出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

このプロトコルは、吻側渡り鳥ストリームにおける出生後の脳および神経芽細胞の遊走の高解像度のタイムラプスイメージングに最適化された器官スライスのアッセイを説明します。

トロイガサイです。ここでは、ここ数年で私の研究室で完成させた器官型スライスアッセイについてお話しします。私の研究室のBen jacketは、このアッセイがどのように行われるかをあなたに示します。

出生後脳の器官型スライスアッセイは、出生後脳およびTRO遊走流におけるニューロン移動に対するさまざまな要因と役割をテストするための強力な方法です。こんにちは、ベン・ジャカイです。私はノースカロライナ州立大学獣医学部のDr.Troy gge研究室の博士研究員であり、今日は、出生後の脳で移動する神経芽細胞を視覚化するために、器官型マウスの脳スライス間で組織交差移植を行う方法を紹介するためにここにいます。

このビデオで説明されているすべての技術は、滅菌されたツールを使用した層流フードなど、無菌環境で実行する必要があります。150マイクロリットルのスライスメディウムをガラスの中央、皿の底部に23ゲージの針を備えた使い捨て注射器で置きます。いくつかの接着スポットは、流体交換のために片面を接着せずに残しながら、円形のガラス底カバースリップの外側に配置されますA.A核孔膜は、マイクロ鉗子を使用して媒体の上に穏やかに配置され、気泡が膜の下に閉じ込められないようにします。

次に、湾曲した鉗子を使用して接着剤のスポットを平らにし、メンブレンを所定の位置に固定します。1ミリリットルのスライス培地をメンブレンの上に加え、最後に、使用する準備ができるまで皿をインキュベーターに入れます。最良の結果は、スライスを若い出生後のマウス、P 1からP 10から調製し、頭をマイクロ鉗子で鼻を保持することによって安定させるときに得られる。

皮膚は首から鼻まで縦方向に切除されます。頭皮を剥がして骨を露出させ、頭蓋骨は胸骨大動脈から始めて縦方向と前方に切り込みを入れ、内側に1つと外側に2つずつ、両側に1つずつ切り込みを入れます。下にある皮質組織との接触を最小限に抑えるように注意する必要があります。.

頭蓋皮弁が脳から取り除かれると、組織の安定性が向上します。ビブラム切片化では、脳の外側の最も外側とコダルの側面がかみそりの刃で取り除かれます。2つの半球は頭蓋骨から慎重にすくい取り出され、埋め込み型の内側表面に置かれます。

それらはすぐに、摂氏37度に維持された組織調製バッファーに溶解した溶融した3%DNAグレードのAGAローズゲルで覆われます。平らな水平面で2分間の安定化後。アガのバラが均一に硬化するように、型を氷の上に置いてセッティングを完成させます。

半球を含むゲルがセットされたら、型から取り出し、脳組織の周りをトリミングします。次に、ゲル包埋組織をバイブレーショントーンの試料ディスクに内側表面を上にして取り付け、シアノアクリレート接着剤で固定します。次に、氷冷組織調製媒体で満たされた振動試料トレイに椎間板を取り付け、脳を150マイクロメートルの厚さで切片化します。

RMS入りのスライスがブレードから放出されたら、小さなフラットヘッドスパチュラを使用して慎重にすくい取り、培養皿の中央に平らに置きます。組織は非常に壊れやすいため、スライスの取り扱いを最小限に抑えることが重要です。培養皿の培地の量は、脳の部分が動き回るのを防ぎながら、脳の部分を覆うのに十分なレベルに調整されます。

皿はラベル付けされ、インキュベーターに移されます。ドナーの脳は、レシピエントの脳と同様の方法で準備されますが、切片が250でカットされる点が異なります。マイクロメートルの厚さとスライスは氷に集められます。

コールドティッシュの準備。バッファースライスは、落射蛍光機能を備えた解剖顕微鏡の下に直ちに置かれます。RMSは、上衣下ゾーンから嗅球まで伸びる灰色のU字型の構造として見えます。

