Name: リビングでのイメージング、細胞の形状の変更ショウジョウバエ胚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学ぶショウジョウバエ胚の細胞形状変化のライブ共焦点イメージング法。GFP標識プローブを用いて細胞化過程をリアルタイムで観察し、発生生物学研究に有用な動的解析技術を習得できます。

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我々は感謝して、このプロトコルが開発された基盤を提供するエリックヴィーシャウを、認めます。私たちの仕事は、ヴァーナ＆マーズマクリーン生化学部および分子生物学スタートアップ賞、ベイラー医科大学でサポートされています。

<ol><li>Sagona, A. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis and cancer.</a> FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).</li>
<li>Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease.</a> Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).</li>
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<li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).</li>
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<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. uf <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+actin-dependent+endocytosis+is+zygotically+controlled+to+initiate+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization.</a> Dev Cell. 14, 775-786 (2008).</li>
<li>Fox, D. T., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abelson+kinase+%28Abl%29+and+RhoGEF2+regulate+actin+organization+during+cell+constriction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila.</a> Development. 134, 567-578 (2007).</li>
<li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+contractions+of+an+actin-myosin+network+drive+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457, 495-499 (2009).</li>
<li>Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-dependent+junction+remodelling+controls+planar+cell+intercalation+and+axis+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation.</a> Nature. 429, 667-671 (2004).</li>
<li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Dev Cell. 11, 459-470 (2006).</li>
<li>Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip-cell+migration+controls+stalk-cell+intercalation+during+Drosophila+tracheal+tube+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation.</a> Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr Biol. 20, 359-366 (2010).</li>
<li>Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. artinez, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+global+cell+behaviour+during+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila.</a> Development. 136, 1889-1898 (2009).</li>
<li>Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+forces+timed+by+a+ratchet-like+mechanism+drive+directed+tissue+movement+during+dorsal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure.</a> Cell. 137, 1331-1342 (2009).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotically+controlled+F-actin+establishes+cortical+compartments+to+stabilize+furrows+during+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization.</a> J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここに記述されているプロトコルは、開発途上ハエの胚の細胞の形状の変化の数のライブ、共焦点イメージングを可能にするでしょう。イメージングのためのGFPの株式は、個々の研究室（表2）により調製するが、多くのそのような株は、インディアナ大学（アットブルーミントンショウジョウバエストックセンターとしてのセンターからも公開されていることができる<a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">http://flystocks.bio.indiana.edu</a> ）とハエトリソウエール大学（現在のストックセンター<a href="http://flytrap.med.yale.edu">http://flytrap.med.yale.edu</a> ）。一度取得したこれらのライブイメージングデータは、徹底的にそのドライブの細胞の形状変化と組織の形態形成蛋白質の機能は、サブ細胞の活動、および生物物理学的パラメータを定義するために定量分析と組み合わせることができます。

<table><tbody><tr><td>スライドグラス</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>カバーグラス 25x25</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 2-524C</td><td></td></tr><tr><td>洗浄ボトル (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-897-11</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falconチューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>小容量ピペット用バルブ, 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>キャップ付きシンチレーションバイアル</td><td>VWR international</td><td>66021-533</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Cornビーカー, 100 mL</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>60970</td><td></td></tr><tr><td>BD Falconシャーレ 60x15mm </td><td>Fisher Scientific</td><td>08757 100B</td><td></td></tr><tr><td>BD Falconセルストレーナー</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>黄色ピペットチップ</td><td>Rainin</td><td>L200</td><td></td></tr><tr><td>ステンレスメッシュ, 304, 12x24</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150-F-01</td><td></td></tr><tr><td>ガラス製 5&amp;#190; インチ パスツールピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>P4 ろ紙</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-803-6F</td><td></td></tr><tr><td>輪ゴム</td><td>Office Max</td><td>A620645</td><td></td></tr><tr><td>Scotch 両面テープ, &amp;frac12; インチ</td><td>Office Max</td><td>A8137DM-2</td><td></td></tr><tr><td>Robert Simmons Expression 絵筆 E85 丸筆 #2</td><td>Jerry&amp;rsquo;s Artarama</td><td>56460</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 ピンセット 高精度 Inox</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-DZ</td><td></td></tr><tr><td>カミソリブレード</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>ハロカーボンオイル 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 8773</td><td></td></tr><tr><td>ヘプタン</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Agar</td><td>VWR international</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>p-ヒドロキシ安息香酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Red Star アクティブドライイースト</td><td>LeSaffre</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>ペーパータオル, C-fold</td><td>Kleenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>厚手アルミホイル</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>Austin&amp;rsquo;s A-1 Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% アップルジュース</td><td>Ocean Spray または Tree Top</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

