Name: 出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学ぶ出生後マウス脳の器官型スライスアッセイによる神経芽細胞移動の高分解能タイムラプスイメージング法。この技術は組織間移植を用いて神経細胞の動態を可視化し、神経発生の理解に貢献します。

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我々はビデオでプロトコルを語るためのダンマホーターに感謝。この作品は、NIHのグラント5R01NS062182、老化研究のためのアメリカ連合からの助成金、およびHTGに授与機関の資金によってサポートされています。

<ol><li>Ghashghaei, H. T., Lai, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+adult+brain%3A+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the adult brain: are we there yet.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 141-151 (2007).</li>
<li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li>
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<li>Jaglin, X. H., Chelly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-related+cortical+dysgeneses%3A+microtubule+dysfunction+underlying+neuronal+migration+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Tubulin-related cortical dysgeneses: microtubule dysfunction underlying neuronal migration defects.</a> Trends Genet. 25, 555-566 (2009).</li>
<li>Carro, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+network+for+mesenchymal+transformation+of+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The transcriptional network for mesenchymal transformation of brain tumours.</a> Nature. 463, 318-325 (2010).</li>
<li>Wu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+guidance+of+neuronal+migration+in+the+olfactory+system+by+the+protein+Slit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional guidance of neuronal migration in the olfactory system by the protein Slit.</a> Nature. 400, 331-336 (1999).</li>
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<li>Shapiro, E. M., Gonzalez-Perez, O., Garcia-Verdugo, M. anuel, Alvarez-Buylla, J., &amp, A., Koretsky, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+the+migration+of+neuronal+precursors+generated+in+the+adult+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of the migration of neuronal precursors generated in the adult rodent brain.</a> Neuroimage. , (2006).</li>
<li>Vreys, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+visualization+of+endogenous+neural+progenitor+cell+migration+along+the+RMS+in+the+adult+mouse+brain%3A+validation+of+various+MPIO+labeling+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">MRI visualization of endogenous neural progenitor cell migration along the RMS in the adult mouse brain: validation of various MPIO labeling strategies.</a> Neuroimage. 49, 2094-2103 (2010).</li>
<li>Davenne, M., Custody, C., Charneau, P., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+migrating+neurons+in+the+mammalian+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of migrating neurons in the mammalian forebrain.</a> Chem. Senses. 30, Suppl 1. 115-116 (2005).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subventricular+zone+en-face%3A+wholemount+staining+and+ependymal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li>
<li>Tavazoie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 279-288 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cells+Confer+Unique+Pinwheel+Architecture+to+the+Ventricular+Surface+in+Neurogenic+Regions+of+the+Adult+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cells Confer Unique Pinwheel Architecture to the Ventricular Surface in Neurogenic Regions of the Adult Brain.</a> Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).</li>
<li>Polleux, F. &amp, Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. , L9-L9 (2002).</li>
<li>Murase, S. &amp, Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleted+in+colorectal+carcinoma+and+differentially+expressed+integrins+mediate+the+directional+migration+of+neural+precursors+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).</li>
<li>Suzuki, S. O. &amp, Goldman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cell+populations+in+the+early+postnatal+subventricular+zone+take+distinct+migratory+pathways%3A+a+dynamic+study+of+glial+and+neuronal+progenitor+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration.</a> J. Neurosci. 23, 4240-4250 (2003).</li>
<li>Ghashghaei, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuregulin-ErbB4+interactions+on+the+proliferation+and+organization+of+cells+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The role of neuregulin-ErbB4 interactions on the proliferation and organization of cells in the subventricular zone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 1930-1935 (2006).</li>
<li>Khodosevich, K., Seeburg, P. H., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+signaling+pathways+in+migrating+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Major signaling pathways in migrating neuroblasts.</a> Front Mol. Neurosci. 2, 7-7 (2009).</li>
<li>Jacquet, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuronal+proliferation%2C+migration+and+differentiation+in+the+postnatal+brain+using+equine+infectious+anemia+virus-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuronal proliferation, migration and differentiation in the postnatal brain using equine infectious anemia virus-based lentiviral vectors.</a> Gene Ther. 16, 1021-1033 (2009).</li>
</ol>

