Name: でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶショウジョウバエの運動機能と学習・記憶評価法。負の走性アッセイと嫌光性抑制アッセイを用いて神経変性を解析し、遺伝子変異が行動に与える影響を明らかにする手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

著者らは、T -迷路と動作の部屋を提供するための博士チャールズLuetjeに感謝したいと思います。この作品は、米国心臓協会（YAへ）、神経疾患のための国立研究所と脳卒中グラントR01NS64269（RGZに）、とピュー慈善信託（RGZまで）によってサポートされています。

1。はじめこのビデオでは、我々は運動と神経変性疾患の危険にさらされている学習と記憶機能の測定を示すために、 ショウジョウバエを使って 2つの行動アッセイのデモンストレーションを行います。最初に、我々は、運動行動が負の走地性アッセイを用いて測定することができる方法を紹介します。第二に、我々は嫌悪苦味を有する光を関連付けるために訓練して、メモリ機能を評価するために6時間後に試験されている正走光ハエを使用して、学習と記憶能力を評価します。最後に、我々はこれらの行動アッセイの意義と限界について説明します。 2。機器と試薬<ol><li>仕事を飛ぶ<ul><li>ステレオスコープ（ツァイス） </li><li>ハエをプッシュするための小さなペイントブラシ</li><li> ショウジョウバエ二酸化炭素（CO 2）麻酔器（Geneseesci、株式会社） </li></ul></li><li>負の走地性アッセイ<ul><li> 28.5 × 95 mmのポリスチレンバイアル（キャピトルバイアル、（株）） </li><li>ミニアラームタイマー/ストップウォッチ（VWRインターナショナル） </li><li>シャーピーペン</li><li>接着テープ</li></ul></li><li>嫌悪走光性の抑制アッセイ<ul><li>塩酸キニーネ（シグマアルドリッチ、CAS番号：6119-47-7） </li><li>蒸留水</li><li>重量で正確な希釈用デジタル測定尺度</li><li>クイックディスコネクタ、高密度ポリエチレン（NALGENE VWR商品番号62868〜021） </li><li>光源用クイックディスコネクタアダプタと合わせて閉鎖端から2mLのマークでカット15 ml遠心チューブ（VWRインターナショナル）、 </li><li>チャンバーの内側を覆うフィルター紙の上にキニーネのソリューションをロードするために、シングルチャンネル200μLピペッター</li><li> T -迷路（シンプルな行動システム、図1） </li><li>アルミ箔</li><li>光源（ツァイス） </li><li>赤い光でランプ。 </li><li>ろ紙</li><li>ミニアラームタイマー/ストップウォッチ（VWRインターナショナル） </li></ul></li></ol> 3。ハエの準備<ul><li>ハエは25℃、標準コーンミール寒天、糖蜜、酵母の培地で12時間の明/暗サイクルでCに保持されます。 </li><li>処女のハエが羽化の日の二酸化炭素麻酔下で絶縁されています。老化研究のために、ハエがバイアル当たり20のグループ内に保持され、3日ごとに新鮮なバイアルに移した。遺伝的背景に起因する違いを最小限に抑えるため、老化研究のために、同じ親のクロスから兄弟のハエを使用することが重要です。 </li><li>両方のアッセイでは、ハエがバイアルあたり10個ハエのグループに性欲を刺激すると保持されます。行動に男女差は有意であり、データは6を解釈し、再現するのは難しいかもしれませんが、それは研究で、男性と女性のハエが混在しないことをお勧めします。 </li><li>負の走地性アッセイのために、ハエがバイアルごとに10のグループにソートされ、麻酔後1時間をテストした。これは運動活動に影響を与える可能性があるのでハエが麻酔から完全に回復することが重要です。 </li><li> APSアッセイのために、各グループのハエは、アッセイを実行する前に6時間ろ紙を湿らせた水と空のポリスチレンバイアルに配置されます。これは、ハエがアッセイの前に飢えていると嫌悪味に、より鋭敏になることが保証されます。検定が実行される直前に、10のグループからそれぞれのフライは、エスケープを避けるために、ゆるく蓋をされ、空の15mlの遠心管に配置されます。 </li></ul> 4。負の走地性アッセイ<ul><li>走地性は一般に、同じ遺伝子型や治療の10人（各遺伝子型/治療のために合計100から200ハエ）7の十から二十グループに対して測定されます。 CO 2麻酔器と場所には10の女性または男性のハエのソートグループ別のバイアル内の各グループ。麻酔から回復するハエの少なくとも1つの時間を許可します。 </li><li>二つの空ポリスチレンバイアルが垂直に対向してテープでつながっているように各グループのクライミング装置を、準備します。バイアルの開口部が完全にハエのためにも登山の表面を提供するために、互いに整列していることを確認することが重要です。 </li><li>下のバイアルの場合は、底面上に8cmの垂直距離を測定し、バイアルの全周に円を描くことによって、各バイアルをマーク。 </li><li>慎重にフライの脱出を防止する低バイアルに10ハエのグループを転送します。すぐにしっかりと接触する開口部の近くにバイアルおよびテープと下バイアルをカバー。ハエは、アッセイを行う前に1分間のための新しい設定に慣れることができます。 </li><li>ゆっくりとバイアルの底にハエをタップし、タップした後、10秒で、8 cmのマークの上に登ることができますハエの数を測定する。 </li><li>各試行の間に1分間の休止期間を考慮し、同じグループに10回、このアッセイを繰り返します。 </li><li>として8 cmのマークを渡されたグループごとのハエの数を記録合計ハエの割合。 </li></ul> 5。嫌悪走光性の抑制アッセイ（APSアッセイ） もともとルブールとBuecher（2002）4から適応、このアッセイは、嫌悪刺激（この場合は、キニーネの苦味）の光を関連付けるためにそれらを訓練するためにハエの正の走光性行動を悪用します。トレーニング/コンディショニング段階の後、野生型のハエは、嫌悪の味と明るい領域を関連付けると、それを避けることができるようになります。侵害の学習能力を持つハエはこの関連付けを行うために失敗します。さらに、APSのアッセイはまた、学んだタスクを思い出すの能力をテストするために同じテストを6時間後のコンディショニングに既に訓練されたハエを施すことにより5を飛ぶの短期記憶機能を測定するために使用することができます。 <ol><li>キニーネ溶液を調製<ul><li> 0.1Mストック溶液（50mLの蒸留水で1.98グラム）を作るために蒸留水で塩酸キニーネを溶かす。