Name: 細胞種特異的局在の解析のためのヘテロカリオンのテクニック (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶヘテロカリオン法による細胞種特異的タンパク質局在解析の手法。蛍光標識融合タンパク質とポリエチレングリコール細胞融合を用いて、タンパク質の核質シャトリングと局在変化を可視化し、がん生物学や細胞分化研究に応用する。

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我々は、資金調達のために化学と生化学のウースター工科大学部に感謝の意を表します。

1。細胞株のトランスフェクショントランスフェクションの方法1 （増加の主細胞のトランスフェクション効率のためのロンザのNucleofection） <ol><li>細胞は、最近の経過とトランスフェクションの前に、対数増殖期にである必要があります。 phophateで細胞を洗浄するトリプシン処理により生理食塩水（PBS）と収穫のセルをバッファ。 </li><li> 5分間1500 × gで遠心分離により細胞を収集する。 </li><li> 6ウェルプレートに滅菌カバースリップを追加。カバースリップは、強化された細胞接着のために被覆されてもよい。場所1.5培地の添加（この場合はダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS））各ウェルに、インキュベーター内のメディアを平衡。 </li><li> （PBS）リン酸緩衝生理食塩水の最小限の量でトリプシン処理し、再懸して細胞を収集する。 </li><li>細胞をカウントし、サンプルあたり〜5 × 10 5細胞を提供するために再懸濁の正しい量を遠心してください。 </li><li>サンプルあたり100μl室温のNucleofectorソリューションで慎重に細胞を再懸濁します。 </li><li> 5μgのプラスミドDNAを細胞懸濁液100μLを組み合わせると、気泡を含まないように注意しながらNucleofectorキュベットにサンプルを移す。 </li><li>適切なNucleofectorプログラムを選択し（これは最低限の死亡率との最適なトランスフェクション効率を確立する前のテストが必要な場合があります）。 </li><li> Nucleofectorキュベットホルダに細胞/ DNA懸濁液を含むキュベットを挿入し、選択したプログラムを開始。 </li><li>完了すると、キュベットを取り出し、（6 - ウェルプレートから撮影）に予め平衡化培地の〜500μLを加える。 </li><li>すぐにウェルあたり1.5mlの最終容量で6ウェルプレートに試料を移す。細胞はコントロールのために、混合集団または個別にどちらに播種してください。 </li></ol>トランスフェクションの方法2 （細胞株に対してキアゲンEffecteneトランスフェクション） <ol><li>最初の200μLECのバッファへの各プラスミドDNA試料の0.8μgを添加することによりキアゲンEffectene試薬を用いてトランスフェクション複合体を準備します。 </li><li>各サンプルに6.4μLエンハンサーの試薬を追加、チューブをフリックすることで簡単にミックス、そして室温で2分間インキュベートする。 </li><li>チューブをフリックすることにより、各サンプル、ミックスに20μLEffectene試薬を追加し、室温で15分間反応させます。 </li><li>このインキュベーションの間、トランスフェクションのために関心のある2つの細胞株を準備する。最近継代細胞（&lt;80％コンフルエント）リン酸で一度洗浄は生理食塩水（PBS）を。バック1.5mLの新鮮な暖めたと平衡化した増殖培地（ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）この場合、10％ウシ胎児血清（FBS））を追加します。 </li><li>トランスフェクション複合体は、15分間インキュベートした後、各サンプルにメディアを1.2 mLを転送する。ピペッティング、そしてすぐに6 - ウェルプレートの二つのウェルの各々に複合体の〜700μLを転送して混合。滴下を追加し、プレートを旋回して静かに混和。細胞は少なくとも3時間トランスフェクションすることができます（セルのタイプによって異なる場合があります）。 </li><li>新しい6ウェルプレートに滅菌カバースリップを追加。カバースリップは、強化された細胞接着のために被覆されてもよい。 </li><li>細胞はトランスフェクションした後、各ウェルに約100μLトリプシン溶液を加える簡単に完全にコートの各ウェルをするためにプレートを攪拌し、そして即座にトリプシンをオフに吸引し、PBSで細胞を2回洗浄し、最小限のtrysinizationにより細胞を収穫。細胞が解除したら、1.5 mLの新鮮な培地を加​​える。 </li><li>この時点で、細胞を滅菌カバーグラスの上に混在するか、別の集団（コントロール用）のいずれかでプレーティングする必要があります。 </li><li>細胞は12時間で回復することができます。 </li></ol> 2。細胞融合<ol><li>細胞から培地を取り出して、PBSで2回洗浄する。 </li><li>この時点で、それはタンパク質合成を阻害するシクロヘキシミド（100μg/ mL）を持つ細胞を処置することをお勧めします。細胞は2時間インキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄することができます。 </li><li>室温で125秒のために無血清DMEMに50％ポリエチレングリコール1000（PEG 1000）のソリューションに公開することにより細胞を融合させる。 </li><li> PEG 1000ソリューションを削除し、そして2mLの新鮮暖めと平衡メディアを追加するには、PBSで細胞を洗浄する。 </li><li> 24時間 - 細胞が18のためにインキュベートすることができます。 </li></ol>蛍光顕微鏡<ol><li>文化メディアを取り出し、そしてPBSで細胞を2回洗浄する。 </li><li>各ウェルに4％パラホルムアルデヒド溶液（PBS中）1 mLを加えることによって細胞を固定する。ゆっくりと15分間振とうする。 </li><li> PBSで2回固定された細胞を洗う。 </li><li>慎重にプレートからカバースリップを削除する、余分なPBSをオフに放出する。に顕微鏡封入剤の一滴（90％グリセロール、100mMのトリスpH7.5、2％DABCO（1,4 - diazabicoyclo -オクタン）を含むDAPI（4',6 -ジアミジノ-2 - フェニル）を搭載したスライド。反転</li><li>スライド上の過剰なマウンティングメディウムを外し、シールCOverは、マニキュアでスリップ。 </li><li>共焦点または落射蛍光顕微鏡を介して細胞を視覚化する。 </li></ol> 3。代表的な結果図2は、一次線維芽細胞およびH1299非小細胞肺癌細胞を用いて例のヘテロカリオンの実験を示しています。この実験の目的のタンパク質（チキン貧血ウイルス- VP3は）落射蛍光顕微鏡により可視化として、形質転換細胞の種類の一次細胞型および核局在化に主に細胞質局在が表示されます。タンパク質は、H1299細胞における主要な包皮繊維芽細胞（PFF）またはDsRedのGFPのどちらかへの融合（pEGFPを- N1ベクターを、Clontech社）（DsRedを- N1ベクターを、Clontech社）として表されます。自己融合を含むコントロールサンプル（上の2行）は、定常状態の局在パターンの変化なしで多核細胞が表示されます。このような変更は、特に核融合の条件またはsyncitiaの形成に感受性のために発生する可能性があります。ヘテロカリオンの融合（一番下の行）は、GFP融合主細胞由来の形質転換細胞の材料の導入に応じて、DsRedを融合蛋白質と蛋白質と共局在の核エントリを示しています。示した例は、両方fluoroprotein信号の存在によって示される2つだけのセル、各タイプの1つ、に起因する比較的まれなヘテロカリオンの融合です。局在遷移のこれらのタイプの検出に加えて、核 - 細胞質シャトル活動は簡単に両方の核内の単一の蛍光物質の存在によって検出することができます。午前1時01細胞融合を調べて、翻訳の抑制に依存するであろうときに決定のこのタイプは明らかである。 <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。主な線維芽細胞とH1299の非小細胞癌細胞を用いたヘテロカリオンの方法のフローチャート。関心の遺伝子は、二つの蛍光タンパク質遺伝子のいずれかにインフレーム融合を生成するために複製されます。細胞株は、一過性のどちらかコンストラクトをトランスフェクトし、回復するために許可されています。ヘテロカリオンの形成は、さらにインキュベートしたポリエチレングリコール（PEG）による簡単な処理により誘導される。最後に、目的のタンパク質のサブ細胞内局在を蛍光顕微鏡の様々な形態を用いて観察される。 <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。核細胞質人身売買とチキンの貧血ウイルスVP3タンパク質の活性を往復には、ヘテロカリオンの融合により視覚化した。一番上の行：DsRedタンパク質- VP3を発現している自己融合H1299細胞の代表画像中段：。。PEG融合後にGFP - VP3を発現している主要な包皮線維芽細胞（PFF）の代表落射蛍光画像下段：PFFとH1299細胞のヘテロカリオンの融合。黄色は、GFPとDsRedの信号の共局在を示している。細胞は、ライカAF6000E蛍光顕微鏡とライカのイメージングソフトウェアを使用して画像化した。