リビングでのイメージング、細胞の形状の変更ショウジョウバエ胚

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

開発キイロショウジョウバエの胚では、共焦点イメージングを生きるために非常に従順な細胞形状の変化の回数を受ける。ハエの細胞の形状の変化は、高等生物と似ています、そして、彼らは組織の形態形成を駆動する。そう、多くの場合、彼らの研究は、ヒトの疾患（表1）1-5を理解するための直接的な意味を持っています。サブセルラー規模で、これらの細胞形状の変化は、遺伝子発現からシグナル伝達、細胞極性、細胞骨格の再構成と膜輸送に至るまでの活動の産物です。このように、 ショウジョウバエの胚は、彼らが組織の形態形成に関連する細胞の形状の変化を評価するだけでなく、文脈を提供するだけでなく、形状の細胞がそのサブ細胞の活動を研究するために完全に生理学的な環境を提供しています。 プロトコルは、画像細胞化と呼ばれる特定の細胞の形状変化をするように設計されてここで説明する。細胞化は、劇的な細胞膜の成長の過程であり、そしてそれは最終的に細胞性胞胚にシンシチウム胚を変換します。有糸分裂サイクル14の相間で、すなわち、原形質膜は、同時に一次上皮細胞のシートを生成するために〜6000皮質固定された核のそれぞれの周囲に陥入する。前の提案にカウンター、細胞化は、ミオシン- 2収縮6によって駆動されていませんが、代わりに主に内部貯蔵7から膜のエキソサイトーシスによって支えられています。従って、細胞化は、細胞質分裂や筋肉の横-細管（T管）形態形成などの原形質膜の陥入や拡張を必要とする細胞の形状の変化、中膜輸送を研究するための優れたシステムです。 このプロトコルは簡単に​​ハエの胚で他の細胞の形状変化のイメージングに適用される、そして唯一のそのような胚のコレクションのステージを変更する、または特定の方向（表で胚をマウントする&quot;胚の接着剤&quot;を使用するなど、わずかな適応を必要としていることに注意してください1）8-19。すべてのケースでは、ワークフローは基本的には（図1）と同じです。クローニングおよびショウジョウバエ遺伝子導入のための標準的な方法は、緑色蛍光タンパク質（GFP）またはその変異体に融合された、興味のあるタンパク質を発現するサシバエの在庫を準備するために使用され、これらのハエでは胚の再生可能エネルギー源を提供しています。また、蛍光蛋白質/プローブを直接簡単なマイクロインジェクション技術90から10を経由してハエの胚に導入されています。その後、発生事象および撮像される細胞の形状変化に応じて、胚を回収して解剖顕微鏡で形態によって上演され、最後に位置し、共焦点顕微鏡でタイムラプスイメージングのためにマウント。

ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエ、開発の初期段階はよくイメージングアプローチに適している細胞の形状の変更の数によって特徴付けられる。この記事では、ショウジョウバエの胚のライブ共焦点イメージングに必要な基本的なツールと方法を説明します、そして細胞化と呼ばれる細胞の形状変化に焦点を当てます。

発生過程にあるキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の胚では、ライブ共焦点イメージングに適した多くの細胞形態の変化が起こります。細胞の形態は…