ストック溶液は小分けに年に-20℃までのために保持することができます</li><li>蒸留水でのストック溶液を希釈することにより、1μMのワーキング溶液を調製。 </li></ul></li><li> T -迷路の準備<ul><li> T -迷路はトラップドアと2つの独立したチャンバー、"暗い"チャンバーと"点灯"チャンバー（図1）と中央の列で構成されています。 </li><li>チャンバーの準備には2つの15mlのプラスチック遠心管に取り、底から2 mLのマークで切断手動で終了して閉じていた。両端にコネクタアダプタを合わせ、パラフィルムで接続をシール。チューブの端のアダプタは、グースネックの光源の入力スロットとして機能します。光源とつのチューブを接続し、このチューブは"明るい"チャンバーになります。 "暗い"室として機能するようにアルミホイルを使用して他のチューブを巻きます。 </li><li>蒸留水や光のチャンバー内で紙と場所をフィルタリングするためにキニーネのソリューションのいずれかの180uLを追加。 </li><li>中央の閉鎖（図1）のトラップドアで、中央の列の両側に点灯し、暗いチャンバーをねじ込んでT -迷路を組み立てる。 </li><li>照明室に光源を挿入します。 </li></ul></li><li>訓練は、嫌悪刺激と走光性を抑制するために飛ぶ<ul><li> T -迷路から緩めて暗室をし、このチャンバ内に単一のフライを転送し、すぐに迷路に戻って暗いチューブをねじ込みます。 </li><li>部屋の照明をオフにし、赤のランプをオンにします。 </li><li>フライは、30秒間暗室に順応し、徐々に明るい部屋を照らす光源をオンにすることができます。徐々に二つの部屋を分けるトラップドアを開きます。 </li><li>フライは10秒以内に点灯室に歩いている場合、それは積極的に走光とみなされ、アッセイのために訓練される状態になります。走光性の障害は、アッセイから除外する必要がある負の走光性と視覚系とハエの問題があることを示します。 </li><li>忌避走光性の抑制（APS）トレーニング、暗室に戻って向光性を示したフライをタップするために、トラップドアを閉じて、光をオフにする。 acclimatizingの30秒を許可する。この時間の間に照明室にキニーネ溶液をろ紙を置く。徐々にトラップドアを開いて、光をオンにします。キニーネコーティング点灯チャンバ内へのハエの散歩を許可します。 1分後、暗室に戻ってフライをタップし、これを9回以上繰り返す。 （通常、野生型は3〜5訓練の試験後に点灯チャンバーを避ける飛ぶ。） </li><li>すぐにトレーニングの後、5つのテストの試験が実施される。各試験の試験では、光が照明室に歩いて訓練されたハエのためにオンになって10秒後に許可する。照明バイアルに歩いて失敗は、"強化を通じて学習タスク"に相当する、"パス"として記録されます。 5年連続の試行の合格率はPC0（0時間後のコンディショニング）として記録し、下の図2に示されています。 </li></ul></li><li>ハエの短期記憶の機能を評価する<ul><li>訓練と初期PC0録音した後、各フライは元の食品のバイアル瓶に戻し入れられ、6時間わき続け​​た。 </li><li>六時間後研修、被験者の前と同じ方法で再び5試験にそれぞれのフライ、そして（失敗）フライは回避（合格）または入る明るいバイアルを回数を記録。この合格率は、短期記憶の指標であるPC6（6時間ポストコンディショニング）、として記録されます。 </li></ul></li></ol> 6。データの解釈と統計解析<ol><li>負の走地性アッセイ<ul><li>このアッセイから生成された生データは、各グループに10秒で8センチの大台にハエの数を表します。割合にこれを変換し、10セッション以上の各群の平均合格率を計算する。 </li><li>データは平均値の標準誤差（SEM）を持つグループごとの平均合格率（遺伝子型、治療法など）としてグラフィカルに表現されます。 </li><li>群間の差して、Student t検定またはANOVAを用いて統計的に有意かどうかであると決定することができます。 </li></ul></li><li>嫌悪走光性の抑制アッセイ<ul><li>このアッセイからの生データは、各フライは5つの連続試験では照明室を回避する回数として表されます。合格率は、合計回の試行の成功回避の試行の割合として計算されます。グループごとに15ハエの最小値は、この方法で平均合格率を計算する。 </li><li>または平均合格率PC6（6時間後のコンディショニング、"メモリ"インジケータ）、それぞれのSEMと、データがグラフィカルに平均合格率PC0（インジケータを"学ぶ"すぐにコンディショニング後）として表されます。 </li><li>学習と記憶のインデックスは、野生型と"遺伝子操作 - 良性"グループ（GFP過剰発現が飛ぶような）適切に両方と群間で比較されています。 </li></ul></li></ol> 7。代表的な結果このビデオの実験では、我々は中枢神経系でハエを過剰発現するヒトのタウの学習と記憶と運動障害を評価していますし、ハエを過剰発現するGFPのものに彼らのパフォーマンスを比較。 ショウジョウバエにヒトのタウの神経過剰発現は、脳8に深刻な空胞化を引き起こすと学習と記憶機能の9の大幅な赤字につながることが示されている。図2Aに示すように、10日齢の雄または雌のショウジョウバエを過剰発現するヒトのタウは、年齢をマッチさせたGFP過剰発現が飛ぶと比較して有意な運動の障害を持っている。さらに、これらのハエは、対照群に比べてPC0合格率によって示されるように苦味を有する光を関連付けるだけでなく、PC6合格率（図2B）の減少によって示されるように、この関連付けを覚えて失敗する失敗しました。この実験では、さらにショウジョウバエモデルは人間の神経変性状態を研究し、ヒトや哺乳動物で観察された行動の表現型の一部をrecapitulatingに使用できることを検証します。 <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。忌避走光性の抑制アッセイのためのT -迷路のセットアップ。A.トラップドアで区切られた濾紙と左側に"暗く"チューブ（箔で覆われた）と並ぶ"点灯"ファルコンチューブに接続されている光源とAPSAの実験のための総合的な実験、、。 B.トレーニングやテストのフェーズにおいて、フライは、暗室内にあり、光が明るい部屋でオンになって後にトラップドアが開きました。 <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。汎神経ドライバでハエを過剰発現するGFPまたはTauを使用して負の走地性とAPSの実験から代表的な結果。A.負の走地性の検定では、10日齢の雄（青列）またはメス（赤の列）を過剰発現するGFPは、タウ過剰発現が飛ぶよりも高い上昇活性を示した飛ぶ。 B. 20日齢の雌では過剰発現するGFPは、タウ過剰発現が飛ぶよりも、よりよい学習（PC0）とメモリ（PC6）の機能を示した飛ぶ。

