Name: 計測線虫（Caenorhabditis elegans）寿命 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: 学ぶ Caenorhabditis elegansの寿命測定法。96穴マイクロタイタープレートを用いて、薬剤処理による寿命延長効果を高速スクリーニングで評価します。老化メカニズム解明に貢献する実験手法です。

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このプロトコルは、もともとリンダバックの研究室では小葉とマイケルPetrascheckによってシアトルのフレッドハッチンソンがん研究センターで開発されました。上記の詳細なバージョンは、より広いコミュニティに利用可能なすべての処理を行うために準備されています。私たちは、批判的にプロトコルを読み込むためのキャロルテイラー、サラルボーフとアンディTomacelliに感謝。これは、スクリップス研究所から原稿＃2866です。 Petrascheckラボは、ノバルティスADIのプログラムによって運営されている。

<ol><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+life-span+of+age-1+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+and+lower+Gompertz+rate+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging.</a> Science. 249, 908-912 (1990).</li>
<li>Kenyon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genetics of ageing.</a> Nature. 464, 504-512 (2010).</li>
<li>Finch, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The genetics of aging.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).</li>
<li>Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blueberry+polyphenols+increase+lifespan+and+thermotolerance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 5, 59-68 (2006).</li>
<li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307, 258-262 (2005).</li>
<li>McColl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetic+analysis+of+lithium-induced+delayed+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).</li>
<li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antidepressant+that+extends+lifespan+in+adult+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 553-556 (2007).</li>
<li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+can+confer+stress+tolerance+and+lifespan+extension+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans.</a> Biogerontology. 9, 309-316 (2008).</li>
<li>Wood, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuin+activators+mimic+caloric+restriction+and+delay+ageing+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.</a> Nature. 430, 686-689 (2004).</li>
<li>Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+acid+extends+Caenorhabditis+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 7, 305-317 (2008).</li>
<li>Onken, B., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+induces+a+dietary+restriction-like+state+and+the+oxidative+stress+response+to+extend+C.+elegans+Healthspan+via+AMPK%2C+LKB1%2C+and+SKN-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1.</a> PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+increases+stress+resistance+and+extends+life+span+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).</li>
<li>Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+extension+in+Drosophila+by+feeding+a+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Life extension in Drosophila by feeding a drug.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).</li>
<li>Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamotrigine+extends+lifespan+but+compromises+health+span+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster.</a> Biogerontology. 11, 45-52 (2010).</li>
<li>Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase%2Fcatalase+mimetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289, 1567-1569 (2000).</li>
<li>Benedetti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).</li>
<li>Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+MPP%2B+model+of+Parkinson%27s+disease+for+high-throughput+drug+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22Neurodegener+Dis%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings.</a> Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).</li>
<li>Kwok, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).</li>
<li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+function+in+novel+targets%3A+C.+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).</li>
<li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli%3A+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