<ol><li>Belaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIPing+heterokaryons+to+analyze+nucleo-cytoplasmic+shuttling+of+yeast+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins.</a> RNA. 12, 921-930 (2006).</li>
<li>Bhaumik, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+target+of+a+transcriptional+activator+revealed+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer.</a> Genes Dev. 18, 333-343 (2004).</li>
<li>Cohen, H. R., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+exhibits+nuclear+retention+and+exhibits+reduced+association+with+the+export+factor+TAP%2FNXF1%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1.</a> Chromosoma. 116, 373-383 (2007).</li>
<li>Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dapper1+is+a+nucleoplasmic+shuttling+protein+that+negatively+modulates+Wnt+signaling+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus.</a> J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).</li>
<li>Grespin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+Hormone+Receptor+%CE%B11+Follows+a+Cooperative+CRM1%2FCalreticulin-mediated+Nuclear+Export+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).</li>
<li>Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptin+Nucleocytoplasmic+Shuttling+Is+Required+for+Cell+Type-Specific+Localization%2C+Apoptosis%2C+and+Recruitment+of+the+Anaphase-Promoting+Complex%2FCyclosome+to+PML+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies.</a> J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).</li>
<li>Jeffries, S., Capobianco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+by+Notch+requires+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization.</a> Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).</li>
<li>Keaton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+trafficking+of+G2%2FM+regulators+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).</li>
<li>Ling, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear-Cytoplasmic+Shuttling+Is+Not+Required+for+the+Epstein-Barr+Virus+EBNA-LP+Transcriptional+Coactivation+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function.</a> J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).</li>
<li>Lin, X. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RXR%CE%B1+acts+as+a+carrier+for+TR3+nuclear+export+in+a+9-cis+retinoic+acid-dependent+manner+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells.</a> J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).</li>
<li>Vissinga, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Export+of+NBN+Is+Required+for+Normal+Cellular+Responses+to+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation.</a> Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).</li>
<li>Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+p19Arf+localization+accompany+apoptotic+crisis+during+pre-B-cell+transformation+by+Abelson+murine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus.</a> J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ヘテロカリオンのプロトコルは、細胞型特異的局在の挙動だけでなく、核 - 細胞質シャトル活動の特性評価のための効率的かつ容易に解釈する方法を提供するここに紹介。このメソッドは、蛍光分析の感度だけでなく、画像の生きている細胞の能力を活用し、タンパク質のダイナミクスの研究を行う。技術は簡単に多くの異なる細胞タイプに適応し、ライブや固定細胞のイメージングの両方の影響を受けやすいです。例えば、倒立蛍光顕微鏡は、ライブイメージングやタイムラプスビデオキャプチャに使用することができます。これとは対照的に、マウントされている細胞は、定常状態の局在の決定または離散ローカリゼーションの詳細な共焦点イメージングのための落射蛍光顕微鏡のいずれかで使用することができます。また、このような光退色後の蛍光回復（FRAP）、または退色で蛍光損失（FLIP）などの技法は、ローカリゼーション速度1の判定に使用することができます。プロトコルの代替蛍光色素の取り込みは、コンサート2で実施される蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）などのタンパク質相互作用の実験のためにできるようになります。このようなレプトマイシンBまたはドミナントネガティブとして細胞輸送の様々な阻害剤は、GTPアーゼの構造が特定のインポートまたはエクスポートの経路5,6,9への依存を確立するために使用することができる蘭。 <ul><li>往復の活性が関与する特定の実験では、ケアが新たなタンパク質の合成に起因する局在の影響を避けるようにしなければならない。これらのケースでは、翻訳の阻害剤または期間限定ポイントを使用する必要があります。しかし、翻訳阻害に起因するアーティファクトは、可能性は残っている。各セルのタイプのいずれかを含む細胞融合は、ほとんどの往復とローカライゼーションの行動の明確な解釈のために望まれている。細胞数と融合条件（タイミングや濃度）の最適化は、良好な1:1の融合イベントを促進するために必要な場合があります。 </li><li>プロトコルの特定のステップの最適化が使用される特定の細胞タイプに応じて必要となることに注意することは重要です。このような融合効率、トランスフェクション効率、および融合後の生存率などの実験手順の側面は、細胞型との間で大きく異なることがあります。特に、主要な細胞型は、複雑な培養条件と低いトランスフェクション効率のために管理するために挑戦することができます。このようなロンザNucleofector装置のような技術の使用は、細胞だけでなく、劇的に増加したトランスフェクション効率の迅速な処理を可能にすることができる。さらに、エレクトロポレーション法は続く核融合のステップへの懸濁液中の細胞を簡単に転送が可能になります。 </li></ul>