動物実験は、ノースカロライナ州立大学獣医学の、その大学が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。利害の衝突は宣言されません。

RMSの神経細胞の移動は、嗅球1の出生後の神経新生の重要なコンポーネントです。 RMSを介しての移行は、脳の表面への接平面で発生します。接線方向に移行する神経芽細胞が放射状にその前駆細胞のソースの場所だけでなく、彼らの最終的な神経の製品1、2、3の分岐運命に基づいて細胞の移行とは別個のものである。出生後のRMSでの接線方向に移行し細胞の比較的純粋な人口は、この解剖学的に定義可能な地域接線マイグレーションの機構を研究するための最適なプラットフォームになります。ニューロン移動の細胞および分子メカニズムを解読することは、多くの神経疾患（例えば、文献4）を理解するために重要です。この知識は、さらに（例えば、文献5）脳の腫瘍の形成と普及の基礎となるメカニズムの同定を容易に、そして将来の神経交換戦略の傷害または神経変性の部位に再プログラム神経芽細胞の誘導に不可欠である可能性があります。 ここ数年で大きな進歩にもかかわらず、遺伝子や分子ニューロン移動のメカニズム、および特定の細胞内のイベントへのリンクの現在...

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

既存の神経回路に前駆細胞、神経芽細胞の遊走、だけでなく、新たな神経細胞の分化と統合の増殖：出生後の脳における神経新生は、3つの生物学的事象のメンテナンスに依存します。嗅球における出生後の神経新生のために、これらのイベントは3つの解剖学的に別個のドメイン内で分離されています：増殖は主に神経芽細胞は吻側渡り鳥ストリーム（RMS）を横断し、新しい神経細胞が分化し、移行、側脳室の上衣ゾーン（SEZ）で発生嗅球（OB）内に統合する。三つのドメインは、はっきりと生物学的事象の各々を調節する、細胞の分子、および生理学的メカニズムを研究する理想的なプラットフォームとして機能する。このホワイトペーパーでは、細胞外の条件が密接に神経芽を移行するための生体内環境で模倣した生後脳組織に最適化された器官スライスアッセイを、説明しています。私たちは、アッセイは、RMS内神経芽細胞の、均一な指向、そしてスピーディな動きを提供することを示している。このアッセイは、異なる遺伝的背景の上にマウスからのクロス移植のアプローチを利用することにより、ニューロン移動の細胞自律的で、非自律的規制の研究のために非常に適したものとなる。

このプロトコルは、吻側渡り鳥ストリームにおける出生後の脳および神経芽細胞の遊走の高解像度のタイムラプスイメージングに最適化された器官スライスのアッセイを説明します。

