3D神経幹細胞培養におけるローカライズたんぱく質：ハイブリッド可視化手法

脳の神経新生ニッチから単離された神経前駆細胞は、浮遊培養条件下で増殖し、ニューロスフィアを形成します。本ビデオでは、三次元的なニューロスフィア内におけるタンパク質発現部位を特定するため、生後期の海馬由来の遊離浮遊ニューロスフィアの単離および連続切片作成法を示します。ここでは標的タンパク質としてConnexin 29の免疫染色を行い、続いて二次元顕微鏡画像をアセンブリおよび変換することで、ニューロスフィアの三次元再構築を行います。

遊離したニューロスフィアや組織などの天然の三次元構造におけるタンパク質の可視化により、構造内での位置に基づいたタンパク質機能のより深い理解が可能になります。また、局在は分かっているが機能が不明なタンパク質について、その機能的な規則性を推論することも可能になります。こんにちは、オタワ大学神経再生研究室のSophia Amboです。そして、オタワのカールトン大学カールトン・イマーシブ・メディア・スタジオのNicholas Valenzuelaです。

本日は、海馬由来の出生後神経前駆細胞をニューロスフィアとして単離、増殖させ、連続切片を作成する方法を実演します。免疫染色によるタンパク質発現の局在化を確認するため、免疫染色後に得られたニューロスフィア連続切片の2次元画像を用い、3次元構造における細胞およびタンパク質の位置を再構築し、それによってニューロスフィア全体におけるタンパク質発現の空間的組織化を評価する方法について解説します。それでは始めましょう。

脳を採取した後、脳が適切に固定されるよう、平らな面を作ってチャックに配置する準備をします。これをブロッキングと呼びます。カミソリとピンセットを使用して、小脳をブロッキングしてください。

次に、チャックの上に瞬間接着剤を1滴落とし、1つ目の脳を、前方側を上に、背側を自分に向けるようにして固定します。他の脳についても同様に進めます。最後の脳については、この方向への切断が不完全な場合があるため、背側を自分とは反対側に配置するのが賢明です。切断が不完全な場合は、メスを用いて切り切り、切片を回収してください。

脳を長時間空気にさらすことはできないため、接着工程では迅速さが不可欠です。すべての脳を接着した後、チャックをバイブラートに設置し、ホルダーに氷冷したCSFを満たします。

バイブレータの周波数を8.5に、速度を3.5から4.5に設定します。ブレードをA CSFに接触させ、オートカットを設定します。これで、500 micronの切片を作成します。

海馬を含むスライスを保持します。それらを氷冷したA CSFを満たしたディッシュに入れ、残りのスライスは廃棄します。すべてのスライスを回収後、海馬の解剖に進みます。

実体顕微鏡を用いて、bgmaから約-1.65 mmから-2.10 mmの間にある背側海馬のみを採取します。採取した海馬を、氷冷した空のディッシュに入れます。スライスからすべての海馬を回収したら、機械的解離を行うためにフローフードへ移動させます。

メスを使用し、メス刃に70%ethanolをスプレーして火炎滅菌します。組織が液状に見えるまでメスで切断します。次に、papain、DNase、および神経プロテアーゼをあらかじめ含む解離溶液を用いて、ピペッティングにより組織を回収し、15 mLチューブに移します。

酵素的解離を行うため、チューブを37°Cに設定した回転式インキュベーターに入れ、45分から1時間消化させます。消化が完了したら、10 mLの滅菌組織培養用PBSを加えて酵素反応を停止させ、300 ×gで5分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを再懸濁します。

5 mLのPBS中で、パステールピペットを用いてサンプルをピペッティングし、組織をさらに解離させます。組織片がそれ以上小さくならないまでピペッティングを繰り返します。その後、再び細胞をペレット化します。

PBSを除去し、ペレットを3 mLの維持培地で再懸濁します。その後、サンプルを十分にトリチュレーションしてください。15 µLのアリコートを分取し、同量のトリパンブルーと混合します。

10 µLのサンプルを2つ用意し、細胞計数用のヘモサイトメーターに充填します。各セクションの3つの視野から細胞を数え、計6つの視野を測定します。これらの数値を平均して、細胞密度を算出します。

