出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

私はTroy Gasaiです。ここ数年、私の研究室で完成させた臓器類器官スライスアッセイについてお話しします。私の研究室のBen jacketが、このアッセイの実施方法を実演します。

生後脳の臓器培養スライスアッセイは、生後脳およびTRO遊走流における神経細胞遊走へのさまざまな因子の影響とその役割を検証するための強力な手法です。こんにちは、ベン・ジャケイです。私はノースカロライナ州立大学獣医学院のトロイ・ゲッジ博士の研究室に所属する博士後研究員です。本日は、生後脳において遊走する神経芽細胞を可視化するため、マウス脳の臓器培養スライス間で行う組織交差移植の手順について解説します。

このビデオで説明するすべての手法は、滅菌環境下（できれば滅菌済み器具を使用したラミナーフローフード内）で実施する必要があります。23ゲージの針を装着した使い捨てシリンジを用いて、150 µLのスライス培地をディッシュの底面であるガラス部分の中央に滴下します。液体交換ができるよう、円形のガラス底カバーのスリップの一辺を接着せずに残し、周囲に数箇所接着剤を塗布します。その後、マイクロピンセットを用いて核膜を培地の上に慎重に配置し、膜の下に気泡が閉じ込められていないことを確認します。

次に、曲鉗子を用いて接着剤の付着点を押し潰し、メンブレンを固定します。メンブレンの上にスライス用培地を1 mL加え、最後に、使用するまでディッシュをインキュベーターに保管します。生後1日から10日（P1〜P10）の若齢マウスからスライスを調製したときに最良の結果が得られます。まず、マイクロ鉗子で鼻先を固定して頭部を安定させます。

皮膚を頸部から吻端に向かって縦方向に切除します。頭皮を剥離して骨を露出し、胸骨大孔から始まり、正中線上に1回、および両側に各1回ずつ計2回の外側切開を行うことで、頭蓋骨を縦方向および前方へと切開します。この際、下層の皮質組織への接触を最小限に抑えるよう注意してください。

組織の安定性を高めるため、頭蓋骨片を脳から取り除きます。振動切片作成（ビブラトム切片作成）の際、脳の最も外側および尾側の部分はカミソリで除去します。2つの大脳半球を頭蓋骨から慎重にすくい出し、内側表面を下にして埋込型に配置します。

これらに、組織調製バッファーに溶解させ37°Cに保持した、融解状態の3% DNA grade アガロースゲルを直ちに被せます。平坦な水平面上で2分間静置し安定させた後、アガロースを均一に硬化させるため、型を氷上に置いて凝固を完了させます。

半球を含むゲルが凝固した後、モールドから取り出し、脳組織の周囲をトリミングします。次に、ゲルに包埋した組織の内側表面を上にしてバイブレーション切片作成装置の specimen disc に載せ、シアノアクリレート系接着剤で固定します。その後、氷冷した組織調整液を満たしたバイブレーション用サンプル・トレイにディスクを装着し、脳を 150 µm の厚さで切片化します。

RMSを含むスライスをブレードから切り出した後、小型の平型スパチュラを用いて慎重にすくい上げ、培養皿の中央に平らに配置します。組織は非常に脆弱であるため、スライスの操作を最小限に抑えることが極めて重要です。培養皿内の培地量は、脳切片が動かないように固定しつつ、切片全体を十分に覆うレベルに調整します。

ディッシュにラベルを貼り、インキュベーターに移します。ドナー脳はレシピエント脳と同様の方法で調製しますが、切片の厚さを250 µmとして切断し、スライスを氷上で回収する点が異なります。

冷組織標本の作製。緩衝液に浸した切片を、エピ蛍光機能を備えた解剖顕微鏡下に直ちに配置します。RMSは、小室下帯から嗅球まで伸びる灰色のU字型の構造として観察されます。

マイクロ鉗子を用いて、RMSを慎重にマイクロダイセクションします。一方の鉗子でスライスを固定し、もう一方の鉗子でRMSの周囲を小さく切り込み、スライスから切り離します。切り出したRMSを、直径約200～500 µmの小さな断片に切断します。

この例では、赤色蛍光タンパク質であるTD tomato glassを発現しているマウスから、接ぎ木用の材料を調製します。ホストのスライスを含むボトムディッシュをインキュベーターから取り出し、可視光を用いた解剖顕微鏡の下に配置します。RMSの初期セグメントに小さな切開を加え、20 µLチップを備えたピペッターを使用して、単一のドナーRMS外植体をホストRMSの切開部位に移植します。

2つの組織間の接触を確立させるため、エクスプランを切開部位にそっと押し込みます。この接触を安定させるため、エクスプランをスライスと核膜の間へとわずかに押し込みます。その後、切片が膜に定着するまで、ディッシュをインキュベーターに戻し、少なくとも1時間静置します。

神経芽細胞は、約1〜2時間後に外植片から宿主の吻側移行帯（RMS）へと遊走し始めます。細胞の遊走は、超長作動距離の20倍対物レンズを使用して観察するのが最適です。組織培養された試料をインキュベーターから顕微鏡上のインキュベーションチャンバーへ移します。

蛍光ニューロブラストは、目的とする解析の種類に応じて、0分から10分の間隔でイメージングが可能です。我々の有機的代表切片培養プロトコルは、RMSにおける移動パターンと方向の一貫性を確保するため、ここ数年にわたり徹底的な検証と最適化が行われてきました。本例では、Nestinプロモーター下でTD tomatoを発現するマウスから得られたエクスプランから浸潤する細胞を解析し、宿主のRMSへの高度に方向づけられた迅速な移動が明らかになります。

高倍率。タイムラプス解析により、20分間のイメージングセッションにおいて、遊走する神経芽細胞の全長が極めて高い解像度で捉えられていることがわかります。イメージング完了後、スライスを氷冷した新鮮な4%パラホルムアルデヒドで固定し、遊走ストリームのさまざまな構成要素について免疫染色を行います。

この例では、蛍光免疫組織化学を用いて、GFAP陽性のアストロサイトを青色で、CD 31陽性の血管を緑色で可視化しています。また、細胞骨格タンパク質であるactin（青色）およびtubulin（緑色）で染色した切片の高倍率解析により、遊走中の細胞においてこれらの成分が不均一に発現していることが分かります。本プロトコルにはいくつか困難な点があり、準備および結果の解析の両方に忍耐と練習、そして十分な時間をかける必要があります。

ここで、実験で最良の結果を得るための有用な提案をいくつか挙げます。私たちの経験では、P1からP10の年齢範囲のマウスが最適な結果をもたらします。また、ドナー脳とレシピエント脳の年齢を合わせることで、実験の再現性が向上します。

ほとんどの試薬や培養皿を調製直後に使用する必要があるため、本スライスアッセイでは、1日で数時間にわたる中断のない調製およびイメージング作業が必要です。脳を採取した後は、後続の工程を可能な限り迅速に行わなければなりません。斬首からスライスの調製までのすべての工程は、解剖学的構造の破壊を避けるため、氷および冷やした試薬を使用し、組織の操作は最小限に留めて行う必要があります。

これらの解剖に使用する器具は滅菌済みである必要があり、生体組織の操作のみに使用してください。ホルムアルデヒドなどの固定液に接触したことのある器具は絶対に使用しないでください。スライスは通常、最大36時間まで生存可能ですが、24時間から36時間の間で、移動能、速度、および方向性の低下が認められます。

実験および解析を計画する際は、この制限に注意してください。