出生後の脳における神経新生は、前駆細胞の増殖、神経芽細胞の移動、および……という3つの生物学的現象の維持に依存している。

私はTroy Gasaiです。ここ数年、私の研究室で完成させた臓器類器官スライスアッセイについてお話しします。私の研究室のBen jacketが、このアッセイの実施方法を実演します。生後脳の臓器培養スライスアッセイは、生後脳およびTRO遊走流における神経細胞遊走へのさまざまな因子の影響とその役割を検証するための強力な手法です。こんにちは、ベン・ジャケイです。私はノースカロライナ州立大学獣医学院のトロイ・ゲッジ博士の研究室に所属する博士後研究員です。本日は、生後脳において遊走する神経芽細胞を可視化するため、マウス脳の臓器培養スライス間で行う組織交差移植の手順について解説します。このビデオで説明するすべての手法は、滅菌環境下（できれば滅菌済み器具を使用したラミナーフローフード内）で実施する必要があります。23ゲージの針を装着した使い捨てシリンジを用いて、150 µLのスライス培地をディッシュの底面であるガラス部分の中央に滴下します。液体交換ができるよう、円形のガラス底カバーのスリップの一辺を接着せずに残し、周囲に数箇所接着剤を塗布します。その後、マイクロピンセットを用いて核膜を培地の上に慎重に配置し、膜の下に気泡が閉じ込められていないことを確認します。次に、曲鉗子を用いて接着剤の付着点を押し潰し、メンブレンを固定します。メンブレンの上にスライス用培地を1 mL加え、最後に、使用するまでディッシュをインキュベーターに保管します。生後1日から10日（P1〜P10）の若齢マウスからスライスを調製したときに最良の結果が得られます。まず、マイクロ鉗子で鼻先を固定して頭部を安定させます。皮膚を頸部から吻端に向かって縦方向に切除します。頭皮を剥離して骨を露出し、胸骨大孔から始まり、正中線上に1回、および両側に各1回ずつ計2回の外側切開を行うことで、頭蓋骨を縦方向および前方へと切開します。この際、下層の皮質組織への接触を最小限に抑えるよう注意してください。組織の安定性を高めるため、頭蓋骨片を脳から取り除きます。振動切片作成（ビブラトム切片作成）の際、脳の最も外側および尾側の部分はカミソリで除去します。2つの大脳半球を頭蓋骨から慎重にすくい出し、内側表面を下にして埋込型に配置します。これらに、組織調製バッファーに溶解させ37°Cに保持した、融解状態の3% DNA grade アガロースゲルを直ちに被せます。平坦な水平面上で2分間静置し安定させた後、アガロースを均一に硬化させるため、型を氷上に置いて凝固を完了させます。半球を含むゲルが凝固した後、モールドから取り出し、脳組織の周囲をトリミングします。次に、ゲルに包埋した組織の内側表面を上にしてバイブレーション切片作成装置の specimen disc に載せ、シアノアクリレート系接着剤で固定します。その後、氷冷した組織調整液を満たしたバイブレーション用サンプル・トレイにディスクを装着し、脳を 150 µm の厚さで切片化します。RMSを含むスライスをブレードから切り出した後、小型の平型スパチュラを用いて慎重にすくい上げ、培養皿の中央に平らに配置します。組織は非常に脆弱であるため、スライスの操作を最小限に抑えることが極めて重要です。培養皿内の培地量は、脳切片が動かないように固定しつつ、切片全体を十分に覆うレベルに調整します。ディッシュにラベルを貼り、インキュベーターに移します。ドナー脳はレシピエント脳と同様の方法で調製しますが、切片の厚さを250 µmとして切断し、スライスを氷上で回収する点が異なります。冷組織標本の作製。緩衝液に浸した切片を、エピ蛍光機能を備えた解剖顕微鏡下に直ちに配置します。RMSは、小室下帯から嗅球まで伸びる灰色のU字型の構造として観察されます。マイクロ鉗子を用いて、RMSを慎重にマイクロダイセクションします。一方の鉗子でスライスを固定し、もう一方の鉗子でRMSの周囲を小さく切り込み、スライスから切り離します。切り出したRMSを、直径約200～500 µmの小さな断片に切断します。この例では、赤色蛍光タンパク質であるTD tomato glassを発現しているマウスから、接ぎ木用の材料を調製します。ホストのスライスを含むボトムディッシュをインキュベーターから取り出し、可視光を用いた解剖顕微鏡の下に配置します。RMSの初期セグメントに小さな切開を加え、20 µLチップを備えたピペッターを使用して、単一のドナーRMS外植体をホストRMSの切開部位に移植します。2つの組織間の接触を確立させるため、エクスプランを切開部位にそっと押し込みます。この接触を安定させるため、エクスプランをスライスと核膜の間へとわずかに押し込みます。その後、切片が膜に定着するまで、ディッシュをインキュベーターに戻し、少なくとも1時間静置します。神経芽細胞は、約1〜2時間後に外植片から宿主の吻側移行帯（RMS）へと遊走し始めます。細胞の遊走は、超長作動距離の20倍対物レンズを使用して観察するのが最適です。組織培養された試料をインキュベーターから顕微鏡上のインキュベーションチャンバーへ移します。蛍光ニューロブラストは、目的とする解析の種類に応じて、0分から10分の間隔でイメージングが可能です。我々の有機的代表切片培養プロトコルは、RMSにおける移動パターンと方向の一貫性を確保するため、ここ数年にわたり徹底的な検証と最適化が行われてきました。本例では、Nestinプロモーター下でTD tomatoを発現するマウスから得られたエクスプランから浸潤する細胞を解析し、宿主のRMSへの高度に方向づけられた迅速な移動が明らかになります。高倍率。タイムラプス解析により、20分間のイメージングセッションにおいて、遊走する神経芽細胞の全長が極めて高い解像度で捉えられていることがわかります。イメージング完了後、スライスを氷冷した新鮮な4%パラホルムアルデヒドで固定し、遊走ストリームのさまざまな構成要素について免疫染色を行います。この例では、蛍光免疫組織化学を用いて、GFAP陽性のアストロサイトを青色で、CD 31陽性の血管を緑色で可視化しています。また、細胞骨格タンパク質であるactin（青色）およびtubulin（緑色）で染色した切片の高倍率解析により、遊走中の細胞においてこれらの成分が不均一に発現していることが分かります。本プロトコルにはいくつか困難な点があり、準備および結果の解析の両方に忍耐と練習、そして十分な時間をかける必要があります。ここで、実験で最良の結果を得るための有用な提案をいくつか挙げます。私たちの経験では、P1からP10の年齢範囲のマウスが最適な結果をもたらします。また、ドナー脳とレシピエント脳の年齢を合わせることで、実験の再現性が向上します。ほとんどの試薬や培養皿を調製直後に使用する必要があるため、本スライスアッセイでは、1日で数時間にわたる中断のない調製およびイメージング作業が必要です。脳を採取した後は、後続の工程を可能な限り迅速に行わなければなりません。斬首からスライスの調製までのすべての工程は、解剖学的構造の破壊を避けるため、氷および冷やした試薬を使用し、組織の操作は最小限に留めて行う必要があります。これらの解剖に使用する器具は滅菌済みである必要があり、生体組織の操作のみに使用してください。ホルムアルデヒドなどの固定液に接触したことのある器具は絶対に使用しないでください。スライスは通常、最大36時間まで生存可能ですが、24時間から36時間の間で、移動能、速度、および方向性の低下が認められます。実験および解析を計画する際は、この制限に注意してください。

