Name: 蛾嗅覚系の電気生理学的測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 学ぶ蛾の嗅覚系電気生理学的測定法。ガラス電極を用いて触角や嗅覚受容ニューロンからの電気信号を記録し、臭化物質誘発応答を解析します。神経科学および昆虫感覚処理研究に応用可能です。

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USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582、NSF 0918177、およびBedoukian研究の定款によってサポートされています。

1。昆虫<ol><li>へそorangeworm、Amyelois transitella（ウォーカー）（鱗翅目：メイガ科）フレズノ、カリフォルニア州のアーモンドの木から採取した成虫から発信された私たちの研究室でのコロニー。写真政権：私達の昆虫のコロニーは、± 2℃、75 ± 10％相対湿度、および午前16時08分H（暗い光）下で28℃（パーシバル社、IA）環境槽内に保持されます。 </li><li>新興蛾は、毎日収集性欲を刺激する、そしてプラスチックの箱（669 mLの弁当箱、13 × 13センチメートル、高さ、4.5センチ、ラバーメイド）に転送され、水に浸したペーパータオル（27.9、喉が渇いた超吸収X 27.9センチメートルの10層までで提供;セイフウェイ）。ボックスカバーは、空気循環を可能にするために穴あきです。この配置は、〜100％RHを提供します。 </li><li>電気生理学的測定のために我々は、高湿度下に保持されますが出現、後2〜4日の古い蛾を使用してください。 </li></ol> 2。電気生理学的準備<ol><li>蛾（男性または女性）が静かに大規模な（約2mm）を先端径を持つように上部から切断されたピペットチップ（200μL、米国サイエンティフィック株式会社）にプッシュされます。アンテナと頭の部分が先端から突出するまで蛾を穏やかに加湿ティッシュペーパーのスタブを持つもう一方の端を通してプッシュされます。 </li><li>露出頭は片目と公開される2つのアンテナのごく一部を残して不乾性粘土（Claytoon、バンアーケンインターナショナル、カリフォルニア州）で頭を覆うことによって固定化されている。この準備は、2つの電極ホルダーの間にEAGマニピュレーターMP - 12（Syntech、ドイツ）のプラットフォームに配置されます。 </li><li>私たちは、フィラメントと1.0ミリメートルホウケイ酸キャピラリーチューブから作られたガラス電極を使用して（WPI社、FL）とマイクロチップ未満の微小電極を得るためにモデルP - 97マイクロピペットプラー（サターインスツルメンツ、CA）でプルアップ。電極はバック感覚子リンパリンガー（Kaisslingとソーソン1980）で埋められます。一方の電極は、顕微鏡（ライカMZ75）の下で目の露出面積をimpalesと記録電極は、二つのアンテナを収納しながら、参照として機能します。接触を容易にするために、遠位1〜2触角のセグメントは、記録電極に挿入される前にカットされています。個々の感覚器からの​​記録信号の場合、我々はわずかに記録電極を顕微鏡（; 800 ×倍率オリンパスBX51WI）の下impaledされることを特徴この設定を変更します。活動電位は、感覚子の基部にガラス電極を挿入して記録されます。シグナルは、AUTOSPIKEソフトウェア（Syntech、ドイツ）と分析されるUB - IDACオフラインにハイインピーダンスプリアンプ（Syntech、ドイツ）と供給によって増幅されています。バンドは、100 -10000 Hzと活動電位との間でフィルタリング通過しているAC信号がノイズから彼らのピークツー谷の振幅を区別AUTOSPIKEアルゴリズムを使用してコンピュータによって抽出されます。個々のニューロンの応答は、自発的な周波数に対する活動電位の頻度の増加（または減少）（毎秒スパイク）として計算されます。 </li></ol> 3。化学的刺激と刺激のプロトコル<ol><li>最高純度の化学薬品が使用されます。へそのorangewormから女性フェロモンブレンドの主要成分、（Z、Z）-11,13 - hexadecadienalはBedoukianリサーチ社、CTから得られた。化学物質が希釈され、10μg/μLのと進法希釈のストック溶液を作るためにガラス蒸留ヘキサンとのW / Vは、作られています。ヘキサンに溶解した刺激の化学物質のアリコート（10μl）を溶媒としては、静かに換気フードの下に10秒間振とうすることにより蒸発させ、ストリップを5 mLのポリプロピレンに配置され、（8x40 mm）のワットマンろ紙片上にロードさ様々なボリュームが取り出されているからシリンジ（BDシリンジ、NJ）。ヘキサン単独で、空の注射器は、コントロールとして使用。 </li><li>準備がSyntech刺激コントローラ（CS - 55モデル、Syntech、ドイツ）が提供する加湿空気​​の流れで開催される20 ml /秒でそのための4mL /秒の刺激パルスは500ミリ秒のために追加されます。信号は、刺激パルスの開始前に2秒を開始、10秒間記録されます。触角の準備はどのCAの間に500 msのパルスで刺激されています。刺激を含む5mLのポリプロピレンシリンジから精製された空気の2mLをメイン空気の流れの上に追加されます。高応答、以下の少なくとも1分以上のギャップが、、刺激の間で許可される。 </li></ol> 4。代表的な結果控えめな蛾の触角（図1）女性のフェロモン成分で刺激、（Z、Z）-11,13 - hexadecadienal堅牢な用量依存性の応答（図2）を生成する。この主要なフェロモン成分はまた、単一ユニット記録（図3B）のトレースに表示される長いtrichodea感覚器（図3A）から用量依存性の興奮性応答を誘発する。 <img src="/files/ftp_upload/2489/2489fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。ライヴへそorangeworm蛾抑制され、アンテナが露出しload/2489/2489fig2.jpg"ALT ="図2"/&gt; 図2。用量依存性のEAG応答は（Z、Z）-11,13 - hexadecadienal、主要な女性のフェロモン成分に反応して誘発した。 <img src="/files/ftp_upload/2489/2489fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 男性のへそorangeworm蛾の図3。感覚器の毛髪状のは、用量依存的に（Z、Z）-11,13 - hexadecadienalに対応。 （A）オスへそorangeworm蛾のアンテナは、複数のセグメントであり、各セグメントは、構造体のような毛の数が多い、感覚器で飾られています。挿入図に詳細を示す走査型電子顕微鏡写真、（スケールバーはそれぞれ、200および50μMです）。毛状感覚子から（B）細胞外単一ユニット記録。

