Name: 気-液クロマトグラフィー（GLC）とあいまって薄層クロマトグラフィー（TLC）によりシロイヌナズナポーラーグリセロ脂質プロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: 学ぶシロイヌナズナポーラーグリセロ脂質プロファイリング法。薄層クロマトグラフィーと気-液クロマトグラフィーを組み合わせて脂肪酸メチルエステルを定量し、野生型と変異体の脂質組成比較を行います。

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この作品は、米国国立科学財団からクリストフベニングの助成金によってサポートされています。

1。脂質の抽出<ol><li>寒天培地上で生育した植物から30mgを4週齢のシロイヌナズナの葉を収穫によって脂質の抽出を開始する培地や土壌を固化し、1.5 mLのポリプロピレン反応チューブに移す。新鮮な葉は、フラッシュは、液体窒素中で凍結し、-80℃で保存することができます</li><li>各サンプルにメタノールから成る溶剤300μL抽出、クロロホルムとギ酸（午前20時10分01秒、V / V / V）を追加します。 5分間（ペイントシェーカーまたは同様のを使用して）を激しく振る。 </li><li> 0.2 Mリン酸（H 3 PO 4）、1 M塩化カリウム（KCl）と渦簡単に150μLを加える。 </li><li> 1分間、室温で13000 × gで遠心する。下のクロロホルム相に溶解した脂質は、TLCプレート上にスポットされます。 </li></ol> 2。薄層クロマトグラフィー（TLC）15 <ol><li>水没0.15 Mの硫酸アンモニウム（（NH 4）2 SO 4）溶液中に30秒のためにストリップを読み込むと20cmx20cmシリカゲルコーティングTLCプレートを、TLCプレートを準備するには、30秒間水没した後、中に少なくとも2日間、プレートを乾燥させる対象となるコンテナ。アクティベーション中にアンモニウムの昇華は、他のグリセロ脂質からの分離のために必要なホスファチジルグリセロールをプロトン化硫酸、背後に残します。 </li><li>実験日に、アクティブには、120℃のオーブンで焼成することによりプレートをTLC 2.5時間° C。 </li><li>室温に活性化プレートを冷却した後、クロマトグラムの原点にプレートを介して直線（プレートの端から1.5 cm）を描画するために鉛筆を使用してください。 </li><li>ドラフトでは、ゆっくりとN 2の遅い流れの下、200μLの黄色いプラスチックのヒントと20μLピペットを使用して、より低いクロロホルム相の脂質抽出物の3 X 20μLを提供します。この目的のために、タイゴンチューブは、N 2タンクのレギュレータに接続されている。直径1cm未満のスポットを保持します。各プレートは、10サンプル（その後のGLC分析が計画された時点）を保持することができます。 </li><li>脂質は、ドラフト内で完全に乾燥したスポットとして、アセトン、トルエン、水（30 mLを7.5 mLの91 mL）で構成される展開溶媒を準備。周囲の相対湿度が高い場合、分離に影響を及ぼす可能性があります。所望の分離を達成するためにこのケースでは水は（7.0 mLの：：30 mLの91 mL）を与えるために軽減する必要があります。 </li><li>と下に向けて、サンプルの端にタンクにプレートを置く室（：H：W = 27.0：：26.5 7.0、CM / CM / CM L）を開発する密閉式TLCに展開溶媒80mlを注ぐ。クランプを使用してタンクを密閉する。溶剤は、プレートを登っれると脂質が分離されます。開発時間が室温で約50分です。 </li><li>溶剤フロントが板の上から1 cmに達したときに、慎重にタンクからプレートを取り外し、約10分間、ドラフト内で完全に乾かしてください。 </li><li> TLCで分離された脂質は、いずれの可逆的定量分析のためにヨウ素で簡単に染色または不可逆的に硫酸またはα-ナフトールで染色することができます。 <ol><li>硫酸炭化：120ヒュームフードと焼くのスプレーガラスのスプレーボトルの水の50％硫酸でプレート℃で15分間（図2A）。 </li><li>糖脂質のためのα-ナフトール染色：120 ° Cで2.4％（w / v）の10％のα-ナフトール（v / v）の硫酸、80％（v / v）エタノールと焼くとプレートをスプレー3-5糖脂質のバンドまでの分は、（図2B）、ピンクや紫色に染色される。過剰治療は、試薬中の硫酸の存在のためにすべての脂質の焦げにつながります。 </li><li>ヨウ素染色：ドラフト内で、ヨウ素の結晶を持つ閉じたTLCタンク（脂質が見えるようになるまでヨウ素蒸気を大気の飽和に至る下部にあるトレイの中）にプレートを置く。長すぎるヨウ素は、共有結合多価不飽和脂肪酸（図2C）を変更する可能性があるため、ヨウ素にプレートを公開しないでください。また、脂質のいずれかの酸化を避けるために、サンプルのレーンに混在のみ標準の車線は、ガラスウールを使用して染色されるべきであるN 2は、個々の標準車線以上の吹くに使用しているヨウ素の結晶をパスツールピペットを差し込ん。 </li></ol></li></ol> 3。脂肪酸アシルメチルエステル（FAME）反応16 <ol><li>かみそりの刃を持つTLCプレートから同定された脂質のスポットを囲むシリカを削除します。脂質含有シリカをこすり取ってテフロン（PTFE）ライニングスクリューキャップ付きガラス管に漏斗を用いてシリカ粉末を転送する。 </li><li>ガラスピペットで各サンプルに無水メタノールで1mLの1N塩酸（HCl）を追加します。 </li><li> 200μLの黄色いプラスチックチップで200μLピペットを用いて内部標準として、各サンプルに200μLピペットを用いて100μL50μgのmL -1のペンタデカン酸（15:0）を追加します。管コントロールとしてメタノール性塩酸でのみpentadecenoic酸としてください。テフロンライニングキャップでしっかりとガラス管を閉じます。 </li><li>インキュベートGL25分間80℃の水浴中でお尻のチューブ。チューブは、溶媒が蒸発しないように密封する必要があります。 </li><li>チューブが冷却した後、精力的に1mLのヘキサンと渦が続く1 mLの0.9％塩化ナトリウムを追加。 3分間1000xgでサンプルを遠心分離します。 </li><li>ドラフトでは、パスツールピペットで試料のヘキサン/上位レイヤを削除し、新しい13x100 mmのガラス管に入れてください。 </li><li>完全に乾燥させることなく、N 2の遅い流れの下でヘキサンを蒸発させる。 </li><li> 60μLヘキサンで生じる脂肪酸アシルメチルエステルのを溶かす。しっかりとオートサンプラバイアルとキャップにサンプルを移す。サンプルは、° C、短期的、-20℃で数日間にて保存することができます。 </li></ol> 4。気-液クロマトグラフィー（GLC）10 <ol><li> GLCを開始する前に、ヘリウム、水素と空気ボンベが満たされていることを確認します。 </li><li>十分なヘキサンを溶媒リザーバーに追加する必要があり、廃棄物の容器を空にする必要があります。脂肪酸アシルメチルエステルの分離のために、マシンにDB - 23カラムを取り付けます。 </li><li>オートサンプラにバイアルを置きます。システムのコンピュータ上でGLC用ケミステーションソフトウェアを起動します。 </li><li> 250℃ヘリウム流量の48.6 mLの分-1の速度と21.93 psiで圧力とC。で入口温度を設定するスプリット比は30.0である：1。 </li><li>オーブンの温度を2分間140℃で最初に設定し、° C 25 ° C min -1の速度で160に送出されます。 -その後160から増加させる° C〜250 ° C ° C min -1の 8の割合で、250で保持℃〜140減少に続いて4分間C ° C 38の速度で℃以上の温度を設定する1。一度の実行では、約21分かかります。 </li><li>水素炎イオン化検出器の温度は270℃です30.0 mLの分-1、30.0 mLの分-1で400 mLの分-1とヘリウムの流量で空気流量の水素流量とC。 </li><li>バイアルおよび実行シーケンステーブルにサンプル名の数を入力してください。バイアルあたり2μLのサンプルを注入して10μL注入器を設定します。 </li><li>楽器の準備が整うと、実行シーケンスを開始する。 </li></ol> 5。代表的な結果： 4週齢のシロイヌナズナの苗からTLCで区切られた脂質の不可逆的な染色の例を図2に示されています。硫酸ステンド脂質（図2A）は黒焦げと褐色の斑点として表示されます。 α-ナフトールは、他の極性脂質が（図2B）、黄色の染色ながら、α-ナフトールはピンク紫色を運ぶで染色等の糖脂質をSQDG、そのようなMGDG、DGDGとして糖脂質を染色することが好ましい。ヨード染色では、可逆的であると脂質のヨウ素が蒸発する（図2C）のような短い時間の経過とともに消え黄色がかった色を与えます。未染色の脂質は脂質の分解を低減することが望ましいですが一時的にヨウ素染色された脂質をGLC分析に供することができる。 が正常に完了した場合、異なる脂肪酸アシルメチルエステルを表す特徴的な信号は、GLC（図3）後に観察されます。短い炭素鎖と少ない二重結合を有する脂肪酸アシルメチルエステルは、DB - 23カラムを使用してより短い保持時間を持っている。脂肪酸アシルメチルエステルのプロファイリングは、変更された脂質組成を有する変異体を識別するための敏感なツールです。図4では、MGDG18：3脂肪酸のモル比が野生型18に比べてtgd4 - 1変異体で減少している。すべての脂質クラスのモルワン脂質クラスの脂肪酸アシルメチルエステルのモル数を分割することによって、それぞれの脂質のモル比が計算されます。たとえば、MGDGのモル比を計算する： （MGDG）モル％=Σ[のFAME（MGDG）] /Σ[のFAME（合計）] × 100％ 野生型と変異型の両方からの各脂質クラスの結果のモル比を比較することができます。例えば、tgd4 - 1変異体は、MGDGとPGの相対量を増加させたがDGDGとPE（図5）18の量を減少している。 <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> シロイヌナズナ実生を用いて極性脂質の分析の図1。フローチャート。総脂質は、4週齢のシロイヌナズナの苗から抽出し、TLCによって分離される。分離された脂質をGLC分析に続いてエステル交換のためのTLCプレートから掻きすることができます。 <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。TLCプレート上に脂質の分離。 35 mgの脂質抽出物（新鮮重量）は、野生型の実生は、TLCにより分離し、硫酸（）、α-ナフトール（B）またはヨウ素蒸気（C）で染色されています。三繰り返しは、それぞれの染色法で示されています。 