細胞種特異的局在の解析のためのヘテロカリオンのテクニック

本手順の全体的な目的は、2種類の異なる蛍光タンパク質を持つ単一のタンパク質を2つの異なる細胞株で発現させ、これらの細胞株を融合させることで、タンパク質の移動を追跡することです。これはまず、目的遺伝子に2種類の異なる蛍光タンパク質遺伝子のいずれかを融合させたプラスミドを、2つの異なる細胞型に導入することで達成されます。手順の第2ステップでは、これらの細胞を混合し、各細胞型でタンパク質を蓄積させます。

本手順の第3段階では、タンパク質合成を阻害した後、ポリエチレングリコールを用いて細胞を融合させます。本手順の最終段階では、蛍光顕微鏡によりタンパク質の局在を可視化します。最終的に、蛍光顕微鏡を通じて、タンパク質の局在や輸送挙動の変化を示す結果を得ることができます。

この手法は、細胞が形質転換するにつれて個々のタンパク質の機能や挙動がどのように変化するかなど、がん生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法は、形質転換細胞特有の変化に関する知見を提供できるだけでなく、細胞分化、発生生物学、細胞シグナル伝達などの他の研究にも応用可能です。

一般的に、この手法を初めて行う場合は、細胞株ごとにトランスフェクション条件および融合条件の最適化が必要となるため、困難が伴います。本プロトコルで最初に説明する細胞へのプラスミドDNA導入法はNU Nuclear Affection法です。この手法では、Lonza社製のNuclear Effectorソリューションを使用します。まず、継代後間もなく対数増殖期にある細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、剥離させて回収します。細胞の接着性が失われたら、血清含有培地を加えてトリプシンを中和し、1500 Gで5分間遠心分離して細胞を回収します。

組織培養フード内で、滅菌済みのカバーガラスを6ウェルプレートに配置し、各ウェルに完全培地を1.5 millilitersずつピペッティングします。プレートに蓋をして、平衡化させるため細胞培養インキュベーターに移動させます。

遠心分離後、チューブをフードに移して上清を吸引し、細胞ペレットを最小量のPBSで再懸濁します。次に、細胞数をカウントし、細胞懸濁液を滅菌済みマイクロ遠心チューブに分注します。これにより、1サンプルあたり約5×10⁵個の細胞が得られます。再度、1500 Gで5分間遠心分離します。

遠心分離が完了したら、チューブを細胞培養フード内に置き、SNAを吸引して慎重に再懸濁します。各チューブの細胞を100 µLの室温核エフェクター溶液で懸濁してください。次に、各サンプルに5 µgのプラスミドDNAを加え、サンプルを核エフェクターQ veteに転送して蓋をします。

気泡が入らないように注意してください。サンプルqveをQ vetホルダーに挿入します。適切な核エフェクタープログラムを選択し、開始してください。

死亡率を最小限に抑えつつ最適な導入効率を確立するために、事前にテストを行い、最も適切なプログラムを選択する必要がある場合があります。その後、細胞を混合集団として、またはコントロールとして個別に6ウェルプレートに播種します。プレートをインキュベーターに戻し、細胞を12時間回復させます。

プラスミドの一過性発現について実演する2番目の方法は、kagen導入試薬を用いたトランスフェクションです。まず、滅菌済みの遠心チューブ内で、各プラスミドDNAサンプル0.8 µgを200 µLのECバッファーに加えます。次に、各サンプルに6.4 µLのエンハンサー試薬を加えます。

チューブを軽く叩いて短時間混合し、室温で2分間インキュベートします。この短いインキュベーションの後、各サンプルに20 µLの影響試薬を添加します。各チューブを叩いて混合し、室温で15分間インキュベートします。

インキュベーション中に、実験に使用する2つの細胞株を準備します。トランスフェクションを行う細胞は、最近継代されており、コンフルエンシーが約80%の対数増殖期である必要があります。細胞をPBSで1回洗浄し、10% FBSを含む新鮮なDMEM 1.5 millilitersを再添加します。

