計測線虫（Caenorhabditis elegans）寿命

この手順の全体的な目的は、目的の薬剤で処理したシーエルガンス（C. elegans）の寿命を測定することです。まず、線虫の餌として使用する細菌株であるOP 50を調製します。次に、年齢を同期させた線虫集団を作成し、餌となる細菌OP 50と共に96ウェルプレートに播種します。

その後2日間で、線虫はL4幼虫期まで成長し、生殖を抑制するために薬剤FUDRを添加します。翌日、線虫が成虫になると、各ウェルに目的の薬剤を添加します。ここから、すべての線虫が死滅するまで、2〜3日ごとに生存数と死滅数を測定します。

倒立顕微鏡を用いて観察を行い、各セッションにおける死滅した虫と生存している虫の数を記録します。こんにちは、グレッグ・ソリスです。私はスクリプス研究所の化学生理学部門にあるPetro研究室に所属しています。

本日は、線虫を同期させ、96ウェルマイクロタイタープレートに分注する方法をご紹介します。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、C. elegansの寿命を延ばす分子を迅速に同定できることです。それでは始めていきましょう。

C. elegans用の餌用細菌を調製するため、マイナス7日目に、100 µg/mLのカナマイシンと0.1 µg/mLのストレプトマイシンを含む5 mLのTB培地にOP50のシングルコロニーを接種し、細菌用シェーカーで37 °Cにて一晩培養します。翌日の早朝、一晩培養したOP50の培養液を、50 µg/mLのアンピシリンを含む300 mLのTB培地で希釈します。飽和状態に達するまで、細菌用シェーカーを用いて37 °Cで8〜12時間培養します。培養時間は14時間を超えないようにしてください。

OP 50をあらかじめ重量を測定した滅菌遠心チューブに移します。卓上遠心機を用いて、3,500 RPMまたは2,200 ×gで10分間遠心分離し、OP 50をペレット化します。上清を廃棄し、OP 50ペレットを滅菌水で再懸濁させ、再び遠心分離してペレット化します。この洗浄工程を計2回繰り返します。

注意深く洗浄し、残った水分を完全に除去します。ペレットの入った遠心チューブを計量し、そこから空の遠心チューブの重量を差し引いて、ペレットの重量を決定します。次に、ペレットをS Completeで100 mg/mLの濃度になるまで十分に再懸濁します。

凝集塊が残っていないことを確認してください。OP 50の濃度100 mg/mLは、1 mLあたり2×10¹⁰個の細菌に相当する必要があります。吸光度と1 mLあたりの細菌数の関係が既知である場合は、分光光度計を用いて1 mLあたりの細菌数を決定してください。

必要に応じて、OP 50餌溶液の濃度を2 × 10¹⁰ bacteria/mLに調整してください。最後に、年齢同期させた線虫集団を育成するために、OP 50溶液を4 °Cで保存し、線虫培養に使用するまで保管します。6日前（day -6）の午後遅くに、線虫集団が主に飢餓状態のL1幼虫で構成されている5〜10日経過したNGMプレートを用いて開始します。

金属製スパチュラをブンゼンバーナーで短時間加熱して滅菌し、冷却させます。その後、冷却したスパチュラを使用して、飢餓状態のワームを含むプレートからアガーの塊を切り出します。

これらのチャンクを数個、OP 50を播種した新しい10 centimeterのNGMプレートに転写します。線虫を20 degrees Celsiusで約65時間インキュベートし、個体群の大部分がgrave adultになるまで待ちます。飢餓状態のL1期の個体がgrave adultに成長するまでにかかる時間は、系統によって異なる場合があります。

インキュベーション後、5〜10 mLの滅菌水でプレートから洗い流し、10 cmプレートから線虫を回収します。線虫を含む水溶液を15 mLコニカルチューブに移します。卓上遠心機を用いて1,200 RPMまたは280 ×gで2分間遠心分離し、線虫を洗浄します。上清を捨て、10 mLの水を加えます。

洗浄ステップを繰り返し、上清を除去して、調整直後の漂白剤（水酸化ナトリウム溶液）を5 mL加えます。線虫の体が崩壊するまで、室温（RT）で5分間インキュベートしてください。1分ごとに緩やかにボルテックス処理することを忘れないでください。

すべての成虫が溶解した後、直ちに実体顕微鏡下で反応の進行をモニターします。反応を中和するために、5 mLのM9バッファーを加えます。2,500 RPM（または1,100 ×g）で2分間遠心分離し、10 mLのM9バッファーで卵を3回洗浄します。次に、2,500 RPM（または1,100 ×g）で2分間遠心分離し、10 mLのS completeで卵を1回洗浄します。上清を除去します。

10 mLのS completeを加え、溶液を新しい50 mLコニカルチューブに移します。さらに30 mLのS completeを加え、最終容量を40 mLにします。翌日正午頃に動物プレートに播種できるよう、チューブを室温で一晩、回転ミキサーなどの装置を用いて緩やかに振とうします。

解剖顕微鏡下で、夜間に線虫が孵化したかを確認します。10 µLのドロップ内の線虫数を数えることで、S完全溶液中の線虫濃度を決定します。解剖顕微鏡を用い、各サンプルにつき少なくとも10ドロップをカウントしてください。Resus.

