Name: 3D神経幹細胞培養におけるローカライズたんぱく質：ハイブリッド可視化手法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 47 s
Description: 学ぶ、3D神経球におけるたんぱく質局在の可視化手法。新生期海馬由来神経前駆細胞の分離・培養と免疫染色を用いて、二次元顕微鏡画像から三次元再構成を行う方法を解説する。

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我々は専門家の編集支援のためのデータ収集の支援のためにマットクック、ビデオ制作や編集の専門家の技術支援のためにエヴァンディザートとマークレオナールに感謝、そしてサラGelbard。仕事はSALB、SALBとSFの健康研究プログラムの助成金の戦略的トレーニングイニシアティブ（TGF神経変性脂質メタボロームのCIHRのトレーニングプログラム、9121）、およびインフラストラクチャへの健康研究のカナダ研究所（CIHR、MOP 62626）から営業の補助金によって賄われていたカナダの財団イノベーションとオンタリオ州イノベーショントラストからSFまでサポート。 SIは、パーキンソンの研究コンソーシアムからの拠出金と科学技術のオンタリオ大学院奨学金を受け取りました。 NVは、神経変性リピドミクス、ポストプロのフェローシップで老化研究所とCIHRのトレーニングプログラムを受け取ります。我々は感謝してAutoDesk社リサーチが提供する教育用ソフトウェアと技術サポートを認めます。

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
<li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurospheres%3A+insights+into+neural+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li>
<li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li>
</ol>

動物での実験はすべてオタワアニマルケア委員会の大学や動物ケアに関するカナダの理事会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

このプロトコルは、文化とシリアル凍結切片産後海馬のNPCに手順を説明し、免疫検出によるタンパク質の発現をローカライズする、そして最終的に全体の3Dニューロスフィア内に免疫陽性細胞の地形の位置を再構築し、分析する。 、グラフィック編集ソフトウェア容量（アドビフォトショップ）、そして3Dアニメーションとの合成ソフトウェア容量（Autodesk Mayaを）細胞生物学の文化と加工技術、顕微鏡画像（オープンラボ、即興と他の画像解析ソフト）を組み合わせることにより、我々は、再構築する方法論を提示ニューロスフェア培養を通して細胞の位置およびタンパク質発現の忠実な再建を可能にするシリアル2D画像から3Dの文化の全体の細胞組成。このプロトコルは、登録と厚い連続切片を介して落射蛍光薄連続切片または共焦点Z -スタックの再建に等しい効果と組み合わせることができます。出生後の脳における神経新生とgliogenesisの経過観察の段階のニューロスフェア培養用反復する単一のNPCのクローン増殖が多いため、その立体構造の影響は、同じ実験環境1にさらさ後代における重要なNPCの運命決定因子を表しています。シリアルロスフェアのセクションのコアと周辺部で系統およびタンパク質発現の相違は、そのセルの位置、機械的応力、及びせん断力を含む複数の物理的要因はNPCの生物学2を調節する上で重要な役割を果たすことを示唆している。さらに、コネキシン蛋白質の発現は、、ここで解析のNPCが細胞をプラスチックや基板上または3Dを無料で培養されているかどうかを変更機能コネキシンを介したコミュニケーションによるラミニン基質上にサスペンションやメッキで3Dロスフェアとして培養されるときに応じて変更することが示されているフローティング文化3。 NPCの運命上の細胞の位置の影響は不明なままである。それは技術的に系統およびシグナル伝達タンパク質の抗原性の評価は、3次元構造の破壊は、細胞浸透性とすべてのセルへの抗体のアクセスを有効にするために必要な特定のNPCの生物学上の3次元文化の中で空間的な位置の影響を分析するために挑戦している。ここで、我々はハイブリッド視覚化手法は、おそらく最も重要なの、、特定の蛋白質が立体文化の中でユニークな位置ローカライゼーションを示すかどうかを決定する手段を提供するニューロスフェアの中で局所的配置に関連してタンパク質の機能と規制を推測し、テストするために使用することができる、としていることを示し、3次元培養におけるNPCの運命の3D地形や携帯電話の位置の影響を研究するために必要な位置データを提供します。