<table><tbody><tr><td>Effectene試薬</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023602</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td>高グルコース</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone血清 (ウシ胎児)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6ウェルプレート</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>528875-25GM</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2522-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector HDFキット</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞種特異的局在の解析のためのヘテロカリオンのテクニック

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

タンパク質のかなりの数は、細胞内輸送やシャトルnucleocytolasmicによって規制されている。これらのタンパク質は、核のインポート/ RNAとタンパク質の輸出、転写調節、およびアポトーシスを含む細胞機能の多様な配列を表示します。興味深いことに、細胞分裂、分化および変換を含む、主要な携帯電話再編は、多くの場合、3,4,8,10などの活動を含む。これらのタンパク質と、それぞれの調節機構の詳細な研究は、これらの局在の変化のための刺激は、とらえどころのないことができるよう挑戦し、そして自分自身が非常にダイナミックで追跡することが困難な場合も動作することができます。携帯電話発癌を対象とした研究は、例えば、理解の経路と6,7,11,12正常な初代培養細胞や形質転換細胞間で異なるタンパク質の活動の恩恵を受け続けることでしょう。として多くのタンパク質は、方法が効率的にこれらのタンパク質と彼らは薬剤が標的とするため発癌とのオープン新たな分野への理解を向上させるために立って参加する経路を特徴づけるために、変換中または変換の結果として局在変化を示す。 ここでは、タンパク質輸送の解析方法を提示し、プライマリおよび形質転換哺乳動物の細胞間のアクティビティを往復。このメソッドは、定常状態または動的なタンパク質の局在を検出するために使用できる柔軟なプロトコルを提供するために、蛍光顕微鏡によるヘテロカリオンの融合の生成を兼ね備えています。図1に示すように、2つの別個の細胞型は、一時的に目的の遺伝子に接続されているfluoroproteinの遺伝子を有するプラスミド構築物でトランスフェクトされています。発現後、細胞をポリエチレングリコールを用いて融合させ、及びタンパク質の局在は、その後の様々な方法を用いて画像化することができます。ここで紹介するプロトコールは、特別なテクニックが追加される可能性があるために基本的なアプローチです。

細胞タイプ特異的タンパク質の局在化の特性評価と核細胞質間輸送のための柔軟かつ効率的な方法が記載されている。このヘテロカリオンのアプローチは、細胞融合後の画像の蛋白質のローカリゼーションへの蛍光標識融合タンパク質を使用しています。プロトコルは、定常状態の局在やライブセルイメージングに基づいて、より動的な決定に適している。

多くのタンパク質は、細胞内輸送または核細胞質シャトリングによって制御されています。これらのタンパク質は、多様な...