線虫を1 mLあたり80～100匹の濃度で懸濁させます。S完全培地に、最終濃度50 µg/mLとなるようにカルベニシリンを、また最終濃度0.1 µg/mLとなるようにアンフォテリシンBを添加します。ムタターで振盪させます。

より大量の線虫を調製する場合は、フィルターキャップ付きの600 mLノンクローンフラスコを使用してください。午後2時30分に、パート1で調製したOP 50を最終濃度6 mg/mLになるように添加します。OP 50を4 °Cに戻します。線虫OP 50溶液120 µLを、透明底の96ウェルプレートの各ウェルに分注します。

ピペッティング中は線虫と懸濁液を保持するようにし、コンタミネーションや蒸発を防ぐためにテープシーラーでプレートを密閉します。マイクロタイタープレートシェーカーでプレートを2分間振盪し、動物がL4段階に達するまで20 °Cで2日間インキュベートします。次に、動物を滅菌させるため、各ウェルに0.6 mMのFUDRストック溶液を30 µLずつ加えます。

この操作により、各ウェルの最終容量を150 µLとし、OP 50の最終濃度を6 mg/mLから5 mg/mLに低下させます。テープシーラーでプレートを密封し、マイクロプレートシェイカーで2〜3分間振とうします。2日前に2時30分にOP 50を添加した場合は、正午までにFUDRを添加することが重要です。翌日午前9時までにプレートを20 °Cのインキュベーターに戻してください。

ほとんどの個体は成体であり、数個の卵を抱いている必要があります。各個体に、寿命への影響を試験したい薬剤を目的の濃度で添加します。薬剤をDMSOで溶解する場合、DMSOの最終濃度は0.6%を超えないようにしてください。0.6%を超えるDMSO濃度では、薬剤添加後のC. elegansの寿命が短縮するためです。

テープシーラーでプレートを密封し、マイクロタイタープレートシェーカーで2〜3分間振盪します。プレートを20°Cのインキュベーターに戻します。薬剤を添加すると、特に水以外の溶媒を使用している場合に、プレートあたり数匹の個体が死亡することがあります。

倒立顕微鏡を用いて、死滅した個体がないか確認します。通常、96ウェルプレートあたり10個体未満である必要があります。プレートを20 °Cのインキュベーターに2日間戻し、培養液に新鮮な酸素を取り込ませます。その後、シーラーを取り除きます。

1分間待機し、プレートを再密封します。マイクロタイタープレートシェーカーでプレートを2〜3分間振盪させます。成虫の寿命の5日目に、毎週1回この操作を繰り返します。飢餓を防ぐため、あらかじめ調製した100 mg/mLのOP 50溶液を5 µLずつ、96個の各ウェルに加えます。実験開始から死滅するまで、週3回、運動状態によって線虫の寿命をスコアリングします。

実験開始日の0日目に、2倍または2.5倍の対物レンズを備えた倒立顕微鏡を使用して、96ウェルプレート内の線虫を観察します。各ウェル内の線虫の総数をカウントしてください。

解析において18匹以上の個体が含まれるセンサーウェルは、個体数が多いためにOP 50が不足し、各カウントセッションで食事制限の影響が現れるため除外します。生存個体として移動した個体の数と日付を記録してください。液体中での移動は固形培地上よりもはるかに容易であり、強い光によって誘発されることがあります。

高倍率を使用すると、咽頭の先端に見られるような非常にわずかな動きを捉えやすくなります。非常に高齢の個体では、このようなわずかな動きしか観察されないことがよくあります。プレートを20 °Cのインキュベーターに戻します。

すべての個体が死亡するまで、2〜3日ごとにカウントセッションを繰り返します。これは、ウェルごとの生存期間データを記録するためのExcelシートの設計です。プレート内の座標、系統、薬剤濃度、および実験開始時の0日目の全生存個体数を記録します。

各ウェルにおけるさまざまな個体群の生存率を追跡するため、週に3回、日付および生存動物数と死亡動物数を記録します。この図は、20 °Cおよび25 °Cで記録されたsea eleganceの寿命曲線の結果を示しています。マイクロタイタープレートを用いた寿命アッセイは、寿命の温度依存的な変化を正確に再現します。

同様に、ここで示すように、マイクロタイタープレートアッセイは、野生型N2個体とは異なる寿命を持つと報告されている変異体の寿命の変化を再現します。この図は、ミルタザピンの投与量を増やすことで、C. elegansの平均寿命にどのような影響が出るかを示しています。マイクロタイタープレートアッセイによって得られたデータは、用量反応関係を決定するのに十分な定量性を備えています。この手法を習得すれば、C. elegansの寿命を延ばす分子を探索するために、大規模な化合物ライブラリのスクリーニングに使用することが可能です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。