Name: カルシウムインジケータ付きのロードショウジョウバエの神経終末 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: 学ぶカルシウムインジケータのロードショウジョウバエ神経終末への導入法。Drosophilaを用いた神経伝達におけるカルシウム動態の可視化技術を解説し、装置作製法と実験の要点を示す。

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<ol><li>任意の固定液にさらされていないクリーンな解剖皿を選択します。 </li><li>シュナイダーのショウジョウバエのカルシウムを含有する培地+とL -グルタミンの放浪の第3齢幼虫ショウジョウバエの幼虫を解剖、（あらゆる神経や損傷の筋線維番号7、6、13または12をカットしないでください）。 </li><li> 12ミクロンの先端（内径）と、ピペットに充填ガラスを選択します。 </li><li>注射器とチューブを使用すると、（ピペットに負圧を適用するために）ピペットの先端がふさがれていないことを確認してください。 </li><li>ガラスピペットの長さを挿入することができる微細なプラスチック製の充填、フィラメントを選択します。 </li><li>プラスチック製のフィラメントに5mMのデキストランコンジュゲートのCa 2 +インジケーターの〜1cmを描く。 </li><li>すべてのセグメントの神経を切る。 </li><li>ピペットの先端が解剖幼虫の腹側正中線に近づくことを可能にするランプでピペットをサポートしています。 </li><li>ピペットの終わり（シュナイダーの培地の少量を含む）に、神経をつまむことなく、第4セグメントに神経の切断端を描画します。 </li><li>チューブを外し、フィラメントの端が神経の切断面の50ミクロン（神経を触れないように）以内になるまでピペットにプラスチック製のフィラメントを挿入する。 </li><li>イジェクト十分なカルシウムの約33％（最終濃度は、&lt;2mMのはず）でシュナイダーの培地の量を増加させる神経終末上に+ -インジケータ。重要 - これは、神経を切断してから5分以内に完了する必要があります。 </li><li>神経負荷しながら、室温で暗所で準備を置きます。 </li><li> 40分には、フィラメントを使用してのCa 2 + -インジケータを削除した後。 </li><li>代わりにピペットを残し、これが神経に刺激パルスを適用するために使用されるため、新鮮なシュナイダーの培地で完全にそれを埋める。 </li><li>のCa 2 +インジケーター少なくとも60分間神経で平衡させるが、これ以上の4よりも時間は、Ca 2 +イメージングを開始する前に。 </li><li>それは均衡している間30分ごとに新鮮なシュナイダーの培地で準備をすすぐ。 </li><li>イメージングの前に20分第六ソリューション（;マクラウドら2002; 2003年HL6）ライク血リンパとシュナイダーの培地を交換してください。 </li><li> L -グルタミン酸またはグルタミン酸は、神経誘発筋収縮（。。Reiffら2002; 2005年マクラウドら2004）を防ぐために、後シナプスのグルタミン酸受容体を脱感作するために7mmのでHL6溶液に添加することができます。 </li></ol>

<ol><li>Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).</li>
<li>Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+activity+in+the+Drosophila+larval+CNS+detected+with+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators.</a> J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).</li>
<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li>
<li>Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+active+zone+density+during+long-term+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).</li>
<li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

<table><tbody><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Insect Medium</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td>L-グルタミンおよびカルシウムを含む必要がある</td></tr><tr><td>L-グルタミン酸一ナトリウム水和物</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr></tbody></table>