サンプルが希釈されていることに留意してください。トリパンブルーで染色後、細胞を低接着ディッシュに、1ディッシュあたり2.5 × 10⁵ cellsの密度で、最終容量5 mLの維持培地を用いて播種します。低接着ディッシュが利用できない場合は、ペトリ皿を使用してください。

この場合、培養開始後の最初の6日間は、ニューロスフィアがディッシュの底に付着しないよう、毎日午前と午後の2回タッピングする必要があります。ディッシュをインキュベーターに入れる前に、EG、F、およびFGFを添加してください。これらの成長因子は、培養期間全体を通して2日ごとに補充する必要があります。in vitro 14日目に、ホルムアルデヒドを培養液に直接加え、最終濃度を約4%にして、室温で20分間インキュベートしてニューロスフィアを固定します。

300 ×gで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。PBSで細胞を2回洗浄し、10 mMリン酸緩衝液で調製した15～20%ショ糖溶液に再懸濁します。クライオスタットで切片を作成する前に、4 °Cで少なくとも24時間置いて凍結保護を行います。

凍結保護されたニューロスフィアを冷蔵庫から取り出し、60 mmディッシュに移します。すべての切片を収集することが極めて重要な連続切片作成においては、実体顕微鏡を用いてサイズと形状の良いニューロスフィアを選択するのが最適です。ピペッターを用いて、OCTコンパウンドを満たしたクライオモールドにニューロスフィアを配置します。ニューロスフィアが配置された位置をクライオモールド上に印付けします。

この工程は、切片作成時にニューロスフィアを特定しやすくするためのものです。5〜10個のスフィアを迅速にモールドに配置した後、CO2を用いて凍結させます。クライオモールドの指標に従い、ニューロスフィアが配置されている位置を凍結したOTCブロックに直接的にマークしてください。

OCTブロックを型から取り出し、クライオスタットのチャック上に置きます。CO2を用いて型をチャックに固定し、クライオスタット内に設置します。サンプルを少なくとも30分間静置し、温度を平衡化させます。

これが完了したら、モールドに付けた印まで素早くカットし、それ以降のすべてのセクションを回収し始めます。光学顕微鏡を用いて、ニューロスフィアのスライスがどこから始まっているかを確認します。セクショニングが完了したら、免疫化学染色を行うまでスライドを冷凍庫で保存してください。このステップでは、連続切片として作製したニューロスフィアのうち、目的のセクションを含むスライドと、その前後5枚ずつのセクションを含むスライドを取り出します。

これにより、ニューロスフェア全体をイメージングすることが可能になります。ニューロスフェアのすべての切片を特定するためには、核の対比染色の実施が必須となります。そのため、免疫染色の計画を立てる際にこの点に留意してください。スライドにPBSを適用し、少なくとも5分間室温に戻します。透過処理のために0.3% Triton X 100を含み、ブロッキングのために3% 牛血清アルブミンを含む抗体バッファーを使用します。

一次抗体をこのバッファーで適切に希釈し、4°Cのヒューマンチャンバー内で一晩インキュベートします。PBSを使用してパラホルムをニューロスフィアから浮かせて、ピンセットで慎重に取り除きます。これが、5分間のPBS洗浄4回のうちの1回目となります。

二次抗体をスライドに適用し、室温で1時間インキュベートします。前回と同様に、PBSを用いてパラフォームをスライドから浮かせて剥がし、ピンセットで除去します。これが、5分間のPBS洗浄4回のうちの1回目となります。

3回目の洗浄では、核対比染色として0.5 µg/mLに希釈したHOS 3 3 2, 5 8を使用します。HOSによる洗浄の後、PBSでさらに5分間洗浄します。すべての洗浄が完了したら、スライドの底部に封入剤を十分量滴下し、ガラスカバーガラスで覆います。

ネイルポリッシュで四隅を固定します。すべてのスライドにカバーガラスを被せたら、残りの縁を固定します。すぐに撮影するか、撮影の準備が整うまで-20°Cで保存してください。

