Name: 酵母のコロニーの埋め込み法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶ酵母コロニーの埋め込み法。光学顕微鏡と電子顕微鏡による細胞型分布の解析を可能にし、真菌コミュニティの組織構造を詳細に理解するための有用な手法です。

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研究は、NIH 1R15GM094770によって資金を供給された。

1。コロニーの単離と固定<ol><li>指定された時間のために寒天培地に300コロニーをインキュベートする（孤立コロニーは直径に1-2 mmにしてください）​​。 </li><li>コロニー（顔のアップ）と狭いヘラを使用して、基礎となる培地を削除します。 </li><li> 2％寒天、42℃、それが固化する前に、寒天の表面に1 mLのpipetmanの先端と、すぐに場所のコロニーを用いて顕微鏡スライド上にCを数滴を置きます。 </li><li> 42 ° Cコロニーに2％の寒天を数滴を配置し、固化することができます。 </li><li>このプロトコルの残りの部分を通じてすべてのステップのための手袋を着用してください</li><li>かみそりの刃を持つブロックをトリムし、4℃で7日間、2％パラホルムアルデヒド/ 2％グルタルアルデヒド固定液を含む3.5mLのホウケイ酸塩のスクリューキャップ付きバイアルの中に置いてください</li></ol> 2。洗浄およびオスミウム処理<ol><li>約1週間後、完全に同じボリュームで5分間、その後、植民地（約1.5mL）をさらに2回をカバーするのに十分な0.15Mカコジル酸ナトリウム（pH7.2）で15分間二回インキュベートすることにより、化学煙フードの下に氷の上の寒天ブロックを洗う1X OSバッファー（100mMのKH 2 PO 4 10mMのMgCl 2、pH6.0）での。 </li><li> [2 mLのOSO 4（2％）+ 2 mLの2倍のOSのバッファ] 1％の同じ体積OSO の追加4バイアル（氷上で）に1時間化学煙フード下の寒天ブロックをカバーするために、同じ金額で2回洗浄10分ごとに1X OSバッファの。 </li><li> 4℃バイアルは一晩おきます° 1X OSのバッファでC。 </li><li>固定し、このステップですべての洗浄は、危険廃棄物として廃棄されています。 OSO 4を含むすべてのピペットは、植物油と3Xすすいだ。 </li></ol> 3。洗浄と脱水<ol><li>翌朝は、パスツールピペットを用いて、10分ごとに冷たい水の上と同じボリュームで氷の上で二回寒天ブロックを洗う。 </li><li> 25％の同じ体積で順次洗浄、10分ごとに50％、75％、95％エタノールで10分間100％エタノールで2回洗浄した。 4℃で一晩おきます〜100％エタノールでCを。 </li><li>このステップのすべての洗浄は、危険廃棄物として廃棄されています。 </li></ol> 4。スパーの準備<ol><li>次の朝は、（可能な限り早期）スパーの試薬を準備するヒュームフードの下で使い捨てのプラスチック製ビーカーに入れ、以下のソリューションを（EMサイエンス）重量を量る。この試薬を使用する後続のすべての作業では、ヒュームフードを使用し続ける。 （ERL 4221溶液5グラム） （DER 736溶液4グラム） （NSAの溶液13グラム） </li><li>これらのソリューションは、（ゆっくり）攪拌棒を使用してフードで20分間混ぜる</li><li> DMAEのソリューションを0.15グラムを追加し、上記のような20分をかき混ぜる。 </li><li>フード内の1〜2時間のためのドガ上記の混合物。 </li></ol> 5。スパーの浸透<ol><li>スパーのが上記の10分ごとに100％の室温のエタノールのと同じボリュームで寒天ブロックを5回洗浄なされるとすぐに。最後にエタノールで洗浄後に残っているエタノールは、ちょうど寒天ブロックを覆うように、パスツールピペットを用いてエタノールを除去します。 </li><li>約スパーの試薬（約0.5mL）を同量を追加し、30分間放置するし、室温で15分間ホイール上にバイアルを回転させると。 