DGDG、digalactosyldiacylglycerol、MGDG、monogalactosyldiacylglycerol、PC、ホスファチジルコリン、PE、ホスファチジルエタノールアミン、PG、phosphatidylglyceROL、PI、ホスファチジルイノシトール、SQDG、スルホキノボシルジアシルグリセロール。 <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 野生型のMGDGから派生した脂肪酸メチルエステル（FAME）の図3。GLC分析。のFAMEが30メートルキャピラリーカラムで分離し、水素炎イオン化によって検出されます。ペンタデカン酸（15:0）は内部標準として使用されます。 <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。野生型Col2に（白のカラム）とtgd4 - 1変異体（黒色カラム）でMGDGの脂肪酸プロフィール。脂肪酸は、二重結合の数が続く炭素の数として表現さ​​れています。三繰り返しは平均され、標準偏差が表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。野生型Col2に（白のカラム）の極性脂質の組成とtgd4 - 1変異体（黒色カラム）。三繰り返しは平均され、標準偏差をエラーバーで示されている。

<ol><li>Ajjawi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+reverse+genetics+in+Arabidopsis%3A+case+studies+from+the+Chloroplast+2010+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale reverse genetics in Arabidopsis: case studies from the Chloroplast 2010 Project.</a> Plant Physiol. 152, 529-529 (2010).</li>
<li>Andersson, M. X., Kjellberg, J. M., Sandelius, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+cytosolic+lipases+in+converting+phosphatidyl+choline+to+substrate+for+galactolipid+synthesis+in+the+chloroplast+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The involvement of cytosolic lipases in converting phosphatidyl choline to substrate for galactolipid synthesis in the chloroplast envelope.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1684, 46-46 (2004).</li>
<li>Awai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphatidic+acid-binding+protein+of+the+chloroplast+inner+envelope+membrane+involved+in+lipid+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A phosphatidic acid-binding protein of the chloroplast inner envelope membrane involved in lipid trafficking.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, e10817-e10817 (2006).</li>
<li>Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+lipid+transport+involved+in+organelle+biogenesis+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of lipid transport involved in organelle biogenesis in plant cells.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 71-71 (2009).</li>
<li>Browse, J., McCourt, P. J., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+leaf+lipids+determined+after+combined+digestion+and+fatty+acid+methyl+ester+formation+from+fresh+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of leaf lipids determined after combined digestion and fatty acid methyl ester formation from fresh tissue.</a> Anal. Biochem. 152, 141-141 (1986).</li>