<ol><li>Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaissling%2C+K-E+%22Receptors+for+Neurotransmitters.+Hormones+and+Pheromones+in+Insects%22">Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects</a>. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

嗅覚信号を測定するために、ライブへそorangewormの蛾を抑制するために開発されたこの新しい方法は、堅牢で非常に信頼性が高いことが証明されている。我々は日常的にアーモンドやピスタチオなどの自然宿主の基質から小説誘引を分離し、識別するためにこの方法を採用しています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料名 </td><td> カタログ＃/モデル </td><td> 会社 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td> BX51WIモデル</td><td>オリンパス、米国</td><td></td></tr><tr><td>ステレオ顕微鏡</td><td> MZ75 </td><td>ライカマイクロシステムズ（株）米国</td><td></td></tr><tr><td>フィラメントと1.0ミリメートルホウケイ酸キャピラリーチューブ</td><td> 1B100F - 3 </td><td> WPI社、フロリダ州</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td> P - 97 </td><td>サターインスツルメンツ、CA </td><td></td></tr><tr><td>刺激コントローラ</td><td> CS - 55モデル</td><td> Syntech、ドイツ</td><td></td></tr><tr><td>ハイインピーダンスプリアンプ （ユニバーサルシングルエンドプローブ） </td><td></td><td> Syntech、ドイツ</td><td></td></tr><tr><td>アンプ/データ収集システム（USB - IDAC） </td><td></td><td> Syntech、ドイツ</td><td></td></tr><tr><td> EAGマニピュレーターMP - 12 </td><td></td><td> Syntech、ドイツ</td><td></td></tr><tr><td> （Z、Z）-11,13 - hexadecadienal </td><td></td><td> Bedoukianリサーチ社、コネチカット州。 </td><td></td></tr><tr><td>ワットマンろ紙</td><td> 1001070 </td><td>ワットマン米国</td><td></td></tr><tr><td> 5mLのポリプロピレンの注射器</td><td> 309633 </td><td> BDシリンジ、NJ </td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ（200μL） </td><td> 1111-0806 </td><td>米国サイエンティフィック株式会社</td><td></td></tr><tr><td> 669 mLの弁当箱、13 × 13センチメートル、高さ、4.5センチ、 </td><td></td><td>ラバーメイド</td><td></td></tr><tr><td>のどが渇いて超吸収、27.9 X 27.9センチメートル</td><td></td><td>セイフウェイ</td><td></td></tr><tr><td>非乾燥粘土</td><td> 18150 </td><td> Claytoon、バンアーケンインターナショナル、カリフォルニア州</td><td></td></tr><tr><td>環境室</td><td> I - 30BLLモデル</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

蛾嗅覚系の電気生理学的測定

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

昆虫の嗅覚システムは、アンテナ上にあるすべての嗅覚受容体の神経細胞（ORNs）から、個々に収容されたものからの応答を加算しているelectroantennograms（EAG）と、単一感覚子記録（SSR）の形で記録嗅覚誘発応答のためのユニークな機会を提供するそれぞれ感覚器、。これらのアプローチは、昆虫の化学通信のより良い理解を得るために悪用されている。特定された刺激は、病害虫の管理戦略の誘引や忌避剤のどちらかとして使用することができます。

昆虫の嗅覚システムは、アンテナ上にあるすべての嗅覚受容体の神経細胞（ORNs）から、個々に収容されたものからの応答を加算しているelectroantennograms（EAG）と、単一感覚子記録（SSR）の形で記録嗅覚誘発応答のためのユニークな機会を提供するそれぞれ感覚器、。