この手順の全体的な目的は、生きているショウジョウバエ胚における細胞形態の変化をイメージングすることです。まず、GFPタグ付きのタンパク質プローブを発現するトランスジェニックフライストックを作製および拡大させます。次に、これらのハエを胚回収カップに移動させます。手順の第3ステップは、胚を回収することです。第4ステップでは、胚のコーティングとマウントを行います。最終的に、マウントした胚のタイムラプス共焦点イメージングにより、細胞の形態変化などの結果を得ることができます。固定組織イメージングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、生体胚において細胞形態変化の動的な側面を捉えられることです。ここで説明する方法は食道形成に特化したものですが、腹側溝の形成、胚帯伸長、気管形成、背側閉鎖など、ショウジョウバエの初期発生に伴う他の細胞形態変化にも適応し、応用することが可能です。この手法に慣れていない方は、解剖顕微鏡下での胚の操作およびマウントに困難を感じることがよくあります。私の指導教授であるAnna Marie Sokiと私は、この手順を実演します。まず、胚を回収するためのカップを作製します。100 milliliterのtricorn beakerの底をカミソリで切り取り、切り口をできるだけ滑らかにします。また、上部の3つの角を切り落として、カップを扱いやすくします。次に, ドラフトチャンバー内で、6 cm × 6 cm の正方形にカットしたワイヤーメッシュを用意します。あらかじめ予熱したホットプレートの上に厚手のアルミホイルを敷き、その上にワイヤーメッシュの正方形を置きます。カップのカットした底辺を、加熱されたメッシュの上にしっかりと押し付けます。数秒間待ち、メッシュが装着されたカップを持ち上げます。ホイルも付着している場合は、剥がしてください。翌日までカップを一晩静置します。ハサミで余分なメッシュを取り除き、目の細かいサンドペーパーで鋭いエッジを研磨します。次のステップは、雌 flies による胚生産を促進するための酵母ペーストの作成です。小さなカップに Red Star active dry yeast と蒸留水をほぼ等量ずつ入れ、酵母が溶けるまでかき混ぜます。ペーストは、湿ったピーナッツバターに近い粘度にする必要があります。酵母ペーストが完成したら、4 °Cで保存していたリンゴジュース寒天培地プレートを取り出します。リンゴジュース寒天培地プレートの作製方法については、付随する原稿のストリーク項に記載されています。リンゴジュースをプレートに分注し、酵母ペーストと共に、プレートが室温になるまで少なくとも1時間待ちます。円形のフィルターペーパーを半分に折り、さらに半分に折ります。紙を直径8～9 cmに切り揃えます。扇形の4分の1の範囲でアコーディオン状に折り畳みます。円を広げて反転させ、メッシュに触れるまで回収カップに挿入します。紙がカップの中で固定され、落下してショウジョウバエを押し潰さないようにしてください。それでは、ハエを移します。2週間繁殖させたストックボトルを用意します。このボトルには、胚回収カップ1つ分として最低でも雌50匹と雄30匹を十分に満たす数のハエが入っているはずです。最適な産卵を得るために、孵化後5日以内のフライを使用してください。収集カップに系統名と日付を記入します。フライが入ったボトルを逆さまにし、ゆっくりと収集カップの上で振ってフライをカップに移し、直ちに準備したアップルジュースプレートでカップを覆います。ゴムバンドを用いてプレートをカップに固定します。カップをメッシュのシールドで覆い、直射日光が当たる室温の場所に設置してください。ハエは暗い場所ではうまく産卵しないため、カップに影が落ちないように注意してください。2時間後、リンゴジュースプレートを新しいプレートに交換し、室温で胚を回収します。細胞のイメージングに最適です。次に、胚用のマウントチャンバーを準備します。そのために、2〜3 cmの長さの両面テープを切り、スライドグラス上の長軸に合わせて貼り付けます。2〜3 cmの長さの両面テープをもう1枚切り出し、端を揃えて最初の手順で貼ったテープの上に重ねます。カミソリを使用して、テープの中央に、スライドの長軸に対して垂直に、約 3 mm 間隔で2本の切り込みを入れます。切り込みの間のテープを取り除いてチャンネルを作成し、そのチャンネルにハロカーボン27オイルをピペットで滴下します。このチャネルは胚をマウントさせる場所です。50% bleachでアップルジュースプレートを30～60秒間覆い、胚をコートします。セルストレーナーで胚を回収し、 squirt bottleを用いて蒸留水で十分に洗浄します。