<ol><li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual Review of Neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li>
<li>Lloyd, T. E. &amp, Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li>
<li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+mutants+of+Drosophila+isolated+by+countercurrent+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58, 1112-1119 (1967).</li>
<li>Le Bourg, E., Buecher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learned+suppression+of+photopositive+tendencies+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Learning+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Learned suppression of photopositive tendencies in Drosophila melanogaster.</a> Animal Learning & Behavior. 30, 330-341 (2002).</li>
<li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Stidd, R., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aversive+phototaxic+suppression%3A+evaluation+of+a+short-term+memory+assay+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Aversive phototaxic suppression: evaluation of a short-term memory assay in Drosophila melanogaster.</a> Genes Brain Behav. 8, 377-389 (2009).</li>
<li>Nilsen, S. P., Chan, Y. -B., Huber, R., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender-selective+patterns+of+aggressive+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12342-12347 (2004).</li>
<li>Leal, S. M., Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evidence+for+GABAergic+regulation+of+specific+behaviors+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evidence for GABAergic regulation of specific behaviors in Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 50, 245-261 (2002).</li>
<li>Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauopathy+in+Drosophila%3A+Neurodegeneration+Without+Neurofibrillary+Tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles.</a> Science. 293, 711-714 (2001).</li>
<li>Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+deficits+upon+TAU+accumulation+in+Drosophila+mushroom+body+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons.</a> Learn Mem. 11, 277-287 (2004).</li>
<li>Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+Suppression+Involving+Behavioral+Mutants+with+Altered+Nerve+Excitability+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 100, 597-614 (1982).</li>
<li>Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+mutants+in+Drosophila+and+their+effects+on+the+structure+and+function+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase mutants in Drosophila and their effects on the structure and function of the central nervous system.</a> J Comp Neurol. 189, 741-774 (1980).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