イメージングにおいて、スライド上の細胞を見つけることが最も困難な工程となります。核のカウンターステインを用いて探索することで、スフィアに属する細胞を容易に検出できます。数個の細胞のみで構成されている場合があるニューロスフィアの起点を見つけたら、それ以降のすべてのセクションをイメージングしてください。核染色の画像、目的のタンパク質（または複数のタンパク質）の画像、および位相差像を撮影します。

この位相差顕微鏡画像は、モデリング段階において非常に重要となります。Open Lab 3.56ソフトウェアで設定した10 µmおよび50 µmのスケールバーを含む画像を、標準キャンバスサイズ3,300 × 2,550ピクセルのPhotoshop CS4にインポートします。

すべての連続切片画像は、標準のキャンバスサイズを維持した状態でTIFFファイルとして保存されます。ニューロスフェア連続切片の第1相および第2相のコントラスト画像を開きます。「画像」タブで2番目の切片の透明度を上げ、「画像の回転」を開き、「任意」を選択します。

画像間で幾何学的および構造的な連続性が確認できるまで、2枚目のセクションを回転させます。すべての連続切片に対してこの操作を繰り返し、各セクションを個別のレイヤーとして保存します。位相差画像とタンパク質発現に対応する各画像レイヤーをリンクさせ、各チャネルのすべての回転が同時に行われるようにしてください。

MayaのステータスラインにあるPhotoshopファイルの比率と同じ平面を作成します。メニューバーをデフォルトのAnimation設定からSurfacesに変更します。球体を選択し、プリミティブのサブディビジョン・スフィアを使用して細胞体を作成します。

オブジェクトを右クリックしてマーキングメニューから「vertex」を選択し、頂点の操作を開始します。さらに、メインメニューの「subdivision surfaces」タブにあるマーキングメニューからディスプレイレベルを変更し、球体の表面を精細化します。「collapse hierarchy」オプションボックスを開き、レベル数を2に設定してください。

球体を折りたたみます。球体が選択された状態で、メニューバーを「サーフェス」から「ポリゴン」に変更します。メインメニューのメッシュタブから、スカルプトジオメトリツールを開きます。

セルの表面を調整し、最終的な形状に仕上げます。ツール設定タブからスカルプトジオメトリツールセットを使用してください。このプロセスを各タイプのセルで繰り返し、ニューロスフィアに存在する前駆細胞の多様性をシミュレートします。

このデモンストレーションでは、10種類の異なる前駆細胞がニューロスフィアの基礎となります。細胞のタイポロジーを選択し、そのタイポロジーの細胞を用いてフリーズ変換を行います。2つのサーフェスシェーダーを設計し、Connectin 29タンパク質を発現している細胞と、同タンパク質が欠損している細胞の両方を表現します。

メインメニューのウィンドウレンダリングエディタータブから、ハイパーシェードウィンドウを開きます。サーフェスマテリアルタブからランプシェーダーを選択します。アトリビュートエディターを開き、シェーダーの色、白熱光、アンビエントカラー、バンプマップ、およびスペキュラカラーのアトリビュートを設定します。

ブラウン運動3Dテクスチャをアンビエントカラーノードに、2Dフラクタルテクスチャをバンプマッピングノードにそれぞれ割り当てます。結果として得られたシェーダーの入力および出力接続を選択し、選択したネットワークをエクスポートします。細胞のタイポロジーを選択し、エクスポート選択オプションボックスを開きます。

ファイル形式にMaya A-S-C-I-Iを選択し、export selectionのinclude these inputsチェックボックスの選択を解除します。Adobe Photoshopで整列済み連続切片ファイルを開きます。連続切片内の各前駆細胞の位置をマークするために、鉛筆ストロークによるキーを作成します。

このデモンストレーションでは、3種類の記号（塗りつぶしの正方形、破線の正方形、および十字が入った正方形）を用いて、細胞が1つ、2つ、または3つのセクションのいずれに位置しているかを示します。

このストロークの凡例では、赤色はconexion 29を発現している細胞を、白色はConexion 29を発現していない細胞を表しています。位相差層をオンにし、各前駆細胞の中心に白い鉛筆でマークを付け始めます。マップを作成するには、セクションフォルダ内の別のレイヤーを使用してください。