カルシウムインジケータ付きのロードショウジョウバエの神経終末

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

カルシウムは神経伝達物質の放出のためのトリガー、および学習と記憶をサポートしているシナプス可塑性に不可欠なメッセンジャーとしてのより深いなしとしてより多くの印象的な神経系がどれもの多くの役割を果たしている。さらに、Ca 2 +依存性のシナプスメカニズムの分子基盤を解明するために、モデルシステムは、遺伝的に可鍛性および生理学的にアクセス可能の両方であることが必要です。キイロショウジョウバエはそのようなモデルが用意されています。このシステムでは、遺伝的に符号化された蛍光指示薬は、神経終末でのCa 2 +変化を検出するために用意されています。しかし、これらの指標は、Ca 2に対する感度が限られている+としばしば非線形応答を示す。合成蛍光指示薬は、より急速なCa 2 +は神経活動に伴う変化を測定するのに最適です。ここでは、ショウジョウバエの幼虫のライブの神経終末へのデキストランコンジュゲートの合成のCa 2 +インジケーターをロードするためのテクニックを示しています。特に重点がこのような拡張ローディング期間中に準備の健康を維持し、分離された神経に沿って、静電気の放電を回避する方法として、技術の成功に最も重要なプロトコルのこれらの側面に配置、およびCa 2を提供することにより、軸索の生存を確保しています+断絶された軸索終末のシールを促進する。このような蛍光- 4とrhodなどの低親和性デキストランコンジュゲートのCa 2 + -指標、、最小限の前シナプスのCa 2 +動態を中断しながら、高い信号対雑音比を示している使用可能です。デキストランコンジュゲーションは、+の指標がこのようなミトコンドリアなどの細胞小器官に隔離されているのCa 2を防ぐのに役立ちます。ローディング技術は幼虫、胚や大人にも同様に適用することができます。

カルシウムはシナプス強度の神経伝達物質の放出や変更をトリガするための不可欠な神経系におけるユビキタスメッセンジャー、です。ここでは、+ -の指標ショウジョウバエの神経終末へのCa 2をロードするためのテクニックを示しています。我々はまた、必要な装置の製造を実証し、技術の成功のための重要なポイントを強調する。

カルシウムは神経系において多くの役割を果たしているが、神経伝達物質放出のトリガーとしての役割ほど印象的なものはなく、また、...としての役割ほど深遠なものはない。

