蛾嗅覚系の電気生理学的測定

本実験の全体的な目的は、昆虫の神経系から嗅覚応答を容易に記録できることを実証することです。これは、生きた蛾を固定し、触角または個々のニューロンに電極を接続して、嗅覚物質によって誘発される応答を記録することで達成されます。最初のステップとして、接地の電極として、生理食塩水で満たされたガラス電極を眼に刺入します。次に、固定した蛾のいずれかに生理食塩水で満たされたガラス電極を挿入し、嗅覚受容ニューロンから単一ユニット応答を記録するためのアンテナグラム形式での電気的応答の記録を可能にします。

記録電極を触角の基部に挿入します。次に、アンテナ信号を増幅し、信号を記録・保存するためにアナログ-デジタル変換器に送ります。その結果、記録された電気信号に基づき、EAG信号またはスパイクの形式で、用量依存的な odorant 誘発反応が得られます。

私たちは、固定したナビネルオレンジ（Naval orange）の生きたガからエンテログラムを記録する新しい手法を開発しました。この技術の主な利点は、準備した状態が長時間持続することであり、同一のガを用いて複数の反応を繰り返し記録できるほか、触角の個々のセンサーから単一ユニット反応を記録することも可能です。カリフォルニア州において重要な農業上の位置を占めているため、私たちはナビネルオレンジに焦点を当てています。

しかしながら、この手法は他の鱗翅目昆虫にも適用可能であり、基本的な嗅覚機能の解明だけでなく、新たな誘引剤の開発にも利用できます。本研究では、Navel Orange Worm（*Ullo Ella*）を用いて蛾の嗅覚系を調査します。

昆虫コロニーは、温度約28°C、相対湿度約75%、16時間明期・8時間暗期の光周期に設定された環境チャンバー内で、小麦ふすま飼料を用いて維持します。プラスチックボックスに水に浸したペーパータオルを最大10層敷き、羽化したばかりの蛾用の容器を作成します。毎日、羽化した蛾を回収して雌雄を判別し、プラスチックボックスに移します。電気生理学的記録の準備として、空気循環を確保するために、ボックスに穴あきカバーを被せます。

まず、200 µLピペットチップを切り、先端の直径が約2 mmになるようにして、ガのホルダーを作成します。EAGまたはSSRを行う場合は、羽化から2～4日後のガを選択します。湿らせたティッシュペーパーの端を用いて、チップとは反対側の端からピペットにガを挿入し、ゆっくりとピペットチップ側へ押し込みます。

触角と頭部の一部が先端から突き出るまで、ガを押し込みます。非乾燥性の粘土で頭部を覆い、片方の目のごく一部と2本の触角だけを露出させて、露出した頭部を固定します。先端径1 µm未満のガラス電極を用い、ガの標本をエレクトログラム・マイクロマニピュレーターのプラットフォーム上の2つの電極ホルダーの間に配置します。電極にCentum limb Ringer液を充填します。

顕微鏡で観察しながら、眼の露出部に電極1本を刺入します。これを参照電極として使用します。次のステップは、触角に記録電極を配置することです。

オニヒトリガの成虫（オス）の触角は多節構造であり、各節には多数の毛状構造が付着しています。挿入図は、触角からの記録を容易にするために、触角節（illa）の詳細を示す走査電子顕微鏡写真です。触角の末端から1〜2節を切り離します。

次に、両方の触角を記録電極に挿入します。あるいは、単一の感覚器（sens）の記録を行う場合は、感覚器の基部に記録電極を挿入します。感覚器からの活動電位は、高インピーダンス・プリアンプで増幅され、USBインテリジェントデジタルアナログコンバータに送られ、autos spikeソフトウェアを用いてオフラインで解析されます。

次のステップでは、 naval orange worm の雌フェロモン混合物の主要成分である ZZ 1113 HEXA deca Now を用いて化学刺激剤を調製します。この化学物質をヘキサンで希釈し、DIC希釈液を作成します。刺激溶液 10 µL を Watman ろ紙に滴下します。10秒間ゆっくりと振って、溶媒を蒸発させます。

ドラフトチャンバー内で、ストリップを5 mLのポリプロピレン製シリンジに入れ、ヘキサンのみを注入し、空のシリンジを用いて調製を制御します。EAGまたはSSRは、刺激コントローラーによって20 mL/sで供給される加湿気流中で保持されます。化学刺激剤が入ったシリンジを気流コントローラーに取り付けます。

ベースラインの電気信号を2秒間記録します。次に、4 mL/sの刺激パルスをAirstreamに500 ms間加えます。その後、さらに8秒間、電気信号の記録を継続します。

刺激の間隔は少なくとも1分あけてください。この図は、拘束した雄ガの触角から得られた、堅牢な用量依存的反応を示しています。刺激には、雌のフェロモン成分であるCZ 1113 hexacoを使用しました。

ヘキサンに対する反応。青線は連続してビークルコントロールを示しています。フェロモンの投与量が増えるにつれて、電気図の記録が次第に大きくなります。

この図は、雌フェロモン成分の刺激に応答したtrichandumからの細胞外単一ユニット記録を示しています。これらの記録は、用量依存的な興奮性反応を示しています。この手法を習得すれば、適切に行った場合に数時間で完了させることができます。

本手法を用いる際は、コンタミネーションを避け、可能な限り純度の高い化学薬品を使用してください。