DNAトランスフェクション試薬を15分間インキュベートした後、各サンプルに10%FBS含有DMEM培地を1.2 milliliters加え、ピペッティングで混合します。その後、速やかに複合液約700 microlitersを、6ウェルプレートの2つのウェルそれぞれに滴下して移します。プレートを旋回させて混合してください。細胞培養フード内のインキュベーターで、少なくとも3時間トランスフェクションを行います。必要に応じて、6ウェルプレートの各ウェルに滅菌済みのカバーガラスを1枚ずつ配置してください。

細胞接着を向上させるために、コーティング済みのカバーガラスを使用することができます。次に、トランスフェクションした細胞をPBSで2回洗浄し、最小限のトリプシン処理により細胞を回収します。これは、各ウェルに100 µLのトリプシン溶液を加え、プレートを攪拌して全体に行き渡らせることで行います。

その後、直ちに残留したtrypsinを吸引します。10%FBSを含む新鮮なDMEM 1.5 millilitersで細胞を再懸濁し、残ったtrypsinを中和させ、混合集団として、またはコントロールとして個別に細胞をプレートに播種します。カバーガラスを入れた6ウェルプレートを用い、細胞培養インキュベーター内で12時間、細胞を回復させます。

トランスフェクション方法に関わらず、ヘテロキャリアインフュージョンを作成する手順は同一です。トランスフェクション後、ウェルから培養液を除去し、PBSで細胞を2回洗浄します。次に、さらなるタンパク質合成を抑制するために、シクロヘキシミドで細胞を処理することを推奨します。

培養液に100 µg/mLの濃度でcyclo heideを添加して細胞を覆い、細胞培養インキュベーターで2時間インキュベートします。2時間後、細胞をインキュベーターから取り出し、PBSで2回洗浄します。融合を開始させるため、無血清DMEMで調製した50%ポリエチレングリコール1000溶液を細胞に加え、125秒間インキュベートします。

室温でPEG溶液を除去し、PBSで洗浄して残留PEGを取り除きます。次に、37 °Cに加温した10% FBS添加DMEMを2 mL加えます。細胞培養インキュベーター内で、細胞を18〜24時間インキュベートします。

18～24時間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞をPBSで2回洗浄します。次に、各ウェルにPBSで調製した4%パラホルムアルデヒドを1 mLずつ分注し、15分間緩やかに攪拌します。

インキュベーションの間に、dpiを含む封入剤を1滴滴下して、使用する顕微鏡スライドグラスを準備します。次に、固定した細胞をPBSで2回洗浄し、小型ピンセットで各カバーガラスを慎重に取り除きます。組織片に残ったPBSをティッシュで吸い取った後、封入剤とtappiを滴下した顕微鏡スライドグラスの上に、細胞面を下にして配置します。

ティッシュペーパーでスライド上の余分な封入剤を取り除き、カバーグラスの端を封止します。マニキュアを用いて封止した後、共焦点顕微鏡またはエピ蛍光顕微鏡で細胞を観察できます。このフローチャートでは、細胞型特異的なタンパク質の局在を解析するためのヘテロ法の3つの基本ステップを示しています。

ポリエチレングリコール1000を用いた、蛍光タグ付きタンパク質を発現するプラスミドの細胞融合への導入および蛍光顕微鏡によるイメージングを行い、これらのエピ蛍光画像に示した。一次包皮線維芽細胞および非小細胞肺癌細胞株H 1299において、GFPタグ付き鶏アニミアウイルスVP3タンパク質を発現させた自己融合コントロールでは、タンパク質は主に細胞質に局在している。同様のVP3タンパク質にDsRedをタグ付けした自己融合コントロールでは、主に核への局在が見られる。一次包皮線維芽細胞とH 1299細胞をヘテロ融合させると、形質転換細胞の物質が一次包皮線維芽細胞へ導入され、一次細胞由来のGFPタグ付きVP3の局在が核へと変化する。

本手順を実施する際は、成功が使用する特定の細胞型におけるトランスフェクション効率や、それら特定の細胞に対する融合条件の最適化に大きく依存することを念頭に置くことが重要です。本手順に続き、局在ダイナミクスのリアルタイム解析に関するさらなる疑問を解決するために、flipやfrapなどの他の手法を行うことができます。このビデオを視聴することで、蛍光タグ付きタンパク質を導入し細胞融合を形成させることにより、細胞型特異的なタンパク質局在を評価する方法について十分に理解できるはずです。