こんにちは、グレッグ・マクラウドです。私の研究室では、神経終末におけるカルシウム調節と、それが神経伝達に及ぼす影響について研究しています。私たちはこれをOph Melanogasterを用いて行っています。ショウジョウバエは、遺伝的な操作が容易であり、単純でアクセスしやすい神経系を持つため、神経科学者にとって魅力的なモデル生物です。この神経系では、遺伝的にコードされた蛍光インジケーターを用いて、神経末端におけるカルシウム変化を検出することが可能です。しかし、これらのインジケーターはカルシウムに対する感度が低く、しばしば非線形な応答を示すことがあります。神経活動に伴う急速なカルシウム変化の測定には、合成インジケーターがより適しています。ここでは、デキストリン結合合成カルシウムインジケーターを生神経末端に導入する手法を、oph lavaを用いて実演します。デキストリン結合させることで、カルシウムインジケーターがミトコンドリアなどのオルガネラに隔離されるのを防ぐことができます。このローディング手法は、幼虫、胚、および成虫に同様に適用できます。ここでは、ガラススライド上の小型シガーバス内で幼虫の解剖を行います。青色のデンタルワックスを用いて、ガラスローディングベッドを固定します。混雑していないバイアルの側面から、遊泳している3齢幼虫を1匹取り出します。幼虫を冷却したSchneider溶液の数滴の中に置き、背側正中線を上にして、頭部と尾部をピンで固定します。鋭いマイクロシザーを使用して、切り込みを入れます。ここで、ハサミの下刃が入り込むのに十分な大きさの小さな切開をトラキアの間に入れます。背側の正中線に沿って、トラキアの間を通って頭部まで角質層を切開します。幼虫を180度回転させ、切開を尾端まで延長します。下側のブレードを内臓に深く入れすぎないようにし、幼虫のみを切り出すことが重要です。さもなければ、調べたい筋肉や神経を損傷させてしまいます。ほとんどの内臓が切開口から押し出されますので、尾に近い部分で一度、ここでもう一度、気管の経路を切り取り、その後、頭部まで underlying trache をすべて切り離します。反対側でも同様に繰り返します。大部分の内臓を切り離して浴槽から取り除きます。ここで一度ハサミを置き、2組目のピンセットを手に取ってください。外皮の切断端をつかみ、片側に固定します。反対側でも同様に繰り返します。頭側に4セグメント進み、この手順を繰り返します。トリミングを行います。この段階で残っている内臓を取り除き、どのセグメントにおいても筋肉7、6、13、または12に損傷がないことを確認してください。損傷がある場合は、別のlarvaを解剖してください。このような損傷は必然的に遺伝的な収縮を引き起こし、その後のイメージングに支障をきたすためです。以降の手順で、脳半球、腹側神経節、および節神経が確認できます。圧力切断端にある節神経をガラス製FOPベッドに引き込み、プラスチック充填フィラメントを使用して、神経の露出した末端にカルシウムインジケーターを塗布します。まず、フィリングフィラメントの作製方法と、フィリングフィラメントを形成するためのフィリングエフェクトについて実演します。黄色い欠陥部分に2段階の引き伸ばし法を適用し、プラスチックが柔らかくなり透明になるまで、長さの半分までゆっくりと加熱します。この時点で加熱を停止し、すぐに先端を上に引き上げて細い線状に引き伸ばします。直径は約0.5 mmです。フィラメントを50 mmの長さに切断します。次に、フィラメントを解剖顕微鏡下に置き、切断端を固定します。親指の爪で端を固定し、もう一方の端を引いて、長さ1 cmの細いフィラメントを抽出します。フィラメントを潰さないよう、ティッシュペーパーの上で新しいカミソリの刃を用いて切断し、充填の準備を整えます。まず、フィラメントの入っていない薄壁キャピラリーを用意します。ペットプルラーを用いて、先端を細く円錐形に整えます。準備したものを解剖顕微鏡下に移し、テーパー部分にサンドペーパーで切り込みを入れます。切り込みを入れた側とは反対方向に先端を押し、先端が垂直に折れるようにします。破断部の内径は外径よりも大きくする必要があります。充填フィラメントの末端で、マイクロフォージを使用して、内径が約 12 µm になるまでガラス内部に熱収縮させます。ブンゼンバーナーを使用して、電極の鈍い端を研磨してください。ぴったりとしたセルティックチューブを硬いポリエチレンチューブとシリンジに接続し、エフェクトの鈍端に負圧をかけることができます。このチューブとシリンジを用いて、フィラメントからカルシウムインジケーターを吸引および排出します。カルシウムインジケーターは、蒸留水に溶解して5 mMの濃度にする必要があります。この溶液を5 µLずつ分注します。これを4 °Cで保存してください。必要になるまで、これらの分注液を凍結させないでください。次に、カルシウムインジケーターを1〜2 cm、フィラメント内に吸い上げます。これで、この注入法において最も重要なステップに進む準備が整いました。ハサミとピンセットを用いて、最も前方にあるセグメント神経を、腹側神経節の近くで個別に切断してください。腹側神経節から最もAORセグメント神経塊を切り離します。