30分は完全にパスツールピペットを用いて溶液を除去した後、追加スパーは、寒天ブロック（約1.5 mL）をカバーするもの、室温で15分間ホイールにバイアルを回転させ、30分間放置する。スパーの交換、回転、およびインキュベーションさらに3回繰り返します。 </li><li>最後の30分後、スパーの試薬を除去し、ブロックをカバーするために新鮮なスパーのを追加します。寒天ブロックは4時間室温で放置する。 </li><li>スパーのを交換し、一晩回転する。 </li><li>朝にはスパーのを交換し、翌日になるまで回転しておきます。 </li><li>単に金型の底をカバーするために番号のシリコンモールドで翌朝の場所のスパーの（フィッシャーサイエンティフィック）は、その後、金型に寒天ブロックを追加します。 4時間60℃でインキュベートする</li><li>より多くのスパーのインキュベート、60℃で一晩でカビオフ上部後4時間、、。 </li><li>金型からブロックを削除した後のブロックはまだわずかに柔軟である場合、金型に戻り、追加の2日間インキュベートする</li></ol> 6。セクショニング<ol><li>ライカUltracut Sミクロトームは、光学顕微鏡では0.5μ厚の切片を0.1μ伝送EM用薄切片を切断するために使用された。 </li><li>セクションがカットされたとして、光学顕微鏡の場合は、、それらはのdH 2 Oのドロップで配置され、そして52℃のヒートブロック上で乾燥。乾燥のセクションは、1.0パーセントトルイジンブルー、5-15秒1％ホウ酸ナトリウムの滴で染色した。染色後、切片をすぐに、水の流れの下で洗浄し、乾燥し、マウントメディア（KPL）に覆われており、カバースリップは、試料上密封した。 </li></ol>酵母や他の微生物のパターン形成を測定するの広範な関連性は、以前は1日している。特に注目すべきは、無秩序な社会への相対的な組織的な微生物のコロニーの増加機能があります。 記載されている方法は大きく専門的なコロニー2を埋め込 ​​むための方法の変更であり、そして私達の変更の簡単な説明は、3を発表されている。 野生S.の植民地の中心を通ってセクションの光顕微鏡写真の例出芽酵母の酵母のコロニーを図1に示されています。 ASCI、pseudohyphaeと卵酵母がわかりやすい、基礎となる寒天を侵略植民地の地域にも明らかである。 酵母の実験室株（W303背景）の電子顕微鏡写真の例を図2に示されています。画像は、胞子形成細胞の高周波を含むコロニーの地域からです。 <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。野生酵母のコロニーの光学顕微鏡。この酵母（YPS133）は、ツリーの滲出液4から最近単離された。コロニーは、前の切片にYNA媒体5の6日間インキュベートした。オープン矢印は、塗りつぶされた矢印は、細長い細胞のチェーン（pseudohyphae）とASCIを示す、塗りつぶされた矢印は代表的な卵形の栄養細胞を示す、代表的なASCIを示している。 <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2実験室酵母株の電子顕微鏡。 SH1020（W303背景）のコロニーが3切片の前にYNAの培地上で6日間インキュベートした。画像は、ASCIの高い周波数を持つセクションの領域を示しています。矢印は胞子壁の二層構造を示している。 <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。コロニーにおける胞子形成細胞の分布の定量化：）その長辺に沿って積み重ね15に隣接する矩形を含むグリッドは、コロニーのセクションの画像の中央部に重畳する。その比率を一定に保ちながらグリッドは単に植民地の上部と下部をカバーするために、スケーリングされます。 （B＆C）その長方形の全細胞に対する各長方形の胞子形成細胞の割合は、4日齢（B）、8日齢（C）コロニーからの画像の目視検査によって決定されます。例えば、植民地の上部にある長方形は（"1"とラベルされた）のグラフの左側に対応しています。 4コロニーの平均値が表示され、エラーバーはSTDを表示します。エラー。