本手順の全体的な目的は、2種類の異なる蛍光タンパク質を持つ単一のタンパク質を2つの異なる細胞株で発現させ、これらの細胞株を融合させることで、タンパク質の移動を追跡することです。これはまず、目的遺伝子に2種類の異なる蛍光タンパク質遺伝子のいずれかを融合させたプラスミドを、2つの異なる細胞型に導入することで達成されます。手順の第2ステップでは、これらの細胞を混合し、各細胞型でタンパク質を蓄積させます。本手順の第3段階では、タンパク質合成を阻害した後、ポリエチレングリコールを用いて細胞を融合させます。本手順の最終段階では、蛍光顕微鏡によりタンパク質の局在を可視化します。最終的に、蛍光顕微鏡を通じて、タンパク質の局在や輸送挙動の変化を示す結果を得ることができます。この手法は、細胞が形質転換するにつれて個々のタンパク質の機能や挙動がどのように変化するかなど、がん生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法は、形質転換細胞特有の変化に関する知見を提供できるだけでなく、細胞分化、発生生物学、細胞シグナル伝達などの他の研究にも応用可能です。一般的に、この手法を初めて行う場合は、細胞株ごとにトランスフェクション条件および融合条件の最適化が必要となるため、困難が伴います。本プロトコルで最初に説明する細胞へのプラスミドDNA導入法はNU Nuclear Affection法です。この手法では、Lonza社製のNuclear Effectorソリューションを使用します。まず、継代後間もなく対数増殖期にある細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、剥離させて回収します。細胞の接着性が失われたら、血清含有培地を加えてトリプシンを中和し、1500 Gで5分間遠心分離して細胞を回収します。組織培養フード内で、滅菌済みのカバーガラスを6ウェルプレートに配置し、各ウェルに完全培地を1.5 millilitersずつピペッティングします。プレートに蓋をして、平衡化させるため細胞培養インキュベーターに移動させます。遠心分離後、チューブをフードに移して上清を吸引し、細胞ペレットを最小量のPBSで再懸濁します。次に、細胞数をカウントし、細胞懸濁液を滅菌済みマイクロ遠心チューブに分注します。これにより、1サンプルあたり約5×10⁵個の細胞が得られます。再度、1500 Gで5分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、チューブを細胞培養フード内に置き、SNAを吸引して慎重に再懸濁します。各チューブの細胞を100 µLの室温核エフェクター溶液で懸濁してください。次に、各サンプルに5 µgのプラスミドDNAを加え、サンプルを核エフェクターQ veteに転送して蓋をします。気泡が入らないように注意してください。サンプルqveをQ vetホルダーに挿入します。適切な核エフェクタープログラムを選択し、開始してください。死亡率を最小限に抑えつつ最適な導入効率を確立するために、事前にテストを行い、最も適切なプログラムを選択する必要がある場合があります。その後、細胞を混合集団として、またはコントロールとして個別に6ウェルプレートに播種します。プレートをインキュベーターに戻し、細胞を12時間回復させます。プラスミドの一過性発現について実演する2番目の方法は、kagen導入試薬を用いたトランスフェクションです。まず、滅菌済みの遠心チューブ内で、各プラスミドDNAサンプル0.8 µgを200 µLのECバッファーに加えます。次に、各サンプルに6.4 µLのエンハンサー試薬を加えます。チューブを軽く叩いて短時間混合し、室温で2分間インキュベートします。この短いインキュベーションの後、各サンプルに20 µLの影響試薬を添加します。各チューブを叩いて混合し、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション中に、実験に使用する2つの細胞株を準備します。トランスフェクションを行う細胞は、最近継代されており、コンフルエンシーが約80%の対数増殖期である必要があります。細胞をPBSで1回洗浄し、10% FBSを含む新鮮なDMEM 1.5 millilitersを再添加します。DNAトランスフェクション試薬を15分間インキュベートした後、各サンプルに10%FBS含有DMEM培地を1.2 milliliters加え、ピペッティングで混合します。