計測線虫（Caenorhabditis elegans）寿命

この手順の全体的な目標は、関心のある薬物で処理されたウミエルガンワームの寿命を測定することです。これは、最初にOP 50、ワームに餌を与えるために使用される細菌株を準備することによって達成されます。次に、年齢同期した線虫の集団が生成され、摂食細菌OP 50とともに96ウェルプレートに播種されます。

次の2日間で、線虫はL4幼虫期に成長し、繁殖を防ぐためにFUDRという薬が追加されます。翌日、ワームは成虫になり、関心のある薬物が個々のウェルに追加されます。この時点から、生きているワームと死んだワームの数は、すべてのワームが死ぬまで2〜3日ごとに決定されます。

観察は倒立顕微鏡を使用して行われ、各セッションで死んだ線虫と生きた線虫の数が記録されます。こんにちは、グレッグ・ソリスです。私はスクリプス研究所の化学生理学部門の石油研究室にいます。

今日は、ワームを同期させ、96枚の壁マイクロタイタープレートに分配する方法をご紹介します。既存の方法のこの技術の主な利点は、寿命を延ばし、Cのエレガンスを延ばす分子の迅速な同定を可能にすることです。それでは始めましょう。

Cエレガンスのための摂食細菌を準備するには、100マイクログラム/ミリリットルとペルシンを含む結核の5ミリリットル、および単一のOP50コロニーと1ミリリットルあたり0.1マイクログラムとテリンBを接種することにより、マイナス7日目に開始し、翌朝早くに細菌シェーカーで摂氏37度で一晩インキュベートし、2000年にOP51の一晩培養をアンピシリンのミリリットルあたり50マイクログラムを含む結核の300ミリリットルで希釈します。培養物をバクテリアシェーカーで37°Cで8〜12時間インキュベートし、飽和に達するまでインキュベートします。培養物が14時間を超えて成長しないようにしてください。

OP 50を滅菌済みの予備加重遠心分離チューブに移す OP 50を3,500RPMまたは2,200倍のGで10分間遠心分離することにより、卓上遠心分離機でペレット化します。S上清を捨て、OP 50ペレットを再懸濁し、遠心分離によって水とREPペレットに星を付けます。これを繰り返し、2回目以降に2回洗います。

注意深く洗い、残っている水をすべて完全に取り除きます。ペレットを含む遠心分離チューブの重量を量り、空の遠心分離チューブの重量を差し引いて、ペレットの重量を決定します。次に、ペレットをS Completeで100ミリグラム/ミリリットルの濃度まで完全に再懸濁します。

塊を残さないでください。100ミリグラム/ミリリットルOP 50の濃度は、10マイクロリットルあたり10個のバクテリアの2倍に対応する必要があります。光密度とミリリットルあたりのバクテリア数との関係がわかっている場合は、フォトスペクトロメーターを使用してミリリットルあたりのバクテリアの数を決定します。

必要に応じて、OP 50給餌液の濃度を1ミリリットルあたり10〜10個のバクテリアの2倍に調整します。最後に、OP 50溶液を摂氏4度で保存し、ワームの培養に使用され、ワームの年齢同期集団を生成します。マイナス6日目の午後遅くから、5〜10日前のNGMプレートで開始し、ワームの個体数は主に飢えたL-oneの幼虫で構成されています。

金属ヘラをブンゼンバーナーでまもなく加熱して滅菌します。冷まします。次に、冷たいヘラを使用して、飢えたワームを含むプレートから寒天の塊を切り取ります。

これらのチャンクのいくつかを、OP 50を播種した新しい10cmのNGMプレートに移します。ワームの個体群の大部分が重大な成虫で構成されるまで、摂氏20度で約65時間ワームをインキュベートします。飢えたL oneの動物が重篤な成体に成長するのにかかる時間は、系統ごとに異なる場合があります。

インキュベーション後、10センチメートルのプレートからワームを5〜10ミリリットルの滅菌水でプレートから洗い流して収集します。ワーム水溶液を15ミリリットルの円錐管に移します。1、200 RPMまたは280倍G.Supinateを廃棄し、水の10ミリリットルを追加するテーブルトップ遠心分離機で2分間遠心分離することにより、ワームを洗浄します。

洗浄手順を繰り返し、SUPナタントを取り除き、準備したばかりの漂白剤を5ミリリットル加えます。水酸化ナトリウム溶液をRTで5分間インキュベートし、線虫が開くまで放置します。毎分やさしく渦巻くようにしてください。

すべての成虫が溶解したらすぐに、解剖顕微鏡で反応の進行を監視します。反応を中和するために、5ミリリットルのMナインバッファーを追加します。2、500 RPMまたは1、100回G.Thenで2分間遠心分離することにより、10ミリリットルのM9緩衝液で卵を3回洗浄し、2、500 RPMまたは1、100回G.Removeで2分間遠心分離することにより、Sの10ミリリットルで卵を1回洗浄します。

10ミリリットルのSコンプリートを加え、溶液を新しい50ミリリットルの円錐管に移します。30ミリリットルのSコンプリートを40ミリリットルの最終容量に追加します。ミューテーターまたは同様のデバイスで室温でチューブを一晩静かに振って、翌日の正午頃に動物プレートを播種します。

