Name: リビングでのイメージング、細胞の形状の変更ショウジョウバエ胚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学ぶショウジョウバエ胚の細胞形状変化のライブ共焦点イメージング法。GFP標識プローブを用いて細胞化過程をリアルタイムで観察し、発生生物学研究に有用な動的解析技術を習得できます。

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我々は感謝して、このプロトコルが開発された基盤を提供するエリックヴィーシャウを、認めます。私たちの仕事は、ヴァーナ＆マーズマクリーン生化学部および分子生物学スタートアップ賞、ベイラー医科大学でサポートされています。

<ol><li>Sagona, A. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis and cancer.</a> FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).</li>
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<li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+contractions+of+an+actin-myosin+network+drive+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457, 495-499 (2009).</li>
<li>Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-dependent+junction+remodelling+controls+planar+cell+intercalation+and+axis+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation.</a> Nature. 429, 667-671 (2004).</li>
<li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Dev Cell. 11, 459-470 (2006).</li>
<li>Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip-cell+migration+controls+stalk-cell+intercalation+during+Drosophila+tracheal+tube+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation.</a> Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr Biol. 20, 359-366 (2010).</li>
<li>Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. artinez, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+global+cell+behaviour+during+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila.</a> Development. 136, 1889-1898 (2009).</li>
<li>Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+forces+timed+by+a+ratchet-like+mechanism+drive+directed+tissue+movement+during+dorsal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure.</a> Cell. 137, 1331-1342 (2009).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotically+controlled+F-actin+establishes+cortical+compartments+to+stabilize+furrows+during+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization.</a> J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここに記述されているプロトコルは、開発途上ハエの胚の細胞の形状の変化の数のライブ、共焦点イメージングを可能にするでしょう。イメージングのためのGFPの株式は、個々の研究室（表2）により調製するが、多くのそのような株は、インディアナ大学（アットブルーミントンショウジョウバエストックセンターとしてのセンターからも公開されていることができる<a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">http://flystocks.bio.indiana.edu</a> ）とハエトリソウエール大学（現在のストックセンター<a href="http://flytrap.med.yale.edu">http://flytrap.med.yale.edu</a> ）。一度取得したこれらのライブイメージングデータは、徹底的にそのドライブの細胞の形状変化と組織の形態形成蛋白質の機能は、サブ細胞の活動、および生物物理学的パラメータを定義するために定量分析と組み合わせることができます。

<table><tbody><tr><td>スライドグラス</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>カバーグラス 25x25</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 2-524C</td><td></td></tr><tr><td>洗浄ボトル (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-897-11</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falconチューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>小容量ピペット用バルブ, 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>キャップ付きシンチレーションバイアル</td><td>VWR international</td><td>66021-533</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Cornビーカー, 100 mL</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>60970</td><td></td></tr><tr><td>BD Falconシャーレ 60x15mm </td><td>Fisher Scientific</td><td>08757 100B</td><td></td></tr><tr><td>BD Falconセルストレーナー</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>黄色ピペットチップ</td><td>Rainin</td><td>L200</td><td></td></tr><tr><td>ステンレスメッシュ, 304, 12x24</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150-F-01</td><td></td></tr><tr><td>ガラス製 5&amp;#190; インチ パスツールピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>P4 ろ紙</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-803-6F</td><td></td></tr><tr><td>輪ゴム</td><td>Office Max</td><td>A620645</td><td></td></tr><tr><td>Scotch 両面テープ, &amp;frac12; インチ</td><td>Office Max</td><td>A8137DM-2</td><td></td></tr><tr><td>Robert Simmons Expression 絵筆 E85 丸筆 #2</td><td>Jerry&amp;rsquo;s Artarama</td><td>56460</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 ピンセット 高精度 Inox</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-DZ</td><td></td></tr><tr><td>カミソリブレード</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>ハロカーボンオイル 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 8773</td><td></td></tr><tr><td>ヘプタン</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Agar</td><td>VWR international</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>p-ヒドロキシ安息香酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Red Star アクティブドライイースト</td><td>LeSaffre</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>ペーパータオル, C-fold</td><td>Kleenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>厚手アルミホイル</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>Austin&amp;rsquo;s A-1 Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% アップルジュース</td><td>Ocean Spray または Tree Top</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