プロトコールに記載されている*他のすべての標準的な化学試薬はSigma - Aldrichからです。他のすべての標準組織培養試薬はInvitrogenからです。

3d神経幹細胞培養におけるローカライズたんぱく質：ハイブリッド可視化手法

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

神経幹細胞および前駆細胞に影響を及ぼす3次元（3D）地形の重要性（NPC）表現型は、広く研究するために挑戦はまだ認められている。胎児または出生後の脳からのときは解離、単一のNPCはニューロスフェアを形成するために、懸濁液中で増殖される。これらの培養物内の娘細胞は、自発的に同一の細胞外環境にさらされているにもかかわらず、拡大の過程で明確な発達系統を（ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト）を採用。この進行の反復するには、ステージの多くは、出生後の脳における神経新生とgliogenesisの経過観察と​​、多くの場合、制御された環境の中で基本的なNPCの生物学を研究するために使用されます。 NPCの運命上のこれらの培養物内の3D地形や携帯電話の位置の完全な影響を評価する、しかし、難しいです。標的タンパク質をローカライズし、免疫細胞化学によってNPCの系統を識別するには、フリーフローティングニューロスフェアは、基板上に播種したり、シリアルに区分されている必要があります。この処理は、球全体に相当する細胞浸透性および抗体のアクセスを確保するために必要です。その結果、凍結切片または3D Z -スタックの共焦点再建の2D落射蛍光画像は、離散的な物理的またはデジタル3Dスライス内のセルの位置に関する空間的な情報を提供することができますし、無傷の球の細胞の位置を視覚化していない。ここでは、ニューロスフェアの文化の地形をあらためて表明し、全体の文化を通して蛋白質の発現の空間的な分析を可能にするために、我々は分離、展開、および標的タンパク質の落射蛍光または共焦点免疫検出に適した生後海馬ニューロスフェアのシリアルセクショニングのためのプロトコルを提示する。 Connexin29は（Cx29）の例として分析される。次に、グラフィックの編集と厳密に生物学的な詳細を維持するために適用される3Dモデリングソフトのハイブリッドを使用して、我々はどのようにこれらのイメージの再アセンブル3次元構造の位置へとデジタル完全なニューロスフェアの中で標識された細胞をマッピングについて説明します。この方法論は、全体の3次元文化の地形全体の標的蛋白質と細胞の細胞位置の可視化と分析を可能にし、in vitroで神経新生とgliogenesisの過程で細胞間の空間関係のより詳細な分析を容易にするでしょう。 Imbeaultとバレンスエラ両方が均等に貢献し、共同第一著者を考慮する必要があります。

ここで、我々は3次元（3D）文化の中で、生産の拡大、およびimmunolabel生後海馬の神経前駆細胞（NPCに）する方法について説明します。次に、ハイブリッド可視化技術を使用して、我々はimmunolabelled凍結切片のデジタル画像が全体の3Dニューロスフィアを通して免疫陽性細胞の空間的位置を再構築し、マップするために使用することができる方法を示します。

3D神経幹細胞培養におけるローカライズたんぱく質：ハイブリッド可視化手法

神経幹細胞および前駆細胞（NPC）の表現型に影響を与える3次元（3D）トポグラフィーの重要性は広く認識されていますが、それを...

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ここでは、文化、人間の神経前駆細胞への自己組織化3次元足場の使用を説明します。我々は、フローサイトメトリーで、その後、例えば、分析する足場から細胞を解放するためにプロトコルを提示する。このプロトコルは、詳細な機構的な研究を行うために他の細胞型に適応される可能性があります。...

3次元自己組織化ペプチドハイドロゲル中のヒト神経前駆細胞の栽培

このビデオは、3次元の足場内でのヒト神経幹細胞の発生と分化を示しています。足場上のラミニンコーティングは細胞の接着を促進し、成長因子を含まない神経培地は細胞分化を誘導し、神経前駆細胞は多孔質構造内でプロセスを多方向に拡張して三次元培養を形成します...

多孔質足場を用いたヒト神経幹細胞の3D培養への分化

出典:Gómez-Villafuertes, R., et.., ライブイメージングとそれに続くシングルセルトラッキングにより、細胞生物学と複数の神経集団の系統進行をモニタリングします。J. Vis. Exp. (2017)...

成体神経幹細胞の神経系統をモニタリングするためのライブイメージングとシングルセルトラッキング

成人脳から採取した神経幹細胞は神経系の発達の基礎研究から再生医療の潜在的な臨床応用を探索範囲の用途に利用が増加している。これは実験的な成果を鳴らす重要なこれらの細胞を成長させるために使用される分離と培養条件に厳密な制御を行う。...

大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

分化したヒト神経幹細胞(hNSC)上のmiRNAの変化を特徴づける目的で、3次元システム上でのhNSC分化、miRNA...

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。...

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

ライブ画像は、リアルタイムで携帯電話の行動を研究するための強力なツールです。ここでは、タイムラプス...

2次元培養系を用いた主な大脳皮質細胞のイメージングをライブします。

記載されているパイプラインは、ギガバイトより大きい電子顕微鏡データセットのセグメンテーション用に設計され、細胞全体の形態を抽出します。セルを3Dで再構築すると、個々のニーズに合わせて設計されたカスタマイズされたソフトウェアを使用して、3Dで直接定性的および定量的な分析を実行し、また、仮想現実を使用してビューの閉塞を克服することができます。...

グリア細胞と神経細胞の3D再構成とバーチャルリアリティ解析の方法

蛍光カルシウムイメージングとin...

ゼノプス・ラエビスにおける神経前駆体特性評価のための蛍光カルシウムイメージングとその後のその後の位置ハイブリダイゼーション

ここでは、パターン化されたニューロン上で神経膠芽腫(GBM)の移行を分析するための使いやすい共培養アッセイを提示する。我々は、ニューロン上のGBM細胞移動を容易に定量化するためのFiJiソフトウェアでマクロを開発し、ニューロンがGBM細胞侵襲能力を変更することを観察した。...

パターン化ニューロン上の神経膠芽腫幹細胞の共培養による移動と細胞相互作用の研究

我々は、新皮質発生の2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)ベースのモデルの生成および特性評価のための詳細なプロトコル、ならびに初代繊毛(PC)生合成および機能の定性的および定量的分析を可能にする補完的方法論を提示する。...

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

学ぶ、3D神経球におけるたんぱく質局在の可視化手法。新生期海馬由来神経前駆細胞の分離・培養と免疫染色を用いて、二次元顕微鏡画像から三次元再構成を行う方法を解説する。

3D神経幹細胞培養におけるローカライズたんぱく質：ハイブリッド可視化手法

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