負の走地性とAPSアッセイの両方は、遺伝的または環境的操作に起因する運動や学習と記憶容量の変化を測定するための堅牢な行動アッセイです。しかし、さらなる最適化を待って、これらのアッセイにはいくつかの欠点があります。 負の走地性の検定では、特定の遺伝子の突然変異はハエで重度の運動機能障害をレンダリングすることができます。このようなケースでは、ハエはほとんど攪拌時に重力に反応して壁を登ることはできません。直接運動を測定する他の行動アッセイでは、より適切な場合があります。これらのアッセイは、麻痺と発作10を測定する立ち直り反射行動、および運動協調の損失を記録する微細運動行動11があります。 APSのアッセイでは、最初の障害は、ランダムに前方に移動することなく、照明室の入り口で停止ハエすることができます。古いハエが一般的にあまり積極的であり、長期間停止して休息する傾向があるので、高齢化が、研究条件のいずれかである場合、これは問題の多くになります。この場合、実験者は、常に効果的ではない動きを、促進するための機械的な刺激を提供しなければならない。第二に、一つは障害が正の走光性の損失からつけられたチャンバーの結果に移動すると主張するかもしれない。強化負が4を削除すると、以前の仕事はハエが光反応性に引き返すことが示されているので、これは、あまりないケースです。第三に、嫌悪刺激との接触の持続期間は、裁判から裁判に異なる場合があります。この変化は通常、キニーネを避けてからハエを防ぐために浸したろ紙を容器の内壁を取り囲むことによって減らすことができます。さらに、実験者は各フライは特に断りのない1分からチャンバーに費やされる時間の量を増やすことによって、ろ紙との接触に十分な時間を過ごすようにすることができます。 要約すると、負の走地性とAPSのアッセイは、行動障害を評価するための高速かつ簡単な方法であり、定量的に運動し、 ショウジョウバエにおける学習と記憶の能力を示している。これらのアッセイは、 ショウジョウバエにおける人間の神経変性条件をモデル化するのに特に有用である。