ストレーナーをペーパータオルで軽く押さえて水分を取り除きます。湿らせた絵筆を用いて、コーティングされた胚を10から50個、酵母ペーストの入っていない清潔なアップルジュースプレートに移します。ペーパータオルのちぎった端で水を吸い取り、直ちに少量のハロカーボン27オイルで胚を覆います。透過光を備えた実体顕微鏡にリンゴジュースプレートを移動させます。形態学的ガイドラインに従って胚のステージングを行います。ピンセットを使用し、バウンドステージ4に相当する有糸分裂サイクル11または12の胚5個を、マウンティングチャンバーのチャンネルに転送します。胚を、背側と腹側が見えるようにし、側面を下にして一列に並べます。オイルのみを用いることで、胚を容易にこの方向で配置できます。胚同士が密集するのを避けるため、胚の間には少なくとも胚の長さの半分以上の間隔を空けてください。25 by 25 ミリメートルのカバーガラスの一辺を、チャネルの一端にある両面テープの上に置き、カバーガラスの端をテープの端に合わせます。そのままカバーガラスを倒してチャネルを覆います。カバーガラスの下に気泡が入った場合は、カバーの端に少量のオイルを塗布してください。スリップ毛細管現象により、オイルがチャネル内に引き込まれ、空気が押し出されます。マウンティングチャンバーを共焦点顕微鏡に設置し、透過光を用いて胚を探します。その後、共焦点イメージングに切り替え、胚の中央付近の単一平面における細胞像の関心領域にフォーカスを合わせます。陥入のダイナミクスを追跡するには、タイムラプスイメージングのために30から62の間隔を使用します。画像を取得後、NIHのフリーウェアパッケージであるImageJなどの画像解析パッケージを用いて解析します。データは、動画、シーケンス、またはCHグラフとして提示することが可能です。細胞以外の細胞形状の変化をイメージングする場合、オイルのみでは維持することが困難な、特定の方向で胚を固定する必要がある場合があります。そのためには、前述とは異なる別の固定方法を用います。まず、20 cmの両面テープと250 µLのヘプタンをアレーションバイアルに入れ、胚用グルーを作成します。このアレーションバイアルをムテーターまたは回転プラットフォームに設置し、一晩混合します。翌日、黄色のピペットチップを胚用グルーに浸し、その後、胚用グルーに含まれるヘプタンが蒸発している間に、スライドガラス上にピペットチップでグルーの跡をなぞるように引きます。ステージングした胚をアガロースブロック上に配置し、イメージングしたい胚の表面がアガロース側を向くようにします。例えば、細胞形状の変化をイメージングする場合などがこれに当たります。ファロウ（farrow）形成の際、胚の腹側をアガーに向けて固定します。胚用接着剤を塗布したスライドを反転させ、アガーブロック上の胚に対して接着剤の列を軽く押し付けます。その後、スライドを再び反転させます。ほとんどの胚が適切な向きでスライドガラスに固定されているはずです。次に、胚の両側に両面テープを2層にわたって貼り付けます。それらをhalo carbon 27オイルで覆い、カバーガラスを被せます。胚のイメージング準備が整いました。これらの写真は、細胞胚のタイムラプスイメージングを示しており、胚の背側と腹側が明確に視認できる状態でマウントされ、中央付近を撮影しています。断面における細胞膜の陥入を追跡するため、ここで示す胚はGFP myosin twoプローブを発現しており、これは細胞膜の陥入先端に集積します。この前縁の経時的な移動を追跡することで、細胞膜が陥入する速度を算出できます。0分の時点は細胞化の開始に対応し、56分を少し過ぎた時点で胚の腹側で原腸陥入が始まります。この細胞のタイムラプス動画は、前の有糸分裂サイクル（13回目）から開始されており、擬似分裂、溝の退行を捉え、胚の腹側で原腸運動が観察されるまで継続しました。習熟すれば、適切に実施することで、マウントとイメージングを60分から90分で完了させることができます。当然ながら、胚の回収には別途時間が必要であり、マウントおよびイメージングとの調整を行う必要があります。この手順を行う際は、胚の健康状態を良好に維持するために可能な限りの措置を講じることが重要です。例えば、胚の漂白しすぎに注意し、本手順に従ったイメージング中のレーザー照射時間を制限してください。ある細胞形状の変化に伴う細胞骨格および膜のダイナミクスはどのようなものか、といったさらなる疑問を解決するためには、フォトブリーチングやフォトスイッチングなどのより高度なイメージング技術を利用することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

