酵母のコロニーの埋め込み法
March 22nd, 2011
光および電子顕微鏡用切片可能に酵母のコロニーを埋め込むための方法。このプロトコルは、真菌、コミュニティ内での細胞型の組織を理解するための新しいツールを提供してコロニー内に胞子形成細胞と偽菌糸細胞の分布を決定することができます。
この手順の全体的な目標は、酵母コロニーを埋め込むことです。これは、最初にコロニーとその下にある寒天を寒天プレートから取り除き、それを数滴の溶融寒天の上に置き、さらに溶融空気ですばやく覆うことによって達成されます。次に、コロニーから余分なAERをトリミングして、型に収まるほど小さくします。
次に、AERに埋め込まれたコロニーを固定、染色、脱水し、最後に拍車樹脂を浸透させます。次に、ブロックを金型に入れ、追加の拍車を樹脂で硬化するまでインキュベートし、次に切断します。最終的には、光学顕微鏡または電子顕微鏡を通じて、酵母コロニー内の細胞タイプの分布を示す結果を得ることができます。
走査型電子顕微鏡のような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、コロニーの内部構造を決定できることです。この方法は、コロニー内の細胞タイプの分布など、微生物発生の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、クローチェCACコロニーの構造に関する洞察を提供しましたが、他の微生物にも適用できる可能性があります。
この手法の視覚的なデモンストレーションは、コロニーの取り扱いと埋め込みが書かれたプロトコルから学ぶのが難しい場合があるため、非常に重要です。この方法のアイデアは、2002年に発表した、胞子がコロニーに均等に分布していないことを示唆する遺伝データに触発されました。私たちは、フィン研究室のengelbergによって開発されたコロニーの切片化方法を採用しました。
それでは始めましょう。まず、野生Sビジ酵母をオーガープレート上で30度でインキュベートし、約300のコロニーが存在するまでインキュベートします。細いヘラを使用して、直径1〜2ミリメートルのコロニーをプレートから一度に1つずつ取り除きます。
次に、1ミリリットルのピペットマンチップを使用して、2%寒天を摂氏42度で数滴顕微鏡スライドに置き、AERが固まる前にコロニーを上向きにして寒天に置きます。コロニーにさらに数滴の寒天を置き、寒天が固まるのを待って、コロニーの上部を含むコロニー全体が寒天に包まれていることを確認します。その後のすべてのプロトコルステップでは、かみそりの刃を使用します。
コロニーの周囲にAERをトリミングし、コロニーを含むAERブロックを配置します。2%のパラホルムアルデヒドと2%のグルタルアルデヒドを含む3.5ミリリットルのケイ酸ホウ酸スクリューキャップバイアルでは、乾燥を防ぐために一度に1つずつ固定コロニーを処理する必要がありますが、同じバイアルに最大10個のコロニーを入れることができます。摂氏4度で7日間植民地を離れます。
1週間後、固定剤を取り除き、約1.5ミリリットルの0.15モルナトリウムを使用して、アグリコロニーを2回洗浄します。pH 7.2でカテリングし、各洗浄後に氷上で15分間攪拌せずにインキュベートします。この洗濯に続いてさらに2回。
100ミリモルのリン酸モノカリウム、pH 6.0の塩化マグネシウム10ミリモルからなるX OSバッファー1.5ミリリットルを使用し、各洗浄後に氷上で5分間インキュベートします。次に、同じバイアルを使用して、ここおよびこのプロトコルの書面による部分に記載されているオスミウム処理および洗浄を行う。次に、同じバイアルを使用して、ここに記載されている段階的な脱水と、翌朝早くに添付の書面によるプロトコルを実行します。
ここおよび添付の書面によるプロトコルに示されているように、拍車試薬を調製します。すぐにアグリブロックを100%室温エタノール1.5ミリリットルでそれぞれ10分間5回洗浄します。最後のエタノール洗浄後、アグリブロックが覆われたままになるように、十分な量のエタノールのみを取り除きます。
牧草地のピペットを使用して、約0.5ミリリットルの拍車試薬をバイアルに入れ、ホイール上で低速で15分間回転させます。回転後、室温でバイアルを30分間放置します。次に、溶液を完全に取り除きます。
次に、1.5ミリリットルの拍車試薬を追加して、アグリブロックを覆います。再度、バイアルをホイール上で室温で15分間回転させ、30分間放置します。この洗浄を繰り返します。
さらに3回ステップします。最後の30分後、拍車試薬を取り外し、新しい拍車試薬を追加してブロックを覆います。アグリブロックを室温で4時間放置します。
拍車試薬を交換し、一晩回転させます。翌朝、拍車試薬を交換し、バイアルを翌日まで回転させたままにします。翌朝、番号の付いたシリコン型に拍車試薬をセットして、型底だけを覆います。
次に、アグリブロックを型に入れ、摂氏60度で4時間インキュベートします。4時間後、さらに拍車と試薬を型に注ぎ、摂氏60度で一晩インキュベートします。切片作成のためにブロックを金型から取り外します。
Wild S Visia酵母コロニーのコロニーの中心を通る切片の光顕微鏡写真の例をここに示します。この酵母は、樹木の滲出液から分離された野生型の株です。コロニーは、切片化する前にYNA培地で6日間インキュベートされました。
この画像では、アサイ、偽ハイフィー、卵形酵母は簡単に区別でき、下にある寒天に侵入するコロニーの領域も明らかです。開いた矢印は代表的な浅井の塗りつぶし、矢印は代表的な卵形の栄養細胞、矢印の頭は細長い細胞とsiの鎖を示します。この画像は、酵母SH 1 0 2 0、およびW 3 0 3の実験室株の薄い切片からの電子顕微鏡写真の例です。
コロニーは、切片化する前にYNA培地で6日間インキュベートされました。この画像は、胞子形成細胞を高頻度で含むコロニーの領域を示しています。矢印は胞子壁の二重層構造を示しています。
パートAでは、我々は、パートB.各長方形の胞子関連細胞の頻度は、パートAに示されている15の長方形に対応する15バーとグラフトされているグリッドを持つ4日間のコロニーのセクションを示しています.データは、パートCの4つの独立した4日間のコロニーの平均と標準誤差です。 4つの独立した8日間コロニーの平均誤差と標準誤差が示されています。一度習得すると、このテクニックは2週間で実行でき、丸1日と1〜3時間の日が数回あります。この手順を試行するときは、この手順に従ってブロックが乾かないように、すぐにソリューションを追加することを忘れないでください。
免疫電子顕微鏡などの他の方法を使用して、特定のタンパク質を発現する細胞の発生後の分布を決定することができる可能性があります。この技術により、胞子嚢細胞のパターニングだけでなく、クロースCCIコロニーの疑似菌糸細胞のパターニングも調べることができました。このビデオを見れば、切片化のために酵母コロニーを埋め込む方法についてよく理解できるはずです。
このプロトコルで使用される顕微鏡試薬の多くは、非常に危険であることを忘れないでください。ドラフトを使用し、防護服を着用し、試薬を適切に廃棄することを忘れないでください。さて、これで完了です。
ご覧いただきありがとうございます。あなたの実験に頑張ってください。
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概要
この記事は、酵母コロニーを埋め込む方法を提示し、光学および電子顕微鏡による断面分析を可能にします。このプロトコルは、コロニー内の胞子形成および仮糸体細胞の分析を容易にし、真菌コミュニティにおける細胞タイプの組織化の理解に貢献します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 微生物学
- 細胞生物学
- 真菌生物学
背景
- 酵母コロニーは多様な細胞タイプを示します。