RMSは、マイクロ鉗子を使用して優しくマイクロダイセクトします。一方の鉗子はスライスを安定させるために使用され、もう一方の鉗子は、スライスから解放されるまでRMSの周りに小さな切り込みを入れるために使用されます。次に、切除されたRMSは、直径約200〜500マイクロメートルの小さなxエクスプランに切断されます。

この例では、赤色蛍光タンパク質であるTDトマトグラスを発現するマウスからナスを調製しています。ホストスライスが入った底皿をインキュベーターから取り出し、可視光を使用して解剖顕微鏡の下に置きます。RMSの最初のセグメントに小さな切開を行い、20マイクロリットルの先端を備えたピペーターを使用して、単一のドナーRMS ExplanをホストRMSの切開部位に移します。

エクスプランは、2つの組織間の接触を確立するために、切開部にそっと押し込まれます。この接触が安定していることを確実にするために、エクスプランはスライスと核の乏しい膜との間にわずかに押し込まれます。その後、皿をインキュベーターに少なくとも1時間戻し、切片がメンブレンに沈殿するのを待ちます。

神経芽細胞は、約1〜2時間後にexplanから宿主RMSに移動し始めるはずです。セルの移動は、非常に長い作動距離の20電力目標を使用して最適に視覚化されます。組織培養された問題は、インキュベーターから顕微鏡上のインキュベートチャンバーに移されます。

蛍光性神経芽細胞は、必要な解析の種類に応じて、0分から10分の範囲の間隔で画像化できます。当社の有機タイピックスライス培養プロトコルは、RMSにおける移動パターンと向きの一貫性のために、過去数年間で徹底的にテストされ、最適化されてきました。この例では、プロモーターのネスト下にTDトマトを発現させたマウスから得られたexplanから遊走する細胞の解析により、宿主RMSへの高度で迅速な移動が明らかになりました。

高倍率。タイムラプス解析では、20分間のイメージングセッションで、移動する神経芽細胞の全長の優れた解像度が示されています。イメージングが完了したら、スライスした皮膚を氷で固定し、冷たく新たに調製した、4%パラフォーム、アルデヒド、および移動ストリームのさまざまな成分の免疫染色剤で固定します。

この場合、蛍光免疫組織化学、細胞骨格タンパク質アクチンを染色したスライスを青色で、チューブリンを緑色で染色した蛍光免疫組織化学、細胞骨格タンパク質アクチンを青色で、チューブリンを緑色で染色した高倍率分析により、これらの成分が細胞内で不均一に発現していることが明らかになりました。移行の真っ只中。私たちのプロトコルには、忍耐力、練習、そして結果の準備と分析の両方にコミットした時間を必要とするいくつかの課題があります。

そこで、実験から最良の結果を得るのに役立ついくつかの有用な提案を次に示します。私たちの経験では、P 1からP 10の年齢範囲のマウスが最良の結果を提供します。ドナーとレシピエントの脳の年齢マッチングも、実験の再現性を向上させます。

ほとんどの試薬や培養皿は作りたてのものであるため、当社のスライスアッセイでは、1日で数時間の中断のない調製とイメージングが必要です。脳が収穫されたら、結果のステップをできるだけ早く達成する必要があります。斬首とスライスの準備の間に、すべてのステップは氷を使用して実行する必要があり、解剖学的な混乱を避けるために、冷たい試薬と組織の操作を最小限に抑える必要があります。

これらの解剖に使用されるツールは無菌であり、生きた組織の操作のみのために予約されている必要があります。ホルムアルデヒドなどの固定剤と接触したことのあるツールは絶対に使用しないでください。スライスは通常、最大36時間生存可能で、24時間から36時間の間に移動、速度、および向きが目に見える減少を示します。

実験や分析を計画する際には、この制限に注意してください。