<li>Dormann, P., Balbo, I., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+galactolipid+biosynthesis+and+lipid+trafficking+mediated+by+DGD1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis galactolipid biosynthesis and lipid trafficking mediated by DGD1.</a> Science. 284, 2181-2181 (1999).</li>
<li>Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+photosystem+II+at+2.9-A+resolution+and+the+role+of+quinones%2C+lipids%2C+channels+and+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial photosystem II at 2.9-A resolution and the role of quinones, lipids, channels and chloride.</a> 16, 334-334 (2009).</li>
<li>Hartel, H., Dormann, P., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGD1-independent+biosynthesis+of+extraplastidic+galactolipids+after+phosphate+deprivation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DGD1-independent biosynthesis of extraplastidic galactolipids after phosphate deprivation in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 10649-10649 (2000).</li>
<li>James, A. T., MARTIN, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-liquid+partition+chromatography%3B+the+separation+and+micro-estimation+of+volatile+fatty+acids+from+formic+acid+to+dodecanoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Gas-liquid partition chromatography; the separation and micro-estimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid.</a> Biochem. J. 50, 679-679 (1952).</li>
<li>Jordan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution.</a> Nature. 411, 909-909 (2001).</li>
<li>Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-B+monogalactosyldiacylglycerol+synthases+are+involved+in+phosphate+starvation-induced+lipid+remodeling%2C+and+are+crucial+for+low-phosphate+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Type-B monogalactosyldiacylglycerol synthases are involved in phosphate starvation-induced lipid remodeling, and are crucial for low-phosphate adaptation.</a> Plant J. 57, 322-322 (2009).</li>
<li>Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+ATPase+protein+of+Arabidopsis%2C+TGD3%2C+involved+in+chloroplast+lipid+import%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A small ATPase protein of Arabidopsis, TGD3, involved in chloroplast lipid import.</a> J. Biol. Chem. 282, 35945-35945 (2007).</li>
<li>Ohlrogge, J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid biosynthesis.</a> Plant Cell. 7, 957-957 (1995).</li>
