カルシウムインジケータ付きのロードショウジョウバエの神経終末

こんにちは、グレッグ・マクラウドです。私の研究室では、神経終末におけるカルシウム調節と、それが神経伝達に及ぼす影響について研究しています。私たちはこれをOph Melanogasterを用いて行っています。

ショウジョウバエは、遺伝的な操作が容易であり、単純でアクセスしやすい神経系を持つため、神経科学者にとって魅力的なモデル生物です。この神経系では、遺伝的にコードされた蛍光インジケーターを用いて、神経末端におけるカルシウム変化を検出することが可能です。しかし、これらのインジケーターはカルシウムに対する感度が低く、しばしば非線形な応答を示すことがあります。

神経活動に伴う急速なカルシウム変化の測定には、合成インジケーターがより適しています。ここでは、デキストリン結合合成カルシウムインジケーターを生神経末端に導入する手法を、oph lavaを用いて実演します。デキストリン結合させることで、カルシウムインジケーターがミトコンドリアなどのオルガネラに隔離されるのを防ぐことができます。

このローディング手法は、幼虫、胚、および成虫に同様に適用できます。ここでは、ガラススライド上の小型シガーバス内で幼虫の解剖を行います。青色のデンタルワックスを用いて、ガラスローディングベッドを固定します。

混雑していないバイアルの側面から、遊泳している3齢幼虫を1匹取り出します。幼虫を冷却したSchneider溶液の数滴の中に置き、背側正中線を上にして、頭部と尾部をピンで固定します。鋭いマイクロシザーを使用して、切り込みを入れます。

ここで、ハサミの下刃が入り込むのに十分な大きさの小さな切開をトラキアの間に入れます。背側の正中線に沿って、トラキアの間を通って頭部まで角質層を切開します。幼虫を180度回転させ、切開を尾端まで延長します。

下側のブレードを内臓に深く入れすぎないようにし、幼虫のみを切り出すことが重要です。さもなければ、調べたい筋肉や神経を損傷させてしまいます。ほとんどの内臓が切開口から押し出されますので、尾に近い部分で一度、ここでもう一度、気管の経路を切り取り、その後、頭部まで underlying trache をすべて切り離します。反対側でも同様に繰り返します。

大部分の内臓を切り離して浴槽から取り除きます。ここで一度ハサミを置き、2組目のピンセットを手に取ってください。外皮の切断端をつかみ、片側に固定します。

反対側でも同様に繰り返します。頭側に4セグメント進み、この手順を繰り返します。トリミングを行います。この段階で残っている内臓を取り除き、どのセグメントにおいても筋肉7、6、13、または12に損傷がないことを確認してください。

損傷がある場合は、別のlarvaを解剖してください。このような損傷は必然的に遺伝的な収縮を引き起こし、その後のイメージングに支障をきたすためです。以降の手順で、脳半球、腹側神経節、および節神経が確認できます。圧力切断端にある節神経をガラス製FOPベッドに引き込み、プラスチック充填フィラメントを使用して、神経の露出した末端にカルシウムインジケーターを塗布します。

まず、フィリングフィラメントの作製方法と、フィリングフィラメントを形成するためのフィリングエフェクトについて実演します。黄色い欠陥部分に2段階の引き伸ばし法を適用し、プラスチックが柔らかくなり透明になるまで、長さの半分までゆっくりと加熱します。この時点で加熱を停止し、すぐに先端を上に引き上げて細い線状に引き伸ばします。

直径は約0.5 mmです。フィラメントを50 mmの長さに切断します。次に、フィラメントを解剖顕微鏡下に置き、切断端を固定します。

親指の爪で端を固定し、もう一方の端を引いて、長さ1 cmの細いフィラメントを抽出します。フィラメントを潰さないよう、ティッシュペーパーの上で新しいカミソリの刃を用いて切断し、充填の準備を整えます。まず、フィラメントの入っていない薄壁キャピラリーを用意します。

ペットプルラーを用いて、先端を細く円錐形に整えます。準備したものを解剖顕微鏡下に移し、テーパー部分にサンドペーパーで切り込みを入れます。切り込みを入れた側とは反対方向に先端を押し、先端が垂直に折れるようにします。

破断部の内径は外径よりも大きくする必要があります。充填フィラメントの末端で、マイクロフォージを使用して、内径が約 12 µm になるまでガラス内部に熱収縮させます。ブンゼンバーナーを使用して、電極の鈍い端を研磨してください。

ぴったりとしたセルティックチューブを硬いポリエチレンチューブとシリンジに接続し、エフェクトの鈍端に負圧をかけることができます。このチューブとシリンジを用いて、フィラメントからカルシウムインジケーターを吸引および排出します。カルシウムインジケーターは、蒸留水に溶解して5 mMの濃度にする必要があります。

この溶液を5 µLずつ分注します。これを4 °Cで保存してください。必要になるまで、これらの分注液を凍結させないでください。

次に、カルシウムインジケーターを1〜2 cm、フィラメント内に吸い上げます。これで、この注入法において最も重要なステップに進む準備が整いました。ハサミとピンセットを用いて、最も前方にあるセグメント神経を、腹側神経節の近くで個別に切断してください。腹側神経節から最もAORセグメント神経塊を切り離します。