リビングでのイメージング、細胞の形状の変更ショウジョウバエ胚

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

開発キイロショウジョウバエの胚では、共焦点イメージングを生きるために非常に従順な細胞形状の変化の回数を受ける。ハエの細胞の形状の変化は、高等生物と似ています、そして、彼らは組織の形態形成を駆動する。そう、多くの場合、彼らの研究は、ヒトの疾患（表1）1-5を理解するための直接的な意味を持っています。サブセルラー規模で、これらの細胞形状の変化は、遺伝子発現からシグナル伝達、細胞極性、細胞骨格の再構成と膜輸送に至るまでの活動の産物です。このように、 ショウジョウバエの胚は、彼らが組織の形態形成に関連する細胞の形状の変化を評価するだけでなく、文脈を提供するだけでなく、形状の細胞がそのサブ細胞の活動を研究するために完全に生理学的な環境を提供しています。 プロトコルは、画像細胞化と呼ばれる特定の細胞の形状変化をするように設計されてここで説明する。細胞化は、劇的な細胞膜の成長の過程であり、そしてそれは最終的に細胞性胞胚にシンシチウム胚を変換します。有糸分裂サイクル14の相間で、すなわち、原形質膜は、同時に一次上皮細胞のシートを生成するために〜6000皮質固定された核のそれぞれの周囲に陥入する。前の提案にカウンター、細胞化は、ミオシン- 2収縮6によって駆動されていませんが、代わりに主に内部貯蔵7から膜のエキソサイトーシスによって支えられています。従って、細胞化は、細胞質分裂や筋肉の横-細管（T管）形態形成などの原形質膜の陥入や拡張を必要とする細胞の形状の変化、中膜輸送を研究するための優れたシステムです。 このプロトコルは簡単に​​ハエの胚で他の細胞の形状変化のイメージングに適用される、そして唯一のそのような胚のコレクションのステージを変更する、または特定の方向（表で胚をマウントする&quot;胚の接着剤&quot;を使用するなど、わずかな適応を必要としていることに注意してください1）8-19。すべてのケースでは、ワークフローは基本的には（図1）と同じです。クローニングおよびショウジョウバエ遺伝子導入のための標準的な方法は、緑色蛍光タンパク質（GFP）またはその変異体に融合された、興味のあるタンパク質を発現するサシバエの在庫を準備するために使用され、これらのハエでは胚の再生可能エネルギー源を提供しています。また、蛍光蛋白質/プローブを直接簡単なマイクロインジェクション技術90から10を経由してハエの胚に導入されています。その後、発生事象および撮像される細胞の形状変化に応じて、胚を回収して解剖顕微鏡で形態によって上演され、最後に位置し、共焦点顕微鏡でタイムラプスイメージングのためにマウント。

ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエ、開発の初期段階はよくイメージングアプローチに適している細胞の形状の変更の数によって特徴付けられる。この記事では、ショウジョウバエの胚のライブ共焦点イメージングに必要な基本的なツールと方法を説明します、そして細胞化と呼ばれる細胞の形状変化に焦点を当てます。

発生過程にあるキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の胚では、ライブ共焦点イメージングに適した多くの細胞形態の変化が起こります。細胞の形態は…