ここでは、ステンドグラスの取り付けプロトコルを提示...

の直立イメージングショウジョウバエ胚

ここでは、アポトーシス細胞のクリアランスのダイナミクスを研究するための効果的な方法を説明...

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

本論文では、直接蛹殻を介して画像細胞挙動への高速走査型共焦点顕微鏡を使用する方法を示します。そのまま蛹ケースを残すことによって、このメソッドを直接学ぶことは困難であるショウジョウバエの発生段階で動的な細胞プロセスの観察と測定を可能にします。...

の蛹ケースを画像化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

このプロトコルは、生きたショウジョウバエの蛹の眼神経上皮をイメージングするための効率的な方法を提供します。この方法は、組織の動きと不均一なトポロジーを補正し、複数のGFPタグ付き接合タンパク質を使用して細胞境界の視覚化を強化し、簡単に組み立てられるイメージングリグを使用します。...

のライブイメージングショウジョウバエ蛹アイ

ここでは、ショウジョウバエの原腸陥入のライブ画像を撮影する手順を説明します。これにより、初期発生に関与する頂端狭窄をより深く理解し、組織構造修飾中の細胞の動きを支配するメカニズムをさらに解析することが可能になりました。...

セル形状変化のイメージングと細胞運動でショウジョウバエ原腸陥入

このプロトコルは、ショウジョウバエが変態を受ける中、ショウジョウバエ腹部上皮の細胞配向および組織成長のダイナミクスのイメージングと分析のために設計されています。ここで説明する方法論は、ショウジョウバエまたは他のモデル生物における異なる発達段階、組織、および細胞下構造の研究に適用することができる。...

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

このプロトコルの目的は、熱ストレスに続いて、ショ ウジョウバエ...

ライブ熱ストレスショ ウジョウバエ 胚における核内アクチンロッドのイメージング

このプロトコルでは、従来のGFP/mCherryタグアプローチでは検出が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾のライブイメージングを可能にするために、カスタマイズされた抗体ベースの蛍光標識とショウ ジョウバエ...

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

ここでは、ショウジョウバエの卵巣ニッチにおける生殖幹細胞(GSC)の非対称分裂のライブイメージングを行うための詳細なプロトコルを提供します。私たちは、スペクトロソームタンパク質Par-1の緑色蛍光タンパク質(GFP)融合を遍在的に発現するトランスジェニックラインを使用しています。...

雌のショウジョウバエ・メラノガスター生殖幹細胞ニッチの長時間のライブイメージング

ここでは、蛹の完全除去を含む、蛹期の ショウジョウバエ...

蛹摘出後の ショウジョウバエ の蛹の脚の発達の長期ライブイメージング

学ぶショウジョウバエ胚の細胞形状変化のライブ共焦点イメージング法。GFP標識プローブを用いて細胞化過程をリアルタイムで観察し、発生生物学研究に有用な動的解析技術を習得できます。

リビングでのイメージング、細胞の形状の変更ショウジョウバエ胚

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