡散させた二本鎖RNAおよびGFP二本鎖RNAの注入による代表的な結果を示します。

GFP二本鎖RNAを注入した胚は、正常な気管の融合を示し、融合細胞には拡散タンパク質が存在しています。矢印は側方体幹の拡散陽性融合細胞を指し、アスタリスクは正常な融合部位を示しています。

しかしながら、拡散タンパク質の二本鎖RNAを注入した胚では、気管枝の融合不全が見られ、融合細胞に拡散タンパク質は存在しません。三角形は、二本鎖RNAを注入した胚が幼虫期まで成長した際の、気管枝の融合不全部位を示しています。G-F-P-R-N AI幼虫では、アスタリスクで示されるように、正常な気管枝の融合が見られます。

一方で、diffusion RNAi幼虫では、三角形で示される枝の融合不全が認められました。これらの結果は、ショウジョウバエ胚への二本鎖RNA注入による内因性diffusion遺伝子発現のノックダウン効果を示すものです。この手順を行う際は、発生後のすべてのenseal blaster胚を殺処分することを忘れないでください。

この手法は、発生生物学分野の研究者が、ショウジョウバエの器官形成に関わる新規遺伝子の機能を探索するための道を開きました。このビデオを視聴することで、二本鎖RNAをショウジョウバエの胚に注入し、内因性遺伝子をノックダウンする方法について深く理解できるはずです。