<ol><li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+symmetries%3A+regulation+of+Dictyostelium+development+through+chemoattractant+and+morphogen+signal-response%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response.</a> Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).</li>
<li>Palkova, Z., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+within+a+community%3A+benefit+to+yeast+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Life within a community: benefit to yeast long-term survival.</a> FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significances+of+bacterial+colony+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The significances of bacterial colony patterns.</a> Bioessays. 17, 597-597 (1995).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).</li>
<li>Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+stalk-like+structures+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).</li>
<li>Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+analysis+of+Saccharomyces+cerevisiae+stalk-like+structures+reveals+spatial+organization+and+cell+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization.</a> J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).</li>
<li>Piccirillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+pathway+and+alkaline+pH+regulate+pattern+formation+in+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies.</a> Genetics. 184, 707-707 (2010).</li>
<li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).</li>
<li>Piccirillo, S., Honigberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+patterning+and+invasive+growth+in+wild+and+domesticated+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies.</a> Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).</li>
<li>Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environ Microbiol. , (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

提示方法は、コロニーの内部構造を明らかにする。方法は、Sの範囲内のセルのタイプのパターンを決定する上で効果的ですので、別のコロニーの形態を持つ、とも近縁種S. paradoxus 5の出芽酵母株は 、この方法はまた、真菌や他の微生物の広い範囲で動作する可能性があります。 メソッドの成功のための一つの重要なステップは、コロニーの上部を含む全体のコロニーが、、プロトコル全体に寒天で包まれていることを確認することです。コロニーは寒天で完全に覆われているかどうかは、トルイジンブルーと光学顕微鏡と染色のために切削後に決定することができます。染色した切片を光学顕微鏡で見た場合、寒天培地は、包埋媒体よりも若干暗く染色される。脱水工程中の寒天の縮小、コロニー全体を回復するためには、必要があります。なぜなら：1）ステップ1.2のコロニーを確実にカバーするために寒天の4-5滴を追加し、2）ではないで、唯一の両側に寒天をトリム上部と下部、そして必要なだけのそれは、ステップ1.5の金型内に収まるようにトリミング。 <p c...

<table><tbody><tr><td>四酸化オスミウム</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 19152</td><td></td></tr><tr><td>シリコン包埋用モールド</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC 9975029</td><td></td></tr><tr><td>シクロアリファティック・エポキシ樹脂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15004</td><td>ERL 4221</td></tr><tr><td>エポキシ樹脂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 13000</td><td>DER 736</td></tr><tr><td>ノネニルコハク酸無水物</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 19050</td><td>NSA</td></tr><tr><td>2-ジメチルアミノ&amp;#8211;エタノール</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 13300</td><td>DMAE</td></tr><tr><td>封入剤</td><td>KPL Inc</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>回転ホイール</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Pelco 1055</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>Leica Microsystems</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr></tbody></table>

酵母のコロニーの埋め込み法

Yeast Colony Embedding Method

胚の異なる細胞型のパターニングは、後生動物の発生において重要なメカニズムです。このようなコロニーやバイオフィルムのような微生物のコミュニティは、また、細胞の種類のパターンが表示されます。例えば、酵母のS.出芽酵母は 、胞子形成細胞と偽菌糸細胞が一様にコロニーで配布されていません。パターニングとこれらのパターンの根底にある分子機構の機能的重要性はまだよく理解されています。 真菌コロニーの細胞型のパターンを調査に関して、1つの課題は、後生動物の組織とは異なり、コロニー内の細胞は比較的弱く、お互いに接続されていることです。特に、真菌のコロニーはほとんどの組織に見られる細胞外マトリックスの同じ豊富なレベルが含まれていません。ここでは、これらのコロニーの細胞型の内部のパターンを明らかに酵母のコロニーを埋め込むとセクショニングの方法で報告する。方法は、光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡に適した薄切片（0.1μ）のために有用（0.5μ）厚い切片を作製するために使用することができます。これらの細胞の内部構造はEMによって可視化することができますがASCIと偽菌糸の細胞が容易に、光学顕微鏡で卵形の酵母の細胞と区別することができます。 メソッドは、寒天でコロニーを囲むスパーの培地でそれらを浸潤し、切片に基づいています。 1〜2ミリメートルの範囲の直径を持つコロニーは、このプロトコルに適しています。コロニーの内部を可視化することに加えて、メソッドは基になる寒天に侵入するコロニーの領域を可視化できる。