提示プロトコルは、96ウェルマイクロタイタープレート中の線虫の寿命を測定することができます。代表的な結果に示すようにセクションには、確実にこれまでの知見を複製し、定量的な情報を提供します。このアッセイを使用して我々が正常に線虫の寿命に与える影響については89000の分子を介してスクリーニングしている。 薬剤スクリーニングの目的のために、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマットでの寿命を測定することは古典的な固体培地アッセイに比べていくつかの利点があります。それはメディアの準備、インキュベーションスペースの量、および必要な薬剤の量に要する労力が軽減されます。 96ウェルフォーマットと顕微鏡のセットアップは、ハイスループットスクリーニングのための全体のアッセイの自動化を可能にする。 アッセイの開発中にこれらの各変数との組み合わせに対して複数の値は、 線虫の寿命に与える影響について試験した。これらのテストは、3〜10の範囲の異なるOP50濃度を含めmg / mLの（3、4、6、8、10 mg / mL）は、7〜45（7、10、15、22、45に至るまで、ウェル当たりワームの数が異なるワーム/ウェル）、40から150ウェルあたりμL（40、60、80、100、120、150μL）、および緩衝液組成の変化に至る様々な文化のボリューム。示された濃度のカルベニシリン耐性OP50、カ ​​ルベニシリンもアムホテリシンBのどちらと供給は、 線虫の寿命に影響を及ぼすことが判明した場合。プレートの連続穏やかに振盪しながら、できるだけ頻繁に虫液体培地で推奨されているが、このアッセイで使用されている小さなボリューム用する不要が判明した。大きな井戸とマイクロタイタープレートを使用する場合は穏やかに振盪しながらしかし必要となります。このプロトコールに示された値は、慎重にテストされたさまざまな条件の統計的な比較に基づいて選択されています。 このアッセイの最も驚くべき特徴は、おそらく虫がテープで封印されている96ウェルプレートに保持することができるという事実です。サイドバイサイドの比較はプラスチックシーラーで密封板で、または空気の交換を可能にするシーラーで密閉プレートで、非密閉型プレートで培養した動物の寿命の違いを明らかにしなかった。 3つの条件すべてに、動物はL1から65時間以内に妊娠した大人への非常に均質に開発され、非常に匹敵する寿命を示した。 NGM上で並行して成長の動物は、わずかに速い開発が、この違いは、シーラーの存在または非存在とは無関係であった。 提示プロトコルは、生菌に基づいていますが、死菌に適合させることができる。しかし、液体アッセイで単一の生存細菌が急速に増殖することができると文化を再作成してください。私たちの手で、それらは液体培養に使用できる程度に細菌を殺すために唯一の信頼できる方法では、ガンマ線照射による細菌の長期治療することです。 寿命の実験の計画で考慮すべき重要なポイントの1つは、検出の力です。効果の大きさに依存して、関心の薬剤の効果は、複数のウェルにテストする必要があります。大体40〜50の動物それぞれに対応する典型的なアッセイ4薬物治療と4つの制御井戸で、実験の95％以上の寿命が30％増加を検出するために十分です。 14％の増加は、患者の60％で検出し、従ってより多くの複製井戸が必要とされています。 このアッセイによって生成された寿命のデータの富は、実験を開発したり、特定のパラメトリックゴンペルツモデル1株に使用することができます。これらのゴンペルツモデルは、検出の電力を決定するために、大規模スクリーンのために偽陽性と陰性の数を推定するために便利です。我々は、ブラインド実験では、これらのモデルの予測を検証し、大画面（未発表の結果）で偽陰性の数を推定するためにそれらを使用する。 要約すると、我々は提示アッセイは、 線虫の寿命を延ばすと根本的なメカニズムを研究する小分子を同定するために大いに役立つと期待しています。

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>Fungizoneとも呼ばれる</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>FUDRは熱で不活化するため、冷水で融解すること</td></tr><tr><td>Mianserin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>最終濃度 50&amp;#x03BC;M で陽性対照として使用</td></tr><tr><td>Cyproheptadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>最終濃度 10 &amp;#x03BC;M で代替陽性対照として使用</td></tr><tr><td>シーリングテープ</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>ポリエステル製、非滅菌</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>未処理、透明、滅菌個別包装、ポリスチレン製</td></tr><tr><td>Nunclonフラスコ</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>大量サンプルに使用</td></tr></tbody></table>