解剖スコープの下で、ワームが夜間に孵化したかどうかを確認します。10マイクロリットルの液滴中のワームの数を数えて、S完全溶液中のワームの濃度を決定します。解剖スコープを使用すると、サンプルごとに少なくとも10滴をカウントします。レザス。

ワームをミリリットルあたり80〜100ワームの濃度で懸濁します。S完全培地で、カルベニシリンを最終濃度50マイクログラム/ミリリットルに、アムホテリシンBを最終濃度0.1マイクログラム/ミリリットルに添加します。.ミューテーターを振る。

大量のワームを準備する場合は、フィルターキャップ付きの600ミリリットルのノンクローンフラスコを使用してください 午後2時30分にパート1で調製したOP50を最終濃度6ミリグラム/ミリリットルまで追加します。OPを摂氏50度に戻します。120マイクロリットルのワームOP 50溶液を、底部が透明な96ウェルプレートの各ウェルに移します。

ピペッティング中は、汚染や蒸発を防ぐために、テープシーラーを使用してプレートを密封し、ワームと懸濁液を保管してください。マイクロタイタープレートシェーカーでプレートを2分間振とうし、動物がL 4ステージに達するまで摂氏20度で2日間インキュベートします。次に、動物を滅菌するために、各ウェルに30マイクロリットルの0.6ミリモルFUDRストック溶液を追加します。

このステップにより、各ウェルの最終容量は150マイクロリットルになり、OP 50の最終濃度は6ミリグラム/ミリリットルから5ミリグラム/ミリリットルに減少します。テープシーラーでプレートを密封し、マイクロプレートシェーカーで2〜3分間振とうします。OP 50がマイナス2日の2時30分に追加された場合、FUDRは正午までにプレートを摂氏20度インキュベーターに戻す前に翌日の午前9:00までに追加することが重要です。

ほとんどの動物は重篤で、いくつかの卵を含んでいるべきです。それぞれが、寿命への影響が所望の濃度で試験されるべき薬物を追加する。DMSOに薬物を溶解する場合、DMSOの最終濃度は0.6%を超えてはなりません。DMSO濃度が0.6%を超えると、薬物の添加後のエルガン寿命が短くなります。

プレートをテープシーラーで密封し、マイクロタイタープレートで2〜3分間振とうします。シェーカーはプレートを摂氏20度のインキュベーターに戻します。薬物を追加すると、特に水以外の溶剤を使用する場合、プレートごとに数匹の動物が殺されることがあります。

倒立顕微鏡を使用して、動物の死骸を確認します。一般的に、10ワールドプレートあたり96匹の死んだ動物がいるはずです 新鮮な酸素が培養に入るのを許すために、プレートを摂氏20度のインキュベーターに2日間戻します。シーラーを取り外します。

1分待ってから、プレートを再密封します。マイクロのタイトなプレートシェーカーでプレートを2〜3分間振とうし、成人の寿命の5日目に毎週1回繰り返し、飢餓を防ぐために96ウェルのそれぞれに以前に調製した100ミリグラム/ミリリットルのOP50溶液を5マイクロリットル加えます。線虫は、実験の開始から死ぬまで、週に3回、その動きによって寿命のスコアが付けられます。

が2倍または2.5倍になった倒立顕微鏡を使用して、96の線虫を観察します。実験開始時の0日目のウェルプレート。各ウェル内のワームの総数を数えます。

分析から 18 匹を超える動物を含むセンサー ウェルは、これらのウェルの動物として十分な OP 50 がなく、各カウント セッションで食事制限の影響を示します。生きた動物として移動する動物の日付と数を記録します。動きや液体は、固体媒体よりもはるかに簡単で、強い光によって誘発される可能性があります。

より高い倍率を使用すると、咽頭の先端のような非常に微妙な動きを見つけるのに役立つ場合があります。このような微妙な動きは、非常に古い動物で観察される唯一の動きであることがよくあります。プレートを摂氏20度のインキュベーターに戻します。

すべての動物が死ぬまで、2〜3日ごとにカウントセッションを繰り返します。これは、各ウェルの寿命データを記録するためのExcelシートの設計です。それは、プレート株、薬物の薬物濃度、およびゼロ日目に生きていた動物の総数の座標であり、実験の開始時に記録されます。

週に3回、日付と生きている動物と死んだ動物の数を記録して、各井戸のさまざまな個体群の生存を追跡します。この図は、海の優雅さ、寿命、摂氏20度と摂氏25度で記録された曲線の結果を示しています。マイクロタイターベースの寿命アッセイは、温度依存の寿命の変化を正確に再現します。

同様に、ここに示すように、マイクロタイタープレートアッセイは、野生N型2動物とは異なる寿命を有すると報告された変異体からの寿命の変化を再現する。この図は、ミルタザピンの用量の増加がシーエレガンスの平均寿命にどのように影響するかを示しています。マイクロタイタープレートアッセイによって得られたデータは、用量反応関係を決定するのに十分な定量的性を持っています 一度習得すると、この手法は、寿命を延ばし、エレガンスを見る分子の大規模な化学ライブラリをスクリーニングするために使用できます。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。