光および電子顕微鏡用切片可能に酵母のコロニーを埋め込むための方法。このプロトコルは、真菌、コミュニティ内での細胞型の組織を理解するための新しいツールを提供してコロ​​ニー内に胞子形成細胞と偽菌糸細胞の分布を決定することができます。

胚における異なる細胞型のパターニングは、後生動物の発生における重要なメカニズムである。コロニーやバイオフィルムなどの微生物コミュニティは……

この手順の全体的な目的は、酵母コロニーを封入することです。まず、寒天プレートからコロニーとその下の寒天を除去し、それを溶融寒天の数滴の上に配置し、さらに溶融寒天で素早く覆うことでこれを達成します。次に、型に収まる十分な小ささにするため、コロニーから余分な溶融寒天を切り落とします。その後、AER埋込コロニーを固定し、染色、脱水を行い、最終的にspurs樹脂で浸透させます。このブロックをspurs樹脂を入れた型に配置して硬化するまでインキュベートし、その後セクショニングを行います。最終的に、光顕微鏡または電子顕微鏡を用いて、酵母コロニー内における細胞型の分布を示す結果を得ることができます。走査型電子顕微鏡などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、コロニーの内部構造を決定できることです。この手法は、コロニー内における細胞型の分布など、微生物の発達分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法によりcroce CACコロニーの構造に関する知見が得られましたが、他の微生物にも適用できる可能性があります。コロニーの取り扱いと包埋は書面によるプロトコルのみでは習得が困難な場合があるため、本手法の視覚的な実演は極めて重要です。本手法の着想は、胞子がコロニー内で均等に分布していないことを示唆した、2002年に発表した遺伝学的データに基づいています。私たちは、FinラボのEngelbergによって開発されたコロニー切片作成法を応用しました。それでは、始めていきましょう。まず、Wild S visi 酵母を 30 °C のアガープレートで、約 300 個のコロニーが形成されるまで培養します。細いスパチュラを用いて、直径 1 ～ 2 mm のコロニーをプレートから 1 つずつ取り出します。次に、1 mLピペットマンのチップを用いて、42°Cに温めた2%アガーを顕微鏡スライドガラス上に数滴滴下し、アガーが固まる前に、速やかにコロニーをアガーの上に（コロニー面を上にして）配置します。さらに数滴のアガーをコロニーの上に滴下し、コロニーの上部を含めた全体がアガーに包まれていることを確認しながら、アガーを凝固させます。以降のすべてのプロトコールステップでは、カミソリを用いて操作を行います。コロニー周囲のAERをトリミングし、コロニーを含むAERブロックを、2%パラホルムアルデヒドおよび2%グルタルアルデヒド固定液を入れた3.5 mLのホウケイ酸ガラス製スクリューキャップバイアルに配置します。乾燥を防ぐため、コロニーは1つずつ処理する必要がありますが、最大10個のコロニーを同一のバイアルに入れることができます。コロニーを4 °Cで7日間静置します。1週間後、固定液を除去し、約1.5 mLの0.15 M 酢酸ナトリウム（pH 7.2）を用いてアグリコロニーを2回洗浄します。各洗浄後、振盪せずに氷上で15分間インキュベートします。この洗浄操作をさらに2回繰り返します。100 mM モノカリウムリン酸および 10 mM 塩化マグネシウムを含む pH 6.0 の 1× OS バッファーを 1.5 mL 使用し、各洗浄後に氷上で5分間インキュベートします。次に、同じバイアルを使用して、本ビデオおよび本プロトコルの記述部分に記載されているオスミウム処理と洗浄を行います。その後、再び同じバイアルを用いて、翌朝早々に、本ビデオおよび付属の記述プロトコルに記載されている段階的な脱水処理を行います。