各セクションを切り替えて細胞の位置を特定し、複数のセクションにまたがる細胞が適切に表記されていることを確認します。CX 29レイヤーをオンにした状態で、CX 29が陽性に発現している領域にある細胞を選択します。

Photoshopのメインメニューバーの編集タブから塗りつぶしコマンドを選択し、マップが完成した状態で白いストロークを赤に変更します。各セクションを個別のJPEG画像として、Mayaプロジェクトのソース画像フォルダに保存してください。これを行うには、まずMayaのユーザーインターフェースのステータスラインから、新しいMayaプロジェクトを作成する必要があります。

メニューバーのデフォルトのアニメーション設定をポリゴンに変更し、プレーンをインポートします。maファイルとスケールバーを操作します。プレーンを選択した状態で、projects seenフォルダからmaファイルを読み込みます。

オブジェクトを右クリックし、アトリビュートエディタの「assign new material（新しいマテリアルの割り当て）」タブを開いて、Lambertシェーダーを割り当てます。ポップアップメニューから、マテリアルのcolorアトリビュートの右側にあるチェック柄のボックスをクリックします。アトリビュートエディタのfileアトリビュートセクションにある2Dテクスチャセクションから「file」を選択します。

画像名の属性の右にあるファイルアイコンをクリックします。ソース画像フォルダーから最初のセクションを選択してください。パネルのタブを開き、ワークスペースウィンドウのカメラをパースビューからデフォルトの正投影トップビューに切り替えます。

メインメニューのメッシュタブからポリゴン作成ツールを選択し、セクションの輪郭をトレースします。ソースイメージフォルダから最初のマップを選択し、新しく作成したポリゴン平面に割り当てます。オブジェクトを選択した状態でポリゴン平面を作成する手順に従い、平面上でマウスの右ボタンをクリックしてマーキングメニューからUVを選択します。

すべてのプレーンのUVポイントを選択し、メインメニューのWindowsタブからUVテクスチャエディタを開いて、セクションプレーンに合うようにUVを比例的にスケールします。neuros sphereの各セクションに対してこの操作を繰り返し、各セクション間の間隔がMayaのユーザーインターフェースのステータスラインにあるスケールバーの高さと一致するようにします。メニューバーをデフォルトのAnimation設定からDynamicsに変更し、neuros sphereの最初のセクションのみを表示した状態にします。

メインメニューの表示タブから表示設定を変更して他のすべてのセクションを非表示にし、CV曲線ツールオプションボックスを開いた状態で、CV曲線設定から「linear」を1つ選択します。トップビューカメラでシーンを確認しながら、セルマップにポイントを割り当て、CX 29陰性細胞とCX 29陽性細胞のそれぞれに対して1つの曲線を作成します。得られた曲線は、サイドビューカメラから見たときに平坦になります。

Y軸上の曲線の点を移動させて、切片の厚さを近似します。その際、スケールバーをガイドとして使用してください。このプロセスをニューロスフィアの各切片に対して繰り返します。

プロジェクトのscenesフォルダからcell typology.maファイルをインポートし、CX 29陰性とCX 29陽性の両方の前駆細胞用にcell typologyを複製します。メインメニューのwindows rendering editorsタブからハイパーシェードウィンドウを開きます。

アウトライナーウィンドウから、以前に作成したシェーダーをタイポロジーのセルに割り当ててインポートします。インポートしたオブジェクトの先頭にあるファイル名を削除してください。これは、モデリングプロセスの後の段階で重要になります。

メインメニューからparticlesタブを選択し、最初のCV曲線用のパーティクルエミッターを作成します。particle shape 1タブを開き、emission attributesの項目で、max countを-1から最初の曲線のポイント数に変更します。render attributesタブで、particle render typeをblobby surfaceに変更します。

下の現在のレンダータイプボックスをクリックし、粒子の半径を0.01に変更します。まず粒子を選択し、次にShiftキーを押しながら曲線を選択することで、粒子を曲線の頂点にアタッチします。