<li>Stahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography%3B+methods%2C+influencing+factors+and+an+example+of+its+use%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazie%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography; methods, influencing factors and an example of its use.</a> Pharmazie. 11, 633-633 (1956).</li>
<li>Stoffel, W., INSULL, W., AHRENS, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-liquid+chromatography+of+highly+unsaturated+fatty+acid+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Gas-liquid chromatography of highly unsaturated fatty acid methyl esters.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 99, 238-238 (1958).</li>
<li>Welti, R., Wang, X., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+scan+modes+for+plant+chloroplast+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry scan modes for plant chloroplast lipids.</a> Anal. Biochem. 314, 149-149 (2003).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+trafficking+between+the+endoplasmic+reticulum+and+the+plastid+in+Arabidopsis+requires+the+extraplastidic+TGD4+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid trafficking between the endoplasmic reticulum and the plastid in Arabidopsis requires the extraplastidic TGD4 protein.</a> Plant Cell. 20, 2190-2190 (2008).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+TGD1+chloroplast+envelope+protein+affects+phosphatidate+metabolism+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Mutation of the TGD1 chloroplast envelope protein affects phosphatidate metabolism in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 17, 3094-3094 (2005).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permease-like+protein+involved+in+ER+to+thylakoid+lipid+transfer+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A permease-like protein involved in ER to thylakoid lipid transfer in Arabidopsis.</a> EMBO J. 22, 2370-2370 (2003).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

GLCと相まってTLCは、植物の極性脂質の定量分析のための堅牢かつ迅速なツールを提供しています。脂質組成のわずかな変化を識別することができるので、この方法は、極性脂質の代謝経路1,20で損なわ変異の大規模スクリーニングのために使用されています。この方法は、広く基質として極性脂質を利用する酵素の活動を監視するために使用されます。2,6,7 葉のほかに、そのような根や種子や葉緑体やミトコンドリアなどの細胞内の画のような他の植物組織の脂質組成物はまた、同じ方法で決定することができます。 ここで使用される溶媒系（アセトン、トルエン、水）は、植物の糖脂質とリン脂質の分離に最適化されています。 tetragalactosyldiacylglycerolがPCで実行中しかし、tgd1、2,3,4変異体と分離された葉緑体で、TGDGはPEと一緒に動作します。この場合、クロロホルム、メタノール、酢酸および水（85：20：10：4、V / V / v / v）を溶媒系は​​13を使用されています。時々 、二つの異なる溶媒系を用いて二次元TLCは、さらに別の糖脂質とリン脂質19に実行されます。さらに、植物組織は、直接TLC 5の初期分離することなく、総脂肪酸のプロファイルを決定するためにGLCが続くFAMEの反応に供することができる。実証TLC - GLCのシステムの横に、脂質プロファイリングに使用する別の方法は、直接エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法17に基づいています。この方法では抽出物中の脂質の初期のクロマトグラフィー分離は省略されます。しかし、この方法では、ラボや変異体スクリーニングのためのルーチン分析のためのそれはさほど便利で高価な設備と経験豊富な人材を、必要になります。

