でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエモデル

この手順の全体的な目的は、成体Drosophila melanogasterにおける学習と記憶を研究することであり、まずハエに運動機能不全があるかどうかを判定します。ハエは負の地走性試験でテストされます。次に、ハエをT字迷路に配置し、好みの照明付きチャンバーへ移動するまでの潜伏時間を記録することで、正の光走性行動を確認します。

正の走光性を持つハエを、光のあるチャンバーとキニンの苦味と結びつけるように条件付けします。最終的に、ハエが嫌悪刺激を光のあるチャンバーとどの程度結びつけているかをテストし、学習および記憶の尺度として測定します。Ola、Xラボへようこそ。

本日は、ショウジョウバエにおける神経変性を研究するために一般的に用いられる2つの行動解析法について実演します。まず、当研究室の学部生であるWil Fredo salaと私が、忌避性光走性の抑制試験を実演し、続いて大学院生のkaiwanが、陰性地走性試験について実演します。ハエは、標準的なコーンミール・アガール・モラセス・酵母培地を用い、25 °C、12時間明暗サイクルの条件下で維持してください。

閉塞当日、処女フライを20匹ずつのグループに分けます。処女フライは、体色が淡いこと、および腹部の下面に暗緑色の斑点があることで識別されます。フライは3日ごとに新しいバイアルに移し替える必要があり、遺伝的背景による差を最小限に抑えるため、兄弟個体を使用してください。

地租性研究では、ジェノタイプまたは処理につき10〜20グループをテストする必要があります。まず、雌雄のハエを10匹ずつのグループに分けます。これらのハエは個別にテストする必要があります。

行動は性別に大きく影響されるため、麻酔後、運動能力に障害がないことを確認するために、少なくとも1時間待ってから次に進んでください。ショウジョウバエの準備が完全に整ったら、2つの空のポリスチレン製バイアルを垂直に重ね、開口部を合わせてください。

底から8cmを計測し、円周に沿って円を描きます。装置の組み立てが完了したら、10匹のハエのグループを下部のバイアルに移します。すぐにバイアルを接合し、テスト前にハエを1分間順応させます。

ハエが落ち着いた後、軽く叩いてバイアルの底に落とし、10秒以内に8 cmの標線より上に登ったハエの数を測定します。この標線を超えた各グループのハエの数を、全個体数に対する割合（%）として記録します。この手順を各グループにつき10回繰り返し、試行の間には1分間の休止時間を設けます。

PSアッセイの6時間前に、雌のハエを水で湿らせたフィルターペーパーを入れたポリスチレン製バイアルに分注します。この工程により、ハエを飢餓状態にし、嫌悪味に対してより敏感にさせます。本アッセイでは、キニーネ溶液を嫌悪刺激として用います。

0.1 Mのストック溶液から、1 µMの作業溶液を調製します。T迷路は、落とし戸のある中央列と、暗室および明室という2つのサイドチャンバーで構成されています。2 mmの印のところで、手動のこぎりを用いて15 mLプラスチック遠心チューブ2本の底部分を切り落とし、両端にコネクタアダプタを取り付け、接続部をパラフィルムで密封します。

1本のチューブをアルミホイルで包み、暗室として使用します。センターカラムの両側に明室と暗室をねじ込み、TMAを組み立てます。中央のトラップドアを閉じた状態で、明室のアダプターに光源を直接接続し、セットアップを完了します。アッセイを行う前に、各グループの10匹のハエをそれぞれ空の15 milliliter遠心チューブに移し、脱走を防ぐため軽く蓋をします。

次に、TMAから暗室をねじって外します。1匹のハエをチューブに移し、すぐに迷路に戻します。室内の照明を消し、赤色灯を点灯させます。

ハエを暗室内で30秒間馴化させた後、明室を照らす光源をゆっくりと点灯させます。点灯後、2つの室を隔てているトラップドアを開けます。10秒以内にハエが明室へ移動した場合、正の走光性を持つとみなされ、訓練可能な状態となります。

このように反応しない場合は視覚系に問題があることを示しており、アッセイから除外する必要があります。正の走光性が確認されたら、ショウジョウバエを暗室へと軽く叩いて戻し、トラップドアを閉じて、32秒間の休息時間の間に消灯します。フィルターペーパーを明室に配置し、キニネ溶液 1 mL をフィルターペーパーにピペッティングして、嫌悪刺激を準備します。

フィルターペーパー全体が忌避刺激で完全に湿っていることを確認します。条件付けを開始するには、トラップドアをゆっくりと開き、照明を点灯させます。ショウジョウバエがキニンの香りがする照明付きチャンバー内へ歩いて入るようにします。

1分後、ショウジョウバエを叩いて暗室に戻します。この手順を9回繰り返し、計10回の条件付け試行を行います。通常、野生型のハエは、3〜5回のトレーニング試行後、トレーニング直後に明室を避けるようになります。

5回のテスト試行を行います。訓練されたハエが10秒以内にチャンバー内の光の中に入らなかった場合、パスとして記録します。5回連続の試行におけるパス率を記録し、指定します。

PC zeroです。トレーニングおよび初期のPC zero記録後、各ショウジョウバエを元の番号が付いた餌入りバイアルに戻し、6時間の間置いておきます。トレーニングから6時間後に、前述の手順に従ってさらに5回のテスト試行を行い、この合格率をPC sixとして短期記憶の指標とします。

負のジオタキシス検定において、8 cmの標識を越えたハエの数をパーセンテージに変換し、これを登攀通過率として提示します。右図に示す10回の試行において、ヒトtauを過剰発現させた10日齢の雄または雌のハエは、左図の同日齢のGFP過剰発現ハエと比較して、顕著な運動機能低下を示しています。

嫌悪光走性抑制アッセイにおけるパフォーマンスは、平均合格率または回避成功試行の割合によって表されます。右側に示すtauを過剰発現させたショウジョウバエは、左側の対照群と比較して、トレーニング直後および6時間後のテスト時のどちらにおいても、光と苦味の関連付けが不十分であることがわかります。この手順の後、形態的な違いに関するさらなる疑問を解決するために、免疫組織化学的解析用のサンプルを採取することができます。このビデオを視聴することで、ショウジョウバエにおける学習と記憶の研究方法について十分に理解することができたはずです。

そして忘れないでください。すべてはあなた次第なのです。