その後、速やかに複合液約700 microlitersを、6ウェルプレートの2つのウェルそれぞれに滴下して移します。プレートを旋回させて混合してください。細胞培養フード内のインキュベーターで、少なくとも3時間トランスフェクションを行います。必要に応じて、6ウェルプレートの各ウェルに滅菌済みのカバーガラスを1枚ずつ配置してください。細胞接着を向上させるために、コーティング済みのカバーガラスを使用することができます。次に、トランスフェクションした細胞をPBSで2回洗浄し、最小限のトリプシン処理により細胞を回収します。これは、各ウェルに100 µLのトリプシン溶液を加え、プレートを攪拌して全体に行き渡らせることで行います。その後、直ちに残留したtrypsinを吸引します。10%FBSを含む新鮮なDMEM 1.5 millilitersで細胞を再懸濁し、残ったtrypsinを中和させ、混合集団として、またはコントロールとして個別に細胞をプレートに播種します。カバーガラスを入れた6ウェルプレートを用い、細胞培養インキュベーター内で12時間、細胞を回復させます。トランスフェクション方法に関わらず、ヘテロキャリアインフュージョンを作成する手順は同一です。トランスフェクション後、ウェルから培養液を除去し、PBSで細胞を2回洗浄します。次に、さらなるタンパク質合成を抑制するために、シクロヘキシミドで細胞を処理することを推奨します。培養液に100 µg/mLの濃度でcyclo heideを添加して細胞を覆い、細胞培養インキュベーターで2時間インキュベートします。2時間後、細胞をインキュベーターから取り出し、PBSで2回洗浄します。融合を開始させるため、無血清DMEMで調製した50%ポリエチレングリコール1000溶液を細胞に加え、125秒間インキュベートします。室温でPEG溶液を除去し、PBSで洗浄して残留PEGを取り除きます。次に、37 °Cに加温した10% FBS添加DMEMを2 mL加えます。細胞培養インキュベーター内で、細胞を18〜24時間インキュベートします。18～24時間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞をPBSで2回洗浄します。次に、各ウェルにPBSで調製した4%パラホルムアルデヒドを1 mLずつ分注し、15分間緩やかに攪拌します。インキュベーションの間に、dpiを含む封入剤を1滴滴下して、使用する顕微鏡スライドグラスを準備します。次に、固定した細胞をPBSで2回洗浄し、小型ピンセットで各カバーガラスを慎重に取り除きます。組織片に残ったPBSをティッシュで吸い取った後、封入剤とtappiを滴下した顕微鏡スライドグラスの上に、細胞面を下にして配置します。ティッシュペーパーでスライド上の余分な封入剤を取り除き、カバーグラスの端を封止します。マニキュアを用いて封止した後、共焦点顕微鏡またはエピ蛍光顕微鏡で細胞を観察できます。このフローチャートでは、細胞型特異的なタンパク質の局在を解析するためのヘテロ法の3つの基本ステップを示しています。ポリエチレングリコール1000を用いた、蛍光タグ付きタンパク質を発現するプラスミドの細胞融合への導入および蛍光顕微鏡によるイメージングを行い、これらのエピ蛍光画像に示した。一次包皮線維芽細胞および非小細胞肺癌細胞株H 1299において、GFPタグ付き鶏アニミアウイルスVP3タンパク質を発現させた自己融合コントロールでは、タンパク質は主に細胞質に局在している。同様のVP3タンパク質にDsRedをタグ付けした自己融合コントロールでは、主に核への局在が見られる。一次包皮線維芽細胞とH 1299細胞をヘテロ融合させると、形質転換細胞の物質が一次包皮線維芽細胞へ導入され、一次細胞由来のGFPタグ付きVP3の局在が核へと変化する。本手順を実施する際は、成功が使用する特定の細胞型におけるトランスフェクション効率や、それら特定の細胞に対する融合条件の最適化に大きく依存することを念頭に置くことが重要です。本手順に続き、局在ダイナミクスのリアルタイム解析に関するさらなる疑問を解決するために、flipやfrapなどの他の手法を行うことができます。このビデオを視聴することで、蛍光タグ付きタンパク質を導入し細胞融合を形成させることにより、細胞型特異的なタンパク質局在を評価する方法について十分に理解できるはずです。