メインメニューのパーティクルタブからゴールオプションを開き、ゴールのウェイトを1に設定します。「作成」をクリックします。アウトライナーウィンドウで1番から10番までのセルを順番に選択し、メインメニューのパーティクルタブからインスタンス置換オプションボックスを開きます。

インスタンスオブジェクトのボックスに、10個すべてのセルが順番にリストされているはずです。「particle object to instance」タブのドロップダウンリストから、正しいパーティクルの形状名を選択します。「create」をクリックしてください。デフォルトでは、選択された最初のセルのみがカーブに沿ったパーティクルに置き換えられます。10個すべてのセルを表示させ、パーティクル間でランダムにサイクルさせるには、エクスプレッションが必要です。

2つ目のエクスプレッションにより、セルが毎回同じようにランダムに放出されるようになります。エミッターを選択した状態で、レンジスライダーを再配置します。「add dynamic attribute」の下にあるパーティクル形状タブで、属性エディターを開きます。

long nameの下にあるgeneralボックスをクリックします。attribute typeをscalerからper particle arrayに切り替え、random underscore indexと入力して、per particle array attributesタブのaddボタンを押します。random underscore indexボックスが追加されました。

空白部分で右クリックし、ドロップダウンボックスから「式を作成」を選択します。式ボックスに以下のテキストを入力して、式を完成させます。属性エディタで「インスタントサーチ・ジオメトリ置換」タブを開き、「全般オプション」の「オブジェクトインデックス」を確認します。

ドロップダウンリストからランダムなアンダースコアインデックスを選択してください。タイムスライダーを最初のフレームまで移動させ、「再生」を押します。これで、粒子間に細胞型がランダムに分布します。

ニューロスフィアの各セクションに対してこのプロセスを繰り返します。新しいエミッターのインスタンスとランダムインデックスのそれぞれが、名前で区別され、レンダーのアウトライナーウィンドウ内で適切に整理されていることを確認してください。レンダー設定ウィンドウのセクションを使用して、レンダーをMaya softwareからmental rayに変更します。

クオリティ（quality）タブを開き、レイトレーシング（ray tracing）の項目でリフレクション（reflection）の設定を0に変更します。フレームバッファ（frame buffer）タブを開き、カラークリップ（color clip）を「raw」から「alpha」に変更し、「Pre multiply」のチェックを外します。

チャンネルボックスのレイヤーエディタを開き、レイヤーエディタの設定を「display」から「render」に変更します。インポートしたタイポロジーのセルを選択し、「新規レイヤーを作成して選択したオブジェクトを割り当てる」アイコンをクリックします。レイヤー名を「ambient occlusion」に変更します。

新しく作成したレイヤーを右クリックし、レンダーレイヤーボックスの右側にあるメニューから「属性」を選択します。「プリセット」ボタンをクリックし、ドロップダウンリストから「occlusion」を選択します。「MIB_AMB_occlusion1」タブを選択し、サンプル数を16から256に変更します。

チャネルボックスのレイヤーエディタを再度開き、「オプション」タブの下にある「レンダー全レイヤー」オプションボックスを開いて、「コンポジット」および「レイヤーを保持」を選択し、アンビエントオクルージョンレイヤーが選択されている状態にします。レイヤーリストの直上にあるドロップダウンボックスで、「ノーマル」から「マルチプライ」に変更します。ニューロス球体を、アンビエントオクルージョンレイヤーをオンにした状態で1回、マスターレイヤーをオンにした状態で1回の、計2パスレンダリングします。これらの画像をIFFファイルとしてプロジェクトのimagesフォルダに保存してください。

両方の画像をAdobe Photoshopで開きます。アンビエントオクルージョンレイヤーをマスターレイヤーの上に配置し、描画モードを「乗算」に設定します。背景を作成し、画像を統合します。

ここでは、海馬由来の神経幹細胞をニューロスフィアとして培養する方法、クライオスタットを用いてニューロスフィア培養物を連続切片化する方法、および目的のタンパク質に対する免疫染色の方法について解説しました。また、細胞培養のレジストレーションと3次元モデリングソフトウェアを組み合わせることで、そのタンパク質発現の空間的な位置を3次元でモデル化する方法についても示しました。

本資料がお役に立ち、皆様の実験が成功することを願っております。