昆虫の嗅覚系は、触角電図（EAG）や単一の...といった形式で、臭気誘発反応を記録するための独自の機会を提供します。

本実験の全体的な目的は、昆虫の神経系から嗅覚反応を容易に記録できることを示すことです。これは、生きた蛾を固定し、触角または個々のニューロンに電極を接続して、匂い刺激による反応を記録することで達成されます。第一段階として、接地として生理食塩水で満たされたガラス電極を眼に刺入します。第二段階として、固定した蛾のいずれかに生理食塩水で満たされたガラス電極を挿入し、これにより、嗅覚受容ニューロンからの単一ユニット反応を記録するためのアンテナグラムという形式で電気的反応を記録することが可能になります。記録電極を触角の基部に挿入します。次に、アンテナ信号を増幅し、信号を記録・保存するためにアナログ-デジタル変換器へ送ります。その結果、記録された電気信号（EAG信号またはスパイクの形式）に基づき、濃度依存的な臭気誘発反応が得られます。私たちは、固定したNaval orangeの生きた蛾からEnterogramを記録する新しい手法を開発しました。この技術の主な利点は、調製状態が長時間持続するため、同一の蛾を用いて複数回の反応を記録できること、また、同一の蛾を用いて触角の個々のセンサーからのシングルユニット反応を記録できることです。カリフォルニア州において重要な農業害虫であるため、私たちはNaval orangeに着目しました。しかしながら、この手法は他の鱗翅目昆虫にも適用可能であり、嗅覚機能に関する基礎的な問いへのアプローチだけでなく、新たな誘引剤の開発にも利用できます。本研究では、ナバルオレンジウォーム（Ullo Ella）を用いて蛾の嗅覚系について検討します。昆虫コロニーは、温度約28°C、相対湿度約75%、16時間明期・8時間暗期の光周期に設定された環境チャンバー内で、小麦ふすま飼料を用いて維持します。プラスチックボックスに水で湿らせたペーパータオルを最大10層まで敷き、羽化したばかりの蛾用の容器を作成します。毎日、羽化した蛾を回収して雌雄を判別し、プラスチックボックスに移します。電気生理学的記録の準備として、空気循環を確保するためにボックスに穴あきカバーをかけます。まず、200 µL ピペットチップを切り、先端の直径が約 2 mm になるようにして、蛾用のホルダーを作成します。EAG または SSR の場合は、羽化後 2 〜 4 日の蛾を選択してください。湿らせたティッシュペーパーの端を用いて、チップとは反対側から蛾をピペットの中に挿入し、ゆっくりとピペットチップ側へ押し込みます。触角と頭部の一部が先端から突き出るまで、蛾を押し込みます。非乾燥性の粘土で頭部を覆い、片眼の一部と2本の触角だけを露出させて、露出した頭部を固定します。先端径1µm未満のガラス電極を用い、蛾の標本をエレクトログラム・マイクロマニピュレーターの2つの電極ホルダー間のプラットフォーム上に配置します。電極にCentum limb Ringer液を充填します。顕微鏡で観察しながら、眼の露出した部位に電極を1本刺入します。これが参照電極となります。次のステップは、触角に記録電極を配置することです。オナガシロシタバガの雄の触角は多くの節からなり、各節には多数の毛状構造が付着しています。挿入図は、触角からの記録を容易にするためのillaの詳細を示す走査電子顕微鏡写真です。触角の遠位1〜2節を切除します。次に、両方の触角を記録電極に挿入します。または、単一のsens記録を行う場合は、sensの基部に記録電極を挿入します。sensからの活動電位は高インピーダンスプリアンプで増幅され、USBインテリジェントデジタルアナログコンバーターに送られ、autos spikeソフトウェアを用いてオフラインで解析されます。次のステップは、ミカンキクイムシの雌フェロモンブレンドの主要成分であるZZ 1113 HEXA deca Nowを用いて化学刺激剤を調製することです。この化学物質をヘキサンで希釈し、DIC希釈液を作成します。刺激剤溶液10 µLをワトマンろ紙に滴下します。10秒間静かに振とうし、溶媒を揮発させます。ドラフトチャンバー内で、ストリップを5 mLのポリプロピレン製シリンジに入れ、ヘキサンのみを入れた空のシリンジを準備用のコントロールとして使用します。EAGまたはSSRは、刺激コントローラーによって20 mL/sで送られる加湿気流中に保持されます。化学刺激剤を含むシリンジを気流コントローラーに取り付けます。2秒間のベースライン電気信号を記録します。次に、Airstreamに4 mL/sの刺激パルスを500ミリ秒間加えます。その後、さらに8秒間、電気信号の記録を継続します。刺激の間隔は少なくとも1分間あけてください。この図は、固定した雄蛾の触角における、堅牢な用量依存的反応を示しています。雌のフェロモン成分であるCZ 1113 hexacoで刺激しました。ヘキサンに対する反応。青色の線は、連続して提示された溶媒コントロールを示している。フェロモンの投与量を増やすにつれて、電図記録の振幅が順次大きくなっている。この図は、雌フェロモン成分による刺激に応答したtrichandumからの細胞外シングルユニット記録を示しています。これらの記録は、用量依存的な興奮性反応を示しています。この手法を習得すれば、適切に行うことで数時間で完了させることができます。本手法を用いる際は、コンタミネーションを避け、可能な限り純度の高い化学薬品を使用してください。

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