不要な破片を取り除きます。充填用フィラメントを歯科用ワックスランプ上に配置し、先端を幼虫の中心に合わせます。学術用チューブとシリンジを取り付けます。

Schneider液をパーフェクトチップに吸い上げます。次に、神経の末端をそのパーフェクトチップの中に吸い込みます。フィット感は、緩すぎず、かつきつすぎない程度に調整してください。

シュナイダーの保護領域へのさらなる侵入を阻止する必要があります。一般的に、ショラスティックチューブとシリンジを取り外し、Fフィラメントに取り付けます。静電気を放出させるため、フィラメントの側面をバス内のシュナイダーに接触させ、直ちに、神経の切断部から50 microns以内の位置に、実際に接触させることなくフィラメントガムエフェクトを挿入します。

次に、カルシウム指示薬をゆっくりと注入し、Schneider液の量を実質的に約3分の1増やします。これにより、最終的なカルシウム指示薬濃度を2 mM弱に調整します。調製液を暗所で室温の湿った場所に約40分間置きます。ここで2つの重要な点について説明します。

まず、カルシウム指示薬を希釈するために、チップ内に生理食塩水を用意する必要があります。カルシウム指示薬は水のみで溶解させていたためです。軸索封鎖（axon sealing）はカルシウム依存的なプロセスであり、神経末端の健全性を維持するために不可欠であるため、生理食塩水には数mMの濃度のカルシウムが含まれている必要があります。

2点目は、神経を切断してから、切断端に色素を適用するまでを5分以内に完了させる必要があるということです。5分が経過すると、軸索の末端が分子量10,000のデキストリン結合カルシウム指示薬を排除してしまいます。この時間制限内に処置を行うには、ある程度の練習が必要です。

カルシウム濃度を下げて軸索の天井を遅らせようとしないでください。これは、神経損傷後の生理学的機能を損なうだけだからです。40分間のインキュベーション後、シュナイダー液中の標本の充填フィラメントをバスの側面に触れさせ、再度挿入して、先端とスターターからカルシウム指示薬溶液の大部分を取り除きます。再びフィラメントを使用して、バスから新鮮なシュナイダー液を吸い上げ、ベッドをシュナイダー液で完全に満たします。

Schneider液はバスから絶縁された導電体の一つとして機能するため、ベッド内に気泡があってはなりません。また、刺激された神経をペットグラスに配置し、準備した試料を暗所に少なくとも60分間、ただし4時間を超えない範囲で置きます。インキュベーション中は30分ごとに新鮮なSchneider液で洗浄してください。カルシウム指示薬は、試料の観察を開始したい時間の20分前に、軸索末端に集積させます。その後、HL6溶液で洗浄してください。

グルタミン酸またはL-グルタミン酸を7 mMの濃度でHL6に加え、神経誘発性の筋収縮を停止させます。この際、カルシウム濃度が約0.4 mMを上回る場合は、目的のカルシウム濃度に調整してください。Schneider溶液は、すでに高濃度のグルタミン酸とカルシウムを含んでいるため、カルシウムイメージングには適していません。これらの濃度は必要に応じて調整してください。

Tateも存在しており、ローディング中にカルシウムが少なくとも2 million存在していれば、Schneiderの自家蛍光ローディングおよびイメージングをHL sixで実施することが可能です。イメージングのために複合顕微鏡で準備をセットアップする際は、 l自身からすべての静電気を放電させることを改めて確認してください。その後、ピンセットを用いてバス内の溶液と対物レンズの両方に触れてください。

浸漬用対物レンズを使用する場合は、対物レンズを浴槽まで下げ、ベースを刺激方向に一時的に接地させるか、あるいは一方を浴槽に入れ、もう一方を浴槽内に挿入します。3 V 未満、持続時間 300 µs の正方形 DC パルスを印加することで、神経の活動電位を確実に誘発できます。ここでは、GFP の細胞質発現により、筋肉 6 と 7 の間の隙間にある 2 組の神経終末が可視化されています。また、GFP とは異なる励起・蛍光スペクトルを持つカルシウム指標の Rhod Dextrin で前向性に充填されています。

この視野には依然として神経終末が含まれていますが、Rod Rinはカルシウムに対する親和性が低いため、神経が静止している間はほぼ不可視です。しかし、単一の活動電位または2秒間の短い刺激列の間に終末へ流入するカルシウムに対しては、非常に高い応答性を示します。ここに示した、先ほどの間隔の狭い80 hertz刺激の蛍光解析に見られるように、type one S終末における応答は、通常 type one B終末における応答よりも大きくなります。

Rod dextrinおよびFluなどの低親和性カルシウムインジケーター。Rod dextrinは、これらの末端において10から80 hertzの範囲の神経刺激周波数に対し、ほぼ線形の応答を示しました。ここに示す例は、Rod Dextrinをロードした筋肉番号4上の神経末端からのものです。