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Biology

生物学

このビデオは、マウス海馬歯状回(DG)のグリア細胞と幹細胞から無傷の核を単離する方法を示しています。DG組織は、冷ホモジナイゼーションバッファー中で機械的に解離し、核を放出します。組織破片やその他の放出されたオルガネラは廃棄され、核はDNA染色とニューロン核抗原(NeuN)に特異的な蛍光色素標識抗体で染色されます。次に、蛍光活性化核ソーティングを使用して、非ニューロン細胞のNeuN陰性核を単離します。...

海馬歯状回における非神経細胞から核を分離する技術

ショウジョウバエの組織は、しばしば、細胞型の不均一な混合物を含有する。特定の組織の特定の細胞型における遺伝子発現を調べるために、核が遺伝的にタグ付けし、続いて親和性に基づくアプローチを用いて単離することができる。単離された核は、遺伝子発現解析およびクロマチン免疫沈降などの下流用途に使用することができる。...

からのタグ付き核の親和性に基づく分離<em&gt;ショウジョウバエ</em遺伝子発現解析のための&gt;組織

このプロトコルの目標は、蛍光活性化細胞選別(FACS)技術を使用して、細胞型特異的な遺伝子発現、エピジェネティックマーカー、およびまたはタンパク質発現のその後の解析のために、特定のタイプの神経細胞を選別することです。...

蛍光活性化セルソーティングを用いたラット脳組織における細胞型特異的遺伝子発現の検討

ここでは、ヒト細胞内の内因性および外因性のセントロメア-動糖体タンパク質を検出し、固定(パラホルムアルデヒド、アセトン、またはメタノール固定)の使用による間接免疫蛍光染色により、セントロメア-キネトコアでのこれらのタンパク質レベルを定量するプロトコールを報告します。...

内因性の免疫蛍光分析および外因性セントロメア、動原体タンパク質

ここでは、単離の前、およびその後の単一細胞転写物の特徴付けのために、ニューロン細胞タイプを分類するためのコンビナトリアルアプローチを提示する。このプロトコルは、RNAシーケンシング（RNA-Seq）のためのサンプルの調製を最適化し、細胞多様性の強化された理解のために特別に設計された方法論を記載する。...

網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-Seq

このプロトコルでは、ラベルおよび Histone2B GFP BacMam 2.0...

細胞分裂時の染色体分配の生きているセルイメージ投射

生きた細胞の細胞内小器官のマルチカラー単一膜蛋白質のローカリゼーションのためのプロトコルを紹介します。蛍光物質を添付、自己ラベリング タンパク質を使用します。~ 18 の精度と同じ細胞小器官の異なる膜コンパートメントに位置するタンパク質をローカライズできる...

単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡

一括遺伝子発現測定クラウド個々 のセル違い異種細胞集団で。ここでは、プロトコルについて述べる方法単一細胞遺伝子発現解析とインデックスの不均一性の線引きによって蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) を並べ替えを結合でき、immunophenotypically...

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

細胞構造と機能の摂動のためのゲノム編集細胞株の細胞融合

私たちは、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、RNAP...

高密度核環境下のクロマチン調査のための多ラベル単分子局在顕微鏡プロトコル

学ぶヘテロカリオン法による細胞種特異的タンパク質局在解析の手法。蛍光標識融合タンパク質とポリエチレングリコール細胞融合を用いて、タンパク質の核質シャトリングと局在変化を可視化し、がん生物学や細胞分化研究に応用する。

細胞種特異的局在の解析のためのヘテロカリオンのテクニック

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