蛾嗅覚系の電気生理学的測定

本実験の全体的な目的は、昆虫の神経系から嗅覚反応を容易に記録できることを示すことです。これは、生きた蛾を固定し、触角または個々のニューロンに電極を接続して、匂い刺激による反応を記録することで達成されます。第一段階として、接地として生理食塩水で満たされたガラス電極を眼に刺入します。第二段階として、固定した蛾のいずれかに生理食塩水で満たされたガラス電極を挿入し、これにより、嗅覚受容ニューロンからの単一ユニット反応を記録するためのアンテナグラムという形式で電気的反応を記録することが可能になります。

記録電極を触角の基部に挿入します。次に、アンテナ信号を増幅し、信号を記録・保存するためにアナログ-デジタル変換器へ送ります。その結果、記録された電気信号（EAG信号またはスパイクの形式）に基づき、濃度依存的な臭気誘発反応が得られます。

私たちは、固定したNaval orangeの生きた蛾からEnterogramを記録する新しい手法を開発しました。この技術の主な利点は、調製状態が長時間持続するため、同一の蛾を用いて複数回の反応を記録できること、また、同一の蛾を用いて触角の個々のセンサーからのシングルユニット反応を記録できることです。カリフォルニア州において重要な農業害虫であるため、私たちはNaval orangeに着目しました。

しかしながら、この手法は他の鱗翅目昆虫にも適用可能であり、嗅覚機能に関する基礎的な問いへのアプローチだけでなく、新たな誘引剤の開発にも利用できます。本研究では、ナバルオレンジウォーム（Ullo Ella）を用いて蛾の嗅覚系について検討します。

昆虫コロニーは、温度約28°C、相対湿度約75%、16時間明期・8時間暗期の光周期に設定された環境チャンバー内で、小麦ふすま飼料を用いて維持します。プラスチックボックスに水で湿らせたペーパータオルを最大10層まで敷き、羽化したばかりの蛾用の容器を作成します。毎日、羽化した蛾を回収して雌雄を判別し、プラスチックボックスに移します。電気生理学的記録の準備として、空気循環を確保するためにボックスに穴あきカバーをかけます。

まず、200 µL ピペットチップを切り、先端の直径が約 2 mm になるようにして、蛾用のホルダーを作成します。EAG または SSR の場合は、羽化後 2 〜 4 日の蛾を選択してください。湿らせたティッシュペーパーの端を用いて、チップとは反対側から蛾をピペットの中に挿入し、ゆっくりとピペットチップ側へ押し込みます。

触角と頭部の一部が先端から突き出るまで、蛾を押し込みます。非乾燥性の粘土で頭部を覆い、片眼の一部と2本の触角だけを露出させて、露出した頭部を固定します。先端径1µm未満のガラス電極を用い、蛾の標本をエレクトログラム・マイクロマニピュレーターの2つの電極ホルダー間のプラットフォーム上に配置します。電極にCentum limb Ringer液を充填します。

顕微鏡で観察しながら、眼の露出した部位に電極を1本刺入します。これが参照電極となります。次のステップは、触角に記録電極を配置することです。

オナガシロシタバガの雄の触角は多くの節からなり、各節には多数の毛状構造が付着しています。挿入図は、触角からの記録を容易にするためのillaの詳細を示す走査電子顕微鏡写真です。触角の遠位1〜2節を切除します。

次に、両方の触角を記録電極に挿入します。または、単一のsens記録を行う場合は、sensの基部に記録電極を挿入します。sensからの活動電位は高インピーダンスプリアンプで増幅され、USBインテリジェントデジタルアナログコンバーターに送られ、autos spikeソフトウェアを用いてオフラインで解析されます。

次のステップは、ミカンキクイムシの雌フェロモンブレンドの主要成分であるZZ 1113 HEXA deca Nowを用いて化学刺激剤を調製することです。この化学物質をヘキサンで希釈し、DIC希釈液を作成します。刺激剤溶液10 µLをワトマンろ紙に滴下します。10秒間静かに振とうし、溶媒を揮発させます。

ドラフトチャンバー内で、ストリップを5 mLのポリプロピレン製シリンジに入れ、ヘキサンのみを入れた空のシリンジを準備用のコントロールとして使用します。EAGまたはSSRは、刺激コントローラーによって20 mL/sで送られる加湿気流中に保持されます。化学刺激剤を含むシリンジを気流コントローラーに取り付けます。

2秒間のベースライン電気信号を記録します。次に、Airstreamに4 mL/sの刺激パルスを500ミリ秒間加えます。その後、さらに8秒間、電気信号の記録を継続します。

刺激の間隔は少なくとも1分間あけてください。この図は、固定した雄蛾の触角における、堅牢な用量依存的反応を示しています。雌のフェロモン成分であるCZ 1113 hexacoで刺激しました。

ヘキサンに対する反応。青色の線は、連続して提示された溶媒コントロールを示している。フェロモンの投与量を増やすにつれて、電図記録の振幅が順次大きくなっている。

この図は、雌フェロモン成分による刺激に応答したtrichandumからの細胞外シングルユニット記録を示しています。これらの記録は、用量依存的な興奮性反応を示しています。この手法を習得すれば、適切に行うことで数時間で完了させることができます。

本手法を用いる際は、コンタミネーションを避け、可能な限り純度の高い化学薬品を使用してください。