この手順の全体的な目的は、生きているショウジョウバエ胚における細胞形態の変化をイメージングすることです。まず、GFPタグ付きのタンパク質プローブを発現するトランスジェニックフライストックを作製および拡大させます。次に、これらのハエを胚回収カップに移動させます。手順の第3ステップは、胚を回収することです。第4ステップでは、胚のコーティングとマウントを行います。最終的に、マウントした胚のタイムラプス共焦点イメージングにより、細胞の形態変化などの結果を得ることができます。固定組織イメージングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、生体胚において細胞形態変化の動的な側面を捉えられることです。ここで説明する方法は食道形成に特化したものですが、腹側溝の形成、胚帯伸長、気管形成、背側閉鎖など、ショウジョウバエの初期発生に伴う他の細胞形態変化にも適応し、応用することが可能です。この手法に慣れていない方は、解剖顕微鏡下での胚の操作およびマウントに困難を感じることがよくあります。私の指導教授であるAnna Marie Sokiと私は、この手順を実演します。まず、胚を回収するためのカップを作製します。100 milliliterのtricorn beakerの底をカミソリで切り取り、切り口をできるだけ滑らかにします。また、上部の3つの角を切り落として、カップを扱いやすくします。次に, ドラフトチャンバー内で、6 cm × 6 cm の正方形にカットしたワイヤーメッシュを用意します。あらかじめ予熱したホットプレートの上に厚手のアルミホイルを敷き、その上にワイヤーメッシュの正方形を置きます。カップのカットした底辺を、加熱されたメッシュの上にしっかりと押し付けます。数秒間待ち、メッシュが装着されたカップを持ち上げます。ホイルも付着している場合は、剥がしてください。翌日までカップを一晩静置します。ハサミで余分なメッシュを取り除き、目の細かいサンドペーパーで鋭いエッジを研磨します。次のステップは、雌 flies による胚生産を促進するための酵母ペーストの作成です。小さなカップに Red Star active dry yeast と蒸留水をほぼ等量ずつ入れ、酵母が溶けるまでかき混ぜます。ペーストは、湿ったピーナッツバターに近い粘度にする必要があります。酵母ペーストが完成したら、4 °Cで保存していたリンゴジュース寒天培地プレートを取り出します。リンゴジュース寒天培地プレートの作製方法については、付随する原稿のストリーク項に記載されています。リンゴジュースをプレートに分注し、酵母ペーストと共に、プレートが室温になるまで少なくとも1時間待ちます。円形のフィルターペーパーを半分に折り、さらに半分に折ります。紙を直径8～9 cmに切り揃えます。扇形の4分の1の範囲でアコーディオン状に折り畳みま

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

ここでは、ステンドグラスの取り付けプロトコルを提示...

の直立イメージングショウジョウバエ胚

ここでは、アポトーシス細胞のクリアランスのダイナミクスを研究するための効果的な方法を説明...

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

本論文では、直接蛹殻を介して画像細胞挙動への高速走査型共焦点顕微鏡を使用する方法を示します。そのまま蛹ケースを残すことによって、このメソッドを直接学ぶことは困難であるショウジョウバエの発生段階で動的な細胞プロセスの観察と測定を可能にします。...

の蛹ケースを画像化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

このプロトコルは、生きたショウジョウバエの蛹の眼神経上皮をイメージングするための効率的な方法を提供します。この方法は、組織の動きと不均一なトポロジーを補正し、複数のGFPタグ付き接合タンパク質を使用して細胞境界の視覚化を強化し、簡単に組み立てられるイメージングリグを使用します。...

のライブイメージングショウジョウバエ蛹アイ

ここでは、ショウジョウバエの原腸陥入のライブ画像を撮影する手順を説明します。これにより、初期発生に関与する頂端狭窄をより深く理解し、組織構造修飾中の細胞の動きを支配するメカニズムをさらに解析することが可能になりました。...

セル形状変化のイメージングと細胞運動でショウジョウバエ原腸陥入

このプロトコルは、長期のex vivo培養およびショウジョウバエ成虫ディスクのライブイメージングのための詳細な方法を記載しています。それは目のディスクのライブイメージングの10時間の期間内に光受容体の分化と個眼回転を示します。プロトコルは簡単で、高価なセットアップを必要としません。...

長期のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アイディスク

このプロトコルは、ショウジョウバエが変態を受ける中、ショウジョウバエ腹部上皮の細胞配向および組織成長のダイナミクスのイメージングと分析のために設計されています。ここで説明する方法論は、ショウジョウバエまたは他のモデル生物における異なる発達段階、組織、および細胞下構造の研究に適用することができる。...

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

ここでは、ショウジョウバエの卵巣ニッチにおける生殖幹細胞(GSC)の非対称分裂のライブイメージングを行うための詳細なプロトコルを提供します。私たちは、スペクトロソームタンパク質Par-1の緑色蛍光タンパク質(GFP)融合を遍在的に発現するトランスジェニックラインを使用しています。...

雌のショウジョウバエ・メラノガスター生殖幹細胞ニッチの長時間のライブイメージング

ここでは、蛹の完全除去を含む、蛹期の ショウジョウバエ...

蛹摘出後の ショウジョウバエ の蛹の脚の発達の長期ライブイメージング

学ぶショウジョウバエ胚の細胞形状変化のライブ共焦点イメージング法。GFP標識プローブを用いて細胞化過程をリアルタイムで観察し、発生生物学研究に有用な動的解析技術を習得できます。

リビングでのイメージング、細胞の形状の変更ショウジョウバエ胚

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