計測線虫（caenorhabditis elegans）</em96穴マイクロタイタープレートの>寿命

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

寿命はいくつかの遺伝的経路により調節生物学的なプロセスです。老化の生物学を調査する一つの戦略は、年齢、調節経路の成分の港の変異その動物を研究することです。これらの変異は摂動年齢規制経路の機能を、したがって全体の生物の寿命を変更する場合、彼らは1-3の重要なメカニズムの洞察を提供しています。 寿命の規制を調査するために別の戦略は、摂動年齢調節経路に小分子を使用することです。日付に、分子の数は、様々なモデル生物の寿命を延ばすことが知られていると4-16を老化の生物学を研究するためのツールとして使用されます。これまでに同定された分子の数は、高齢化の生物学を研究するために利用できる遺伝&quot;ツールセット&quot;に比べて小さいです。 線虫（Caenorhabditis elegans）は 、その優れた遺伝学と三週間の短い寿命のため経年変化を研究するために使用される原理のモデルの一つです。最近では、 線虫は、その小さなサイズとマイクロタイタープレート中で成長する能力の表現型に基づく薬剤の画面5,7,16-20のためのモデル生物として注目されています。 ここでは、96ウェルマイクロタイタープレート中で線虫の寿命を測定するアッセイを提示する。アッセイを開発し、成功した線虫の寿命7を拡張する分子のために大規模なライブラリーをスクリーニングするために使用されていました。アッセイの信頼性は、複数の試験で評価した：最初に、異なる温度で成長野生型動物の寿命を測定することによって、第二、変更された寿命を持つ変異体の寿命を測定することによって、第三に、異なる濃度に反応して寿命の変化を測定することにより、抗うつMirtazepineの。 Mirtazepineは、以前に虫 7の寿命を延ばすことが示されている。これらのテストの結果は、アッセイは、他のアッセイから、以前の結果を再現することができると定量的であることを示している。マイクロフォーマットは、自動液体ハンドリングシステムとこの寿命アッセイの互換性が高まりますし、自動化されたプラットフォームへの統合を可能にします。

このプロトコルでは、測定する手法を提案<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em96ウェルマイクロタイタープレートの&gt;寿命。