こちらおよび付属の書面プロトコルに従って、spurs試薬を調製します。agriブロックを、室温の100%エタノール1.5 mLを用いて、10分間ずつ5回直ちに洗浄してください。最後のエタノール洗浄後、agriブロックが浸った状態を維持する程度にのみエタノールを除去します。パステールピペットを用いて、spurs試薬を約0.5 millilitersバイアルに入れ、ローテーターを用いて低速で15分間回転させます。回転後、室温で30分間静置します。次に、溶液を完全に除去します。次に、spurs試薬1.5 millilitersを加え、agriブロックを浸します。再び、バイアルをホイールに乗せて室温で15分間回転させ、その後30分間静置します。この洗浄工程を繰り返します。さらに3回繰り返し、ステップを繰り返します。最後の30分が経過した後、spurs試薬を除去し、ブロックが浸るように新しいspurs試薬を加えます。agriブロックを室温で4時間静置してください。spurs試薬を交換し、一晩回転させます。翌朝、spurs試薬を再度交換し、翌日までバイアルを回転させたままにします。さらに翌朝、番号付きのシリコン型にspurs試薬を入れ、型の底がちょうど隠れる量にします。次に、アグリブロックをモールドに入れ、60°Cで4時間インキュベートします。4時間後、さらにスパーと試薬をモールドに満たし、60°Cで一晩インキュベートします。その後、切片作成のためにブロックをモールドから取り出します。Wild S Visia酵母コロニーの中心部を通過する切片の光学顕微鏡写真の例をここに示します。この酵母は、樹木の浸出液から単離された野生型株です。コロニーは切片作成前に、YNA培地で6日間培養されました。この画像では、asai、偽菌糸、および卵形酵母を容易に区別することができ、コロニーが下層のアガーに侵入している領域も明確に分かります。開いた矢印は代表的なasaiを、塗りつぶされた矢印は代表的な卵形栄養細胞を、塗りつぶされた矢頭は伸長した細胞の連鎖およびsiを示しています。この画像は、酵母の実験室株SH 1 0 2 0およびW 3 0 3の薄切片から得られた電子顕微鏡写真の一例であり、背景を示しています。切片作成前に、コロニーをYNA培地で6日間培養しました。画像は、胞子形成細胞が高頻度に含まれるコロニーの領域を示しています。矢印は、胞子壁の二層構造を示しています。パートAでは、4日目のコロニーの断面を示しており、パートBの画像には15個の長方形で構成されるグリッドが重ねられています。各長方形における胞子関連細胞の頻度が、パートAに示された15個の長方形に対応する15本のバーでグラフ化されています。データは、独立した4つの4日目コロニーの平均値および標準誤差です。パートCでは、独立した4つの8日目コロニーの平均値および標準誤差を示しています。この技術を習得すれば、丸1日の作業日と数日間の1〜3時間の作業時間を合わせて、2週間で完了させることができます。この手順を行う際は、ブロックが乾燥しないよう、溶液を速やかに添加することが重要です。免疫電子顕微鏡法などの他の手法を用いることで、発生後の特定のタンパク質を発現している細胞の分布を決定できる可能性があります。この技術により、胞子形成細胞のパターニングだけでなく、croce CCIコロニーにおける偽菌糸細胞のパターニングも観察することができました。このビデオを視聴することで、切片作成のために酵母コロニーを包埋する方法について十分に理解できたはずです。このプロトコルで使用される顕微鏡試薬の多くは、極めて危険なものがあることにご注意ください。必ずドラフトチャンバーを使用し、保護衣を着用し、試薬を適切に廃棄してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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