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-ナフトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>3N 塩酸メタノール溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33050-U</td><td>メタノールで1Nに希釈</td></tr><tr><td>Si250-PA TLCプレート</td><td>JT Baker</td><td>7003-04</td><td>吸着剤付き</td></tr><tr><td>TLCチャンバー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z266000</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップチューブ</td><td>VWR international</td><td>53283-800</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップ</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td></td></tr><tr><td>PTFEディスク</td><td>Sun Sri</td><td>200 608</td><td></td></tr><tr><td>GLCシステム</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP6890</td><td></td></tr><tr><td>DB-23カラム</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>122-2332</td><td></td></tr><tr><td>GLCバイアル</td><td>Sun Sri</td><td>500 132</td><td></td></tr><tr><td>GLCバイアル用キャップ</td><td>Sun Sri</td><td>201 828</td><td></td></tr><tr><td>Chemstationソフトウェア</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2070AA</td><td></td></tr></tbody></table>

気-液クロマトグラフィー（glc）とあいまって薄層クロマトグラフィー（tlc）によりシロイヌナズナポーラーグリセロ脂質プロファイリング

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

環境からの生物学的膜を別のセル。このようなホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミン、細胞とその周囲との間の化学交換のための両方の境界とのインタフェースとして機能するフォームの二分子膜として多細胞の植物や動物、グリセロ脂質、単一の細胞から。動物とは異なり、植物細胞は光合成のための特別な細胞小器官、葉緑体を持っている。 monogalactosyldiacylglycerol（MGDG）、digalactosyldiacylglycerol（DGDG）、スルホキノボシルジアシルグリセロール（SQDG）4：葉緑体の複雑な膜システムは、すなわちユニークなグリセロ脂質、リンを欠く糖脂質が含まれています。これらの脂質の役割は、単に構造を超えています。これらの糖脂質と他のグリセロ脂質は光合成8,11におけるグリセロ脂質の関与を示す光化学系IとIIの結晶構造で発見された。リン酸飢餓時には、DGDGは、リン脂質9,12の損失を補うためにextraplastidic膜に転送されます。 多くのこれらの脂質の生合成と機能の我々の知る限りは、 シロイヌナズナの 14に遺伝学的および生化学的研究の組み合わせから導出されています。これらの調査の間に、極性脂質の分析のための簡単​​な手順では、脂質の変異体のスクリーニングと解析のために不可欠になっており、詳細に概説する。葉の脂質抽出物は、最初の薄層クロマトグラフィー（TLC）によって分離され、グリセロ脂質は、ヨウ素蒸気に可逆的に染色されています。個々の脂質は、TLCプレートから掻きと水素炎イオン化検出器（FID - GLC）（図1）と結合した気 - 液クロマトグラフィーによって分析されている脂肪酸アシルメチルエステル（のFAME）、に変換されます。このメソッドは、変異体スクリーニングのための信頼できるツールであることが証明されています。たとえば、tgd1、2,3,4小胞体からプラスチド脂質輸送変異体は、異常なgalactoglycerolipidの蓄積に基づいて発見されました。trigalactosyldiacylglycerol（TGDG）と18時03分の相対量の減少（炭素：ダブル債）膜脂質3,13,18,20の脂肪酸アシル基。また、このメソッドは、基板6として脂質を用いてタンパク質の酵素活性を決定するための適用可能です。