計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em96穴マイクロタイタープレートの>寿命

寿命は、いくつかの遺伝的経路によって制御される生物学的プロセスです。老化の生物学を研究するための一つの戦略は、...を保持する動物を研究することです。

この手順の全体的な目的は、目的の薬剤で処理したシーエルガンス（C. elegans）の寿命を測定することです。まず、線虫の餌として使用する細菌株であるOP 50を調製します。次に、年齢を同期させた線虫集団を作成し、餌となる細菌OP 50と共に96ウェルプレートに播種します。その後2日間で、線虫はL4幼虫期まで成長し、生殖を抑制するために薬剤FUDRを添加します。翌日、線虫が成虫になると、各ウェルに目的の薬剤を添加します。ここから、すべての線虫が死滅するまで、2〜3日ごとに生存数と死滅数を測定します。倒立顕微鏡を用いて観察を行い、各セッションにおける死滅した虫と生存している虫の数を記録します。こんにちは、グレッグ・ソリスです。私はスクリプス研究所の化学生理学部門にあるPetro研究室に所属しています。本日は、線虫を同期させ、96ウェルマイクロタイタープレートに分注する方法をご紹介します。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、C. elegansの寿命を延ばす分子を迅速に同定できることです。それでは始めていきましょう。C. elegans用の餌用細菌を調製するため、マイナス7日目に、100 µg/mLのカナマイシンと0.1 µg/mLのストレプトマイシンを含む5 mLのTB培地にOP50のシングルコロニーを接種し、細菌用シェーカーで37 °Cにて一晩培養します。翌日の早朝、一晩培養したOP50の培養液を、50 µg/mLのアンピシリンを含む300 mLのTB培地で希釈します。飽和状態に達するまで、細菌用シェーカーを用いて37 °Cで8〜12時間培養します。培養時間は14時間を超えないようにしてください。OP 50をあらかじめ重量を測定した滅菌遠心チューブに移します。卓上遠心機を用いて、3,500 RPMまたは2,200 ×gで10分間遠心分離し、OP 50をペレット化します。上清を廃棄し、OP 50ペレットを滅菌水で再懸濁させ、再び遠心分離してペレット化します。この洗浄工程を計2回繰り返します。注意深く洗浄し、残った水分を完全に除去します。ペレットの入った遠心チューブを計量し、そこから空の遠心チューブの重量を差し引いて、ペレットの重量を決定します。次に、ペレットをS Completeで100 mg/mLの濃度になるまで十分に再懸濁します。凝集塊が残っていないことを確認してください。OP 50の濃度100 mg/mLは、1 mLあたり2×10¹⁰個の細菌に相当する必要があります。吸光度と1 mLあたりの細菌数の関係が既知である場合は、分光光度計を用いて1 mLあたりの細菌数を決定してください。必要に応じて、OP 50餌溶液の濃度を2 × 10¹⁰ bacteria/mLに調整してください。最後に、年齢同期させた線虫集団を育成するために、OP 50溶液を4 °Cで保存し、線虫培養に使用するまで保管します。6日前（day -6）の午後遅くに、線虫集団が主に飢餓状態のL1幼虫で構成されている5〜10日経過したNGMプレートを用いて開始します。金属製スパチュラをブンゼンバーナーで短時間加熱して滅菌し、冷却させます。その後、冷却したスパチュラを使用して、飢餓状態のワームを含むプレートからアガーの塊を切り出します。これらのチャンクを数個、OP 50を播種した新しい10 centimeterのNGMプレートに転写します。線虫を20 degrees Celsiusで約65時間インキュベートし、個体群の大部分がgrave adultになるまで待ちます。飢餓状態のL1期の個体がgrave adultに成長するまでにかかる時間は、系統によって異なる場合があります。インキュベーション後、5〜10 mLの滅菌水でプレートから洗い流し、10 cmプレートから線虫を回収します。線虫を含む水溶液を15 mLコニカルチューブに移します。卓上遠心機を用いて1,200 RPMまたは280 ×gで2分間遠心分離し、線虫を洗浄します。上清を捨て、10 mLの水を加えます。洗浄ステップを繰り返し、上清を除去して、調整直後の漂白剤（水酸化ナトリウム溶液）を5 mL加えます。線虫の体が崩壊するまで、室温（RT）で5分間インキュベートしてください。1分ごとに緩やかにボルテックス処理することを忘れないでください。すべての成虫が溶解した後、直ちに実体顕微鏡下で反応の進行をモニターします。反応を中和するために、5 mLのM9バッファーを加えます。2,500 RPM（または1,100 ×g）で2分間遠心分離し、10 mLのM9バッファーで卵を3回洗浄します。次に、2,500 RPM（または1,100 ×g）で2分間遠心分離し、10 mLのS completeで卵を1回洗浄します。上清を除去します。10 mLのS completeを加え、溶液を新しい50 mLコニカルチューブに移します。さらに30 mLのS completeを加え、最終容量を40 mLにします。翌日正午頃に動物プレートに播種できるよう、チューブを室温で一晩、回転ミキサーなどの装置を用いて緩やかに振とうします。