- 細胞分布の理解は真菌コミュニティを研究する上で重要です。
- 従来の方法では細胞組織化に詳細な洞察を提供できない可能性があります。
- この方法は視覚化のための新しいアプローチを提供します。
研究目的
- 酵母コロニー埋め込みのプロトコルを開発すること。
- 細胞タイプ分布の詳細な分析を可能にすること。
- 真菌コミュニティ組織化の理解を深めること。
使用方法
- アガープレートから酵母コロニーの除去。
- コロニーを溶融アガーに埋め込む。
- 余分なアガーを型に合わせるように切り取ります。
- 固定、染色、脱水、樹脂による浸透。
主要な結果
- 顕微鏡分析のための酵母コロニーの成功的な埋め込み。
- 胞子形成および仮糸体細胞の視覚化。
- コロニー内の細胞タイプの詳細な分布分析。
- 真菌コミュニティの組織化に関する新しい洞察。
結論
- この埋め込み方法は顕微鏡分析に効果的です。
- これは酵母コロニー構造を研究するための貴重なツールを提供します。
- 将来の研究は、この方法を基に真菌の相互作用を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding spatial organization of cell types within microbial communities supports target validation in antimicrobial and antifungal discovery. This method enables mechanistic de-risking by revealing phenotypic heterogeneity that may influence drug response and resistance development. It provides predictive confidence for early-stage screening by linking colony architecture to functional subpopulations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing sporulated and pseudohyphal cell distribution within colonies.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of cell type patterning linked to functional states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by preserving spatial relationships of cell types.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent sectioning and imaging of colony interior structures.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through visualization of invading colony regions that model microbial penetration into host tissues.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling structural correlation with phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
Positions the method within early discovery to lead identification by enabling structural phenotyping that informs compound screening decisions.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification via direct imaging of asymmetric cell distribution.
- Screening: Describes assay readiness through production of thick and thin sections compatible with light and electron microscopy.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as frequency mapping of sporulated cells across colony regions for comparative analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by linking invasive colony fronts to tissue penetration models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for structural analysis across multiple fungal strains and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in microbial community behavior.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of colony preparation for multi-user microscopy pipelines.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early phenotypic de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on structural biomarkers of virulence or persistence.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, microscopy, and microbial handling.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microtomes, light and electron microscopes, and resin infiltration systems.
- Cross-team standardization requirements for fixation, staining, and sectioning protocols across microbiology and imaging groups.
- Adaptation considerations across model systems such as biofilm-forming bacteria or other yeast species with varying colony morphology.
- Practical limitations supported by source material including colony size constraints (1-2 mm diameter) and multi-day processing time requiring sterile technique to prevent contamination.