<table border="1"><tbody><tr><th>材料</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>ポリスチレンバイアル</td><td>キャピトルバイアル、（株） </td><td> 28Fly </td><td> 28.5 × 95 mmのポリスチレンバイアル、材料の品質の重要な、悪いハエが登るにはあまりにも滑りやすい場合。 </td></tr><tr><td>解剖ステレオスコープ</td><td>ツァイス</td><td> 000000-1432-979 </td><td> 2枝雁首ライトガイド（12V/30W） </td></tr><tr><td>塩酸キニーネ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 6119-47-7 </td><td>蒸留水に溶解する。 </td></tr><tr><td>クイックディスコネクタ</td><td> Nalgene（VWR） </td><td> 62868-021 </td><td>高密度ポリエチレン</td></tr><tr><td> T -迷路</td><td>シンプルな行動システム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シングルチャンネル200μLピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td> 022443305 </td><td></td></tr></tbody></table>

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエ</em神経変性の>モデル

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

遺伝的手法の進歩は、モデルシステム1としてショウジョウバエを用いてヒト神経変性疾患に関与する遺伝子の研究が有効になっている。アルツハイマー病、パーキンソン病やハンチントン病を含むこれらの疾患のほとんどは、学習と記憶機能と運動協調2の年齢依存性劣化によって特徴付けられる。ここでは、人間の神経変性に関連した行動の特性のいくつかはハエでrecapitulatedできることを示すために、負の走地性の検定3と嫌悪phototaxic抑制アッセイ（APSアッセイ）4,5、を含む行動アッセイを、使用してください。動揺が運動能力を妨げる可能性の遺伝子または条件を調査するために利用される際に、負の走地性の検定では、ハエの自然な傾向は、重力に逆らって移動する。 APSのアッセイでは、学習と記憶の機能は、正に走でテストされている嫌悪苦味を有する光を関連付ける、従って光に向かって移動するには、このそうでない場合は自然な傾向を避けるために、訓練飛行。 6時間後のトレーニングはメモリ機能を評価するために使用されているこれらの訓練されたハエのテスト。これらのアッセイを用いて、神経変性を発展させるためのあらゆる遺伝的または環境的要因の寄与は、簡単にハエで検討することができます。

測定運動機能、学習、およびメモリ能力のための行動アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;。

遺伝学的手法の進歩により、ショウジョウバエをモデルシステムとして用いたヒトの神経変性疾患に関与する遺伝子の研究が可能になりました1。ほとんどの...