解剖顕微鏡下で、夜間に線虫が孵化したかを確認します。10 µLのドロップ内の線虫数を数えることで、S完全溶液中の線虫濃度を決定します。解剖顕微鏡を用い、各サンプルにつき少なくとも10ドロップをカウントしてください。Resus.線虫を1 mLあたり80～100匹の濃度で懸濁させます。S完全培地に、最終濃度50 µg/mLとなるようにカルベニシリンを、また最終濃度0.1 µg/mLとなるようにアンフォテリシンBを添加します。ムタターで振盪させます。より大量の線虫を調製する場合は、フィルターキャップ付きの600 mLノンクローンフラスコを使用してください。午後2時30分に、パート1で調製したOP 50を最終濃度6 mg/mLになるように添加します。OP 50を4 °Cに戻します。線虫OP 50溶液120 µLを、透明底の96ウェルプレートの各ウェルに分注します。ピペッティング中は線虫と懸濁液を保持するようにし、コンタミネーションや蒸発を防ぐためにテープシーラーでプレートを密閉します。マイクロタイタープレートシェーカーでプレートを2分間振盪し、動物がL4段階に達するまで20 °Cで2日間インキュベートします。次に、動物を滅菌させるため、各ウェルに0.6 mMのFUDRストック溶液を30 µLずつ加えます。この操作により、各ウェルの最終容量を150 µLとし、OP 50の最終濃度を6 mg/mLから5 mg/mLに低下させます。テープシーラーでプレートを密封し、マイクロプレートシェイカーで2〜3分間振とうします。2日前に2時30分にOP 50を添加した場合は、正午までにFUDRを添加することが重要です。翌日午前9時までにプレートを20 °Cのインキュベーターに戻してください。ほとんどの個体は成体であり、数個の卵を抱いている必要があります。各個体に、寿命への影響を試験したい薬剤を目的の濃度で添加します。薬剤をDMSOで溶解する場合、DMSOの最終濃度は0.6%を超えないようにしてください。0.6%を超えるDMSO濃度では、薬剤添加後のC. elegansの寿命が短縮するためです。テープシーラーでプレートを密封し、マイクロタイタープレートシェーカーで2〜3分間振盪します。プレートを20°Cのインキュベーターに戻します。薬剤を添加すると、特に水以外の溶媒を使用している場合に、プレートあたり数匹の個体が死亡することがあります。倒立顕微鏡を用いて、死滅した個体がないか確認します。通常、96ウェルプレートあたり10個体未満である必要があります。プレートを20 °Cのインキュベーターに2日間戻し、培養液に新鮮な酸素を取り込ませます。その後、シーラーを取り除きます。1分間待機し、プレートを再密封します。マイクロタイタープレートシェーカーでプレートを2〜3分間振盪させます。成虫の寿命の5日目に、毎週1回この操作を繰り返します。飢餓を防ぐため、あらかじめ調製した100 mg/mLのOP 50溶液を5 µLずつ、96個の各ウェルに加えます。実験開始から死滅するまで、週3回、運動状態によって線虫の寿命をスコアリングします。実験開始日の0日目に、2倍または2.5倍の対物レンズを備えた倒立顕微鏡を使用して、96ウェルプレート内の線虫を観察します。各ウェル内の線虫の総数をカウントしてください。解析において18匹以上の個体が含まれるセンサーウェルは、個体数が多いためにOP 50が不足し、各カウントセッションで食事制限の影響が現れるため除外します。生存個体として移動した個体の数と日付を記録してください。液体中での移動は固形培地上よりもはるかに容易であり、強い光によって誘発されることがあります。高倍率を使用すると、咽頭の先端に見られるような非常にわずかな動きを捉えやすくなります。非常に高齢の個体では、このようなわずかな動きしか観察されないことがよくあります。プレートを20 °Cのインキュベーターに戻します。すべての個体が死亡するまで、2〜3日ごとにカウントセッションを繰り返します。これは、ウェルごとの生存期間データを記録するためのExcelシートの設計です。プレート内の座標、系統、薬剤濃度、および実験開始時の0日目の全生存個体数を記録します。各ウェルにおけるさまざまな個体群の生存率を追跡するため、週に3回、日付および生存動物数と死亡動物数を記録します。この図は、20 °Cおよび25 °Cで記録されたsea eleganceの寿命曲線の結果を示しています。マイクロタイタープレートを用いた寿命アッセイは、寿命の温度依存的な変化を正確に再現します。同様に、ここで示すように、マイクロタイタープレートアッセイは、野生型N2個体とは異なる寿命を持つと報告されている変異体の寿命の変化を再現します。この図は、ミルタザピンの投与量を増やすことで、C. elegansの平均寿命にどのような影響が出るかを示しています。マイクロタイタープレートアッセイによって得られたデータは、用量反応関係を決定するのに十分な定量性を備えています。この手法を習得すれば、C. elegansの寿命を延ばす分子を探索するために、大規模な化合物ライブラリのスクリーニングに使用することが可能です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Biology

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