極性脂質抽出物の組成と個々のグリセロ脂質の脂肪酸組成は、シンプルで堅牢な脂質プロファイリング実験で決定されます。この目的のために、グリセロ脂質は薄層クロマトグラフィーによって分離されているとそのアシル基のメチル基移転を行った。脂肪酸アシルメチルエステルをガス - 液体クロマトグラフィーによって定量化されています。

気-液クロマトグラフィー（GLC）とあいまって薄層クロマトグラフィー（TLC）によりシロイヌナズナポーラーグリセロ脂質プロファイリング

生体膜は細胞を環境から隔てています。単細胞生物から多細胞の植物や動物に至るまで、...などのグリセロ脂質は、

この手順の全体的な目的は、シロイヌナズナの苗の極性脂質組成を決定することです。まず苗から脂質を抽出し、次いで薄層クロマトグラフィーによって極性脂質を分離することでこれを達成します。次に、薄層プレートから特定の脂質スポットを分離し、エステル交換反応によって脂肪酸メチルエステルに変換します。本手順の最終ステップでは、気液クロマトグラフィーを用いて脂肪酸メチルエステルの組成を定量します。最終的に、野生型および変異体における各極性脂質のモル比および脂肪酸プロファイルを示す結果を得ることができます。こんにちは、クリストフ・ベニングです。多くの皆様から、極性脂質の定量分析方法についてお問い合わせをいただいてきました。私たちは、モデル植物である Arabidopsis thaliana（シロイヌナズナ）の変異体を大規模にスクリーニングする際に非常に有効であった、シンプルで堅牢な手法を用いています。質量分析に基づく脂質プロファイリングなどの他の優れた手法は、高価な装置と多くの経験およびトレーニングを必要とします。本研究では、変異株の分離後、簡便な薄層クロマトグラフィーと脂肪酸メチルエステルの定量化を組み合わせた2段階の手順を用いています。通常、より定量的な分析が必要とされます。これは、薄層プレートから膜脂質を単離し、脂肪酸メチルエステルを調製して、液体ガスクロマトグラフィーで定量することで行われます。この手法は再現性が高く、結果はより複雑な質量分析ベースの技術と比較可能なレベルであり、本手順が有効であることを示しています。私の研究室の大学院生であるZen Wangが実演します。寒天固化培地または土壌で栽培した4週齢のArabidopsisの葉を30 mg回収し、脂質抽出を開始してください。回収した葉を1.5 mLのプロピレン製反応チューブに移します。メタノール、クロロホルム、およびギ酸で構成される抽出溶媒 300 µL を各サンプルに加えます。サンプルを5分間激しく振とうします。次に、0.2 M リン酸と 1 M 塩化カリウムを 150 µL ずつ加え、ボルテックスします。サンプルを13,000 ×gで1分間、短時間遠心分離します。室温にて、下層のクロロホルム相に溶解した脂質を薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートにスポットします。TLCプレートを準備するために、ローディングストリップ付きの20 × 20 cmのシリカゲルコーティングTLCプレートを0.15 M硫酸アンモニウム溶液に浸します。30秒間浸漬させた後、蓋付きの容器に入れてプレートを少なくとも2日間乾燥させます。活性化の過程で、アンモニウムが昇華して硫酸が残り、これがリン酸基とグリセロールをプロトン化することで、他のグリセロール脂質からの分離が可能になります。実験当日に、TLCプレートを120 °Cのオーブンで2時間半加熱し、活性化させます。活性化させたプレートを室温まで冷却した後、鉛筆を使用してクロマトグラムの原点に直線を描きます。ドラフトチャンバー内で、窒素タンクのレギュレーターに接続したタイゴンチューブを用いて窒素ガスを流し、200 µL用イエロープラスチックチップを装着した20 µLピペットを用いて、下層のクロロホルム相から脂質抽出液を20 µLずつ3回、緩やかな窒素気流の下でプレートに滴下します。スポットの直径を1 cm未満に抑えるため、20 µLピペットを使用します。脂質スポットが完全に乾燥するまで、各プレートに最大10検体を保持することができます。ドラフトチャンバー内で、アセトン、トルエン、および水からなる展開溶媒を調製します。密閉可能なTLC展開槽に展開溶媒を80 milliliters注ぎ、プレートを槽に入れます。サンプル端を下に向けた状態でタンクを密閉します。クランプを使用して、溶媒をプレート上に上昇させ、脂質を分離させます。室温での展開時間は約50分です。溶媒前線がプレート上端から1 cmの位置まで到達したら、タンクから慎重にプレートを取り出し、ドラフトチャンバー内で10分間完全に乾燥させます。TLCで分離した脂質は、定量分析のためにヨウ素を用いて短時間可逆的に染色するか、硫酸またはalpha natalを用いて不可逆的に染色することができます。不可逆的に染色する場合、硫酸による炭化染色を行います。ドラフトチャンバー内で、ガラス製スプレーボトルを用いてプレートに50%硫酸水溶液をスプレーし、120°Cで15分間加熱します。逆に、糖脂質のα-ナフトール染色の場合は、10% v/v硫酸および80% v/vエタノールに溶解した2.4% w/v α-ナフトール溶液をプレートにスプレーします。糖脂質のスポットがピンク色または紫色に染まるまで、プレートを120°Cで3〜5分間加熱してください。ヨウ素染色を行います。