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、末梢神経突起伸長の栽培とタイムラプスイメージングのための妊娠中期のマウス胚の器官型スライスを準備する方法を提示する。...

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

E12.5マウス胚中脳から器官型スライスを生成する方法が記載されている。器官切片培養は、ドーパミン作動性ニューロンや他の腹側中脳の神経細胞の挙動を観察するために使用することができます。...

胚腹側中脳の器官型スライス培養：ドーパミン作動性ニューロンの発達を研究するための体制 in vitroで</em

リアルタイムでイメージング胚組織では、長期間にわたって挑戦されています。ここでは、高い空間分解能と時間分解能で長時間ニワトリ脊髄の細胞とサブ細胞の変化を監視するためのアッセイを示す。この手法は、神経系や胚の他の地域に適応することができます。...

開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

我々は、マウスの前脳におけるニューロン移動のリアルタイムvideoimagingためのプロトコルを記述します。ウイルス標識又はグラフト神経前駆細胞の遊走は、固定と移動相の持続時間と速度を含む細胞遊走のさまざまなフェーズを、勉強するのは比較的急速な取得間隔と広視野蛍光イメージングを用いた急性スライスのライブで録音された移行。...

成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

出典: Wiegreffe, C., et. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain using In Utero エレクトロポレーション. J. Vis. Exp. (2017)...

形質導入マウス胚脳切片における皮質ニューロン放射状移動のタイムラプスイメージング

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。...

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

このプロトコルは、放射状に移動する皮質ニューロンの直接観察のための指示を提供する。 子宮内でのエレクトロポレーションでは、器官型スライス培養および時間経過共焦点画像化を組み合わせて、移動するニューロンにおける関心対象遺伝子の過剰発現または下方制御の影響を直接かつ動的に研究し、発生時のそれらの分化を分析する。...

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

ここでは、共焦点顕微鏡とライブ イメージング技術に適したマウス胚から electroporated...

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

このプロトコルは、 その場で 軸索の成長および成長円錐ダイナミクスを研究するための簡単で堅牢な方法を実証する。 これは、生体外で...

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぶ出生後マウス脳の器官型スライスアッセイによる神経芽細胞移動の高分解能タイムラプスイメージング法。この技術は組織間移植を用いて神経細胞の動態を可視化し、神経発生の理解に貢献します。

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