不要な破片を取り除きます。充填用フィラメントを歯科用ワックスランプ上に配置し、先端を幼虫の中心に合わせます。学術用チューブとシリンジを取り付けます。Schneider液をパーフェクトチップに吸い上げます。次に、神経の末端をそのパーフェクトチップの中に吸い込みます。フィット感は、緩すぎず、かつきつすぎない程度に調整してください。シュナイダーの保護領域へのさらなる侵入を阻止する必要があります。一般的に、ショラスティックチューブとシリンジを取り外し、Fフィラメントに取り付けます。静電気を放出させるため、フィラメントの側面をバス内のシュナイダーに接触させ、直ちに、神経の切断部から50 microns以内の位置に、実際に接触させることなくフィラメントガムエフェクトを挿入します。次に、カルシウム指示薬をゆっくりと注入し、Schneider液の量を実質的に約3分の1増やします。これにより、最終的なカルシウム指示薬濃度を2 mM弱に調整します。調製液を暗所で室温の湿った場所に約40分間置きます。ここで2つの重要な点について説明します。まず、カルシウム指示薬を希釈するために、チップ内に生理食塩水を用意する必要があります。カルシウム指示薬は水のみで溶解させていたためです。軸索封鎖（axon sealing）はカルシウム依存的なプロセスであり、神経末端の健全性を維持するために不可欠であるため、生理食塩水には数mMの濃度のカルシウムが含まれている必要があります。2点目は、神経を切断してから、切断端に色素を適用するまでを5分以内に完了させる必要があるということです。5分が経過すると、軸索の末端が分子量10,000のデキストリン結合カルシウム指示薬を排除してしまいます。この時間制限内に処置を行うには、ある程度の練習が必要です。カルシウム濃度を下げて軸索の天井を遅らせようとしないでください。これは、神経損傷後の生理学的機能を損なうだけだからです。40分間のインキュベーション後、シュナイダー液中の標本の充填フィラメントをバスの側面に触れさせ、再度挿入して、先端とスターターからカルシウム指示薬溶液の大部分を取り除きます。再びフィラメントを使用して、バスから新鮮なシュナイダー液を吸い上げ、ベッドをシュナイダー液で完全に満たします。Schneider液はバスから絶縁された導電体の一つとして機能するため、ベッド内に気泡があってはなりません。また、刺激された神経をペットグラスに配置し、準備した試料を暗所に少なくとも60分間、ただし4時間を超えない範囲で置きます。インキュベーション中は30分ごとに新鮮なSchneider液で洗浄してください。カルシウム指示薬は、試料の観察を開始したい時間の20分前に、軸索末端に集積させます。その後、HL6溶液で洗浄してください。グルタミン酸またはL-グルタミン酸を7 mMの濃度でHL6に加え、神経誘発性の筋収縮を停止させます。この際、カルシウム濃度が約0.4 mMを上回る場合は、目的のカルシウム濃度に調整してください。Schneider溶液は、すでに高濃度のグルタミン酸とカルシウムを含んでいるため、カルシウムイメージングには適していません。これらの濃度は必要に応じて調整してください。Tateも存在しており、ローディング中にカルシウムが少なくとも2 million存在していれば、Schneiderの自家蛍光ローディングおよびイメージングをHL sixで実施することが可能です。イメージングのために複合顕微鏡で準備をセットアップする際は、 l自身からすべての静電気を放電させることを改めて確認してください。その後、ピンセットを用いてバス内の溶液と対物レンズの両方に触れてください。浸漬用対物レンズを使用する場合は、対物レンズを浴槽まで下げ、ベースを刺激方向に一時的に接地させるか、あるいは一方を浴槽に入れ、もう一方を浴槽内に挿入します。3 V 未満、持続時間 300 µs の正方形 DC パルスを印加することで、神経の活動電位を確実に誘発できます。ここでは、GFP の細胞質発現により、筋肉 6 と 7 の間の隙間にある 2 組の神経終末が可視化されています。また、GFP とは異なる励起・蛍光スペクトルを持つカルシウム指標の Rhod Dextrin で前向性に充填されています。この視野には依然として神経終末が含まれていますが、Rod Rinはカルシウムに対する親和性が低いため、神経が静止している間はほぼ不可視です。しかし、単一の活動電位または2秒間の短い刺激列の間に終末へ流入するカルシウムに対しては、非常に高い応答性を示します。ここに示した、先ほどの間隔の狭い80 hertz刺激の蛍光解析に見られるように、type one S終末における応答は、通常 type one B終末における応答よりも大きくなります。Rod dextrinおよびFluなどの低親和性カルシウムインジケーター。Rod dextrinは、これらの末端において10から80 hertzの範囲の神経刺激周波数に対し、ほぼ線形の応答を示しました。ここに示す例は、Rod Dextrinをロードした筋肉番号4上の神経末端からのものです。

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