この手順の全体的な目的は、成体Drosophila melanogasterにおける学習と記憶を研究することであり、まずハエに運動機能不全があるかどうかを判定します。ハエは負の地走性試験でテストされます。次に、ハエをT字迷路に配置し、好みの照明付きチャンバーへ移動するまでの潜伏時間を記録することで、正の光走性行動を確認します。正の走光性を持つハエを、光のあるチャンバーとキニンの苦味と結びつけるように条件付けします。最終的に、ハエが嫌悪刺激を光のあるチャンバーとどの程度結びつけているかをテストし、学習および記憶の尺度として測定します。Ola、Xラボへようこそ。本日は、ショウジョウバエにおける神経変性を研究するために一般的に用いられる2つの行動解析法について実演します。まず、当研究室の学部生であるWil Fredo salaと私が、忌避性光走性の抑制試験を実演し、続いて大学院生のkaiwanが、陰性地走性試験について実演します。ハエは、標準的なコーンミール・アガール・モラセス・酵母培地を用い、25 °C、12時間明暗サイクルの条件下で維持してください。閉塞当日、処女フライを20匹ずつのグループに分けます。処女フライは、体色が淡いこと、および腹部の下面に暗緑色の斑点があることで識別されます。フライは3日ごとに新しいバイアルに移し替える必要があり、遺伝的背景による差を最小限に抑えるため、兄弟個体を使用してください。地租性研究では、ジェノタイプまたは処理につき10〜20グループをテストする必要があります。まず、雌雄のハエを10匹ずつのグループに分けます。これらのハエは個別にテストする必要があります。行動は性別に大きく影響されるため、麻酔後、運動能力に障害がないことを確認するために、少なくとも1時間待ってから次に進んでください。ショウジョウバエの準備が完全に整ったら、2つの空のポリスチレン製バイアルを垂直に重ね、開口部を合わせてください。底から8cmを計測し、円周に沿って円を描きます。装置の組み立てが完了したら、10匹のハエのグループを下部のバイアルに移します。すぐにバイアルを接合し、テスト前にハエを1分間順応させます。ハエが落ち着いた後、軽く叩いてバイアルの底に落とし、10秒以内に8 cmの標線より上に登ったハエの数を測定します。この標線を超えた各グループのハエの数を、全個体数に対する割合（%）として記録します。この手順を各グループにつき10回繰り返し、試行の間には1分間の休止時間を設けます。PSアッセイの6時間前に、雌のハエを水で湿らせたフィルターペーパーを入れたポリスチレン製バイアルに分注します。この工程により、ハエを飢餓状態にし、嫌悪味に対してより敏感にさせます。本アッセイでは、キニーネ溶液を嫌悪刺激として用います。0.1 Mのストック溶液から、1 µMの作業溶液を調製します。T迷路は、落とし戸のある中央列と、暗室および明室という2つのサイドチャンバーで構成されています。2 mmの印のところで、手動のこぎりを用いて15 mLプラスチック遠心チューブ2本の底部分を切り落とし、両端にコネクタアダプタを取り付け、接続部をパラフィルムで密封します。1本のチューブをアルミホイルで包み、暗室として使用します。センターカラムの両側に明室と暗室をねじ込み、TMAを組み立てます。中央のトラップドアを閉じた状態で、明室のアダプターに光源を直接接続し、セットアップを完了します。アッセイを行う前に、各グループの10匹のハエをそれぞれ空の15 milliliter遠心チューブに移し、脱走を防ぐため軽く蓋をします。次に、TMAから暗室をねじって外します。1匹のハエをチューブに移し、すぐに迷路に戻します。室内の照明を消し、赤色灯を点灯させます。ハエを暗室内で30秒間馴化させた後、明室を照らす光源をゆっくりと点灯させます。点灯後、2つの室を隔てているトラップドアを開けます。10秒以内にハエが明室へ移動した場合、正の走光性を持つとみなされ、訓練可能な状態となります。このように反応しない場合は視覚系に問題があることを示しており、アッセイから除外する必要があります。正の走光性が確認されたら、ショウジョウバエを暗室へと軽く叩いて戻し、トラップドアを閉じて、32秒間の休息時間の間に消灯します。フィルターペーパーを明室に配置し、キニネ溶液 1 mL をフィルターペーパーにピペッティングして、嫌悪刺激を準備します。フィルターペーパー全体が忌避刺激で完全に湿っていることを確認します。条件付けを開始するには、トラップドアをゆっくりと開き、照明を点灯させます。ショウジョウバエがキニンの香りがする照明付きチャンバー内へ歩いて入るようにします。1分後、ショウジョウバエを叩いて暗室に戻します。この手順を9回繰り返し、計10回の条件付け試行を行います。通常、野生型のハエは、3〜5回のトレーニング試行後、トレーニング直後に明室を避けるようになります。5回のテスト試行を行います。訓練されたハエが10秒以内にチャンバー内の光の中に入らなかった場合、パスとして記録します。5回連続の試行におけるパス率を記録し、指定します。PC zeroです。トレーニングおよび初期のPC zero記録後、各ショウジョウバエを元の番号が付いた餌入りバイアルに戻し、6時間の間置いておきます。トレーニングから6時間後に、前述の手順に従ってさらに5回のテスト試行を行い、この合格率をPC sixとして短期記憶の指標とします。負のジオタキシス検定において、8 cmの標識を越えたハエの数をパーセンテージに変換し、これを登攀通過率として提示します。右図に示す10回の試行において、ヒトtauを過剰発現させた10日齢の雄または雌のハエは、左図の同日齢のGFP過剰発現ハエと比較して、顕著な運動機能低下を示しています。嫌悪光走性抑制アッセイにおけるパフォーマンスは、平均合格率または回避成功試行の割合によって表されます。右側に示すtauを過剰発現させたショウジョウバエは、左側の対照群と比較して、トレーニング直後および6時間後のテスト時のどちらにおいても、光と苦味の関連付けが不十分であることがわかります。この手順の後、形態的な違いに関するさらなる疑問を解決するために、免疫組織化学的解析用のサンプルを採取することができます。このビデオを視聴することで、ショウジョウバエにおける学習と記憶の研究方法について十分に理解することができたはずです。そして忘れないでください。すべてはあなた次第なのです。