ドラフトチャンバー内で、タンクの底にヨウ素結晶を入れたトレーを配置し、内部をヨウ素蒸気で飽和させた密閉LCタンクを準備します。TLCプレートをタンクに入れ、脂質が可視化されるまでヨウ素に曝露させます。ヨウ素が共有結合する可能性があるため、長時間曝露させないでください。多価不飽和脂肪酸を修飾します。カミソリを用いて、TLCプレート上の同定された脂質スポット周囲のシリカを除去し、脂質を含むシリカを掻き取ります。漏斗を使用して、シリカ粉末をテフロンライナー付きスクリューキャップ付きガラスチューブに転移させます。ガラスピペットを用いて、各サンプルに無水メタノール中の塩酸 1 mL を加えます。次に、200 µL 用ピペットと 200 µL の黄色プラスチックチップを使用し、内部標準物質として 50 µg/mL のペンデカン酸 100 µL を各サンプルに加えます。また、コントロールとして、塩酸メタノール中にペンデカン酸のみを含むチューブを調製します。テフロンライナー付きキャップでガラスチューブをしっかりと密閉します。ガラスチューブを80 °Cのウォーターバスで25分間インキュベートします。チューブが冷却された後に溶媒が蒸発しないよう、確実に密封してください。0.9%塩化ナトリウムを1 mL加え、続いてヘキサンを1 mL加え、激しくボルテックスした後、サンプルを1000 ×gで3分間遠心分離します。遠心分離後、ドラフト内でパステールピペットを用いてサンプルの上層にあるヘキサン層を除去し、新しい13 × 100 mmガラスチューブに移します。窒素気流下でヘキサンを緩やかに蒸発させ、完全に乾かさない状態で、得られた脂肪酸メチルエステルを60 µLのヘキサンに溶解させます。サンプルをオートサンプラーバイアルに移し、しっかりとキャップを締めます。サンプルは短期間であれば4°Cで、GLCを開始する数日前であれば-20°Cで保存可能です。ヘリウム、水素、および空気のボンベに十分な量が充填されていることを確認してください。脂肪酸メチルエステルの分離のため、溶媒リザーバーに十分なヘキサンを加え、廃液容器を空にしておく必要があります。装置にDB-23カラムを取り付けます。バイアルをオートサンプラーにセットします。システムコンピュータでGC用のChemStationソフトウェアを起動します。注入口温度を250 °Cに設定し、ヘリウム流量を48.6 mL/min、圧力を21.93 PSIに設定します。スプリット比は30:1です。オーブン温度は、最初に140 °Cで2分間に設定し、その後25 °C/minの速度で160 °Cまで昇温させます。次に、160 °Cから250 °Cまで8 °C/minの速度で昇温させ、250 °Cで4分間保持した後、38 °C/minの速度で140 °Cまで降温させます。この温度プログラムを用いると、1回の分析に約21分かかります。水素流量を30 milliliters per minuteとし、水素炎イオン化検出器の温度は270 degrees Celsiusに設定します。空気流量は400 milliliters per minute、ヘリウム流量は30 milliliters per minuteに設定します。ランシーケンス表にバイアル数とサンプル名を入力します。10 µLインジェクターを設定し、1バイアルあたり2 µLのサンプルを注入するようにします。装置の準備が整ったら、ランシーケンスを開始します。生後4週間のArabidopsis苗からTLCで分離した脂質の染色の例をここに示します。硫酸で染色された脂質は炭化し、茶色のスポットとして現れます。M-G-D-G-D-G-D-GやSQ dgなどの糖脂質の染色には、Alpha natalが好まれます。α-ナフトールで染色した糖脂質は桃紫色を呈し、その他の極性脂質は黄色に染色されます。ヨウ素染色による染色は可逆的であり、脂質は黄色になりますが、ヨウ素が蒸発するにつれて短時間で消失します。簡潔に述べると、ヨウ素染色した脂質をGLC分析に供することは可能ですが、脂質の分解を抑えるためには、可能であれば未染色の脂質を用いることが好ましいです。GLC後には、異なる脂肪酸メチルエステルを表す固有のシグナルが観察されます。炭素鎖が短く、二重結合が少ない脂肪酸メチルエステルの保持時間は短くなります。DB 23カラムを使用してください。脂肪酸メチルエステルのプロファイリングは、脂質組成が変化した変異体を特定するための感度の高いツールです。野生型と比較して、TGD 4-1変異体ではMGDG 18の3つの脂肪酸モル比が減少しています。これは、1つの脂質クラスの脂肪酸メチルエステルのモル数を、全脂質クラスの脂肪酸メチルエステルの総モル数で割ることで算出されます。すべての脂質クラスについて各脂質のモル比を計算することで、野生型と変異体それぞれの各脂質クラスから得られたモル比を比較することができます。TGD 4-1変異体では、MGDGおよびPGの相対量が増加し、DGDGおよびNPEの量が減少していることが明らかです。薄層クロマトグラフィーを用いることで、多くのサンプルを並行して解析でき、脂質プロファイルの主要な相違を視覚的に確認することが可能です。さらに、TLCを確認することで、脂質の合成、ひいては脂質プロファイルに必要となる多くの酵素や遺伝子を実質的に調べていることになります。このビデオを視聴することで、TOCおよびGOCを用いて極性脂質の組成を分析する方法について十分な理解が得られたはずです。ビデオをご視聴いただきありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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