assaying-locomotor-learning-memory-deficits-drosophila-models

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ショウジョウバエ成虫連想メモリを測定する方法について説明する。アッセイは、負の強化（電気ショック）を提示した後、メモリを測定することができるように、後でこの情報を呼び出し臭気を関連付けるハエの能力に基づいている。...

ショウジョウバエアダルト嗅覚ショックラーニング

ここでは、ドーパミン作動性に（DA）ニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために設立されている2つのアッセイを記述する...

神経変性表現型を評価する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;クライミングアッセイによりドーパミン作動性ニューロンと脳全体の免疫染色

私たちは、神経変性疾患のモデルとして、Drosophila...

神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析

ショウジョウバエは広く神経変性を研究するためのモデル系として使用されます。このプロトコルは、脳内の空胞の形成によって決定されるように、定量化可能な変性方法を記載しています。それはまた、一つのサンプルとして処理し、切片化対照および実験ハエによる実験手順に影響を最小限に抑えることができます。...

に神経変性を定量化するために、マス組織学<em&gt;ショウジョウバエ</em

このプロトコルは、 求愛条件付けと呼ばれるショウジョウバエ学習および記憶アッセイを記載する。この古典的なアッセイは、非受容性の前処理された女性による性的拒絶反応後の男性の求愛行動の減少に基づく。この自然な形の行動可塑性は、学習、短期記憶、および長期記憶を試験するために使用することができる。...

ショウジョウバエの訓練と記憶の尺度としてのコンディショニング

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。...

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

このステップ バイ ステップのプロトコルは、ハエの数百をホストし、電気モーターで彼らの行動を同期自動マルチ シリンダー システムを用いたショウジョウバエ負の走動作を分析します。試金飛ぶ負走動作同期、デジタル記録および自己設計されていた RflyDetection...

神経変性のショウジョウバエモデル アダルト登山行動を分析するための自動化された迅速な反復負走アッセイ

ここでは、ショウジョウバエの学習と記憶の文脈で、前および/または後のカルシウムを視覚化できるプロトコルを提示する。シナプス的に局在するカルシウムセンサを用いた生体内カルシウムイメージングでは、この種の連想学習の根底にあるシナプス可塑性が決定され得るように、古典的な嗅覚調節パラダイムと組み合わされる。...

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

神経変性と関連した成人 ショウジョウバエ におけるシナプス変性の可視化

本プロトコルは、オープンソースソフトウェアフィジーを使用して手作りのアリーナでのハエの動きを追跡および分析することにより、ショ ウジョウバエ...

ショウジョウバエの自発運動活性をアッセイする簡単な技術

このプロトコルは、従来の哺乳類モデルに代わるものとして、自発運動機能障害の定量化を通じてショウジョウバエの神経毒性を評価するためのハイスループットで費用対効果の高い方法を提供します。これは、高感度で再現性があり、倫理的に有利なモデルを使用して、医薬品化合物、環境剤、または遺伝子組み換えの神経毒性効果を評価することを目的としています。...

神経毒性のリードアウトとしての Drosophila melanogaster の自発運動機能障害の行動解析

学ぶショウジョウバエの運動機能と学習・記憶評価法。負の走性アッセイと嫌光性抑制アッセイを用いて神経変性を解析し、遺伝子変異が行動に与える影響を明らかにする手法です。

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエモデル

さらに動画を探す