Name: マウスの膀胱壁インジェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 48 s
Description: 学ぶマウスの膀胱壁インジェクション技術。腹部切開と壁内針挿入により細胞を正確に局所注入し、膀胱幹細胞とがん生物学研究の基礎となる。安定したブレブ形成で成功を確認できる。

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我々は感謝NIDDKからスタンフォード小児研究基金とK08DK087895 - 01からのパイロット助成金の支援を認める。

1。マウスの膀胱壁インジェクションマウス系統、年齢、および性別の選択は、実験的なニーズによって決定されます。これは老化の前に免疫学的成熟度のウィンドウであるため、我々は、生後8〜12週間の間にマウスを使用してください。一般的なガイドラインとして、マウスはストレス誘発性の交絡因子を避けるために、実験操作の前に少なくとも一週間に到着してください。 <ol><li>石鹸と水で手術台の表面を清掃してください。 </li><li>慈徳のワイプまたは消毒ワイプで手術台の表面を拭いてください。 </li><li>手術に使用する前にきれいな手術器具をオートクレーブ。 </li><li>さらに、使用直前に熱いビーズ滅菌器で手術器具を殺菌するだけでなく、手術中に動物の間で。 </li><li>最初の使用前と最終的な外科手術の最後に無水アルコールで繰り返し吸引と注射で100μLハミルトンシリンジと29または30ゲージ（1 / 2インチ長い）針を清掃してください。 </li><li>それぞれの動物の間でリン酸緩衝生理食塩水、滅菌とハミルトンシリンジを洗浄し、すすいでください。 </li><li> 2〜5パーセントの間にイソフルランセットを使用して、イソフルラン誘導チャンバ内にそれらを置くことによってマウスを麻酔。 </li><li>全身麻酔が達成されると、正常な体温を維持するためにウォームなパッドの下で仰臥位での室と場所からマウスを取り外します。 </li><li> （適切な麻酔を維持するために、必要に応じて1〜3パーセントから滴定）イソフルラン気化を含むノズルで、動物の鼻を配置することにより、メンテナンスの麻酔を達成する。 </li><li>バリカンで腹部の皮膚を剃る。 </li><li>手術中の糞便汚染を防ぐために、肛門をカバーするために使い捨て、滅菌外科用ドレープを使用してください。 </li><li>手術野（下腹部）をカバーする2番目の使い捨て、滅菌外科用ドレープを使用してください。 </li><li> Betadineに浸したガーゼの3つの部分で準備腹部。このステップを3回繰り返します。 </li><li>拡大のための解剖顕微鏡を使って、ハサミで下の正中腹部切開を行います。 </li><li>膀胱を公開。 </li><li>膀胱がいっぱいになっている場合、部分的にドームでの穏やかな下方圧力によってそれを解凍。 </li><li>上を向いて針のベベルと膀胱のドーム（壁内注射）の壁に、29または30ゲージの注射針と注射器を用いて、試料溶液を（最大50μL）注入。 </li><li>膀胱壁に試料溶液を注入する注射器のプランジャーを押してください。極めて限局したブレブは、膀胱壁への細胞の正常な注射の指示です。 </li><li> 、シリンジを取り外します創傷クリップで切開を閉じて、マウスが温暖化のパッドに回復することができます。 </li></ol> 2。代表的な結果： 漏れ流体をしないとサイズで安定したまま極めて限局したブレブは、膀胱壁（図1）への細胞の成功注入の指示です。組織学的分析は、膀胱壁に注入された細胞の存在を確認するために実行することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2523/2523fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。説明のためにインドのインクを使用して成功した膀胱壁のインジェクションの例。 <img src="/files/ftp_upload/2523/2523fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2実験手順の模式図。

<ol><li>Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Metastatic+Variants+from+Human+Transitional+Cell+Carcinoma+Passaged+by+Orthotopic+Implantation+in+Athymic+Nude+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice.</a> The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).</li>
<li>Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soy+Phytochemicals+Prevent+Orthotopic+Growth+and+Metastasis+of+Bladder+Cancer+in+Mice+by+Alterations+of+Cancer+Cell+Proliferation+and+Apoptosis+and+Tumor+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis.</a> Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).</li>
<li>Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+Microenvironment+by+Growth+Factors+Regulates+the+In+Vivo+Growth+of+Skeletal+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts.</a> BJU International. 103, 1569-1573 (2009).</li>
<li>Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Bcl-2+Enhances+Metastatic+Potential+of+Human+Bladder+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells.</a> British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).</li>
<li>Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+Results+of+Myoblast+Injection+into+the+Urethra+and+Bladder+Wall%3A+a+Possible+method+for+the+Treatment+of+Stress+Urinary+Incontinence+and+Impaired+Detrusor+Contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourol+Urodyn%22%5BJournal%5D)">Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility.</a> Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).</li>
<li>Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+Liposomal+Muramyl+Tripeptide+Phosphatidylethanolamine+Treatment+of+Human+Bladder+Carcinoma+Growing+in+Nude+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice.</a> J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).</li>
<li>Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vascular-targeting+Fusion+toxin+VEGF121%2FrGel+Inhibits+the+Growth+of+Orthotopic+Human+Bladder+Carcinoma+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors.</a> Neoplasia. 7, 912-920 (2005).</li>
<li>Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B1-mediated+Down-Regulation+of+Angiogenesis-related+Genes+and+Therapy+of+Bladder+Cancer+Are+Dependent+on+Optimization+of+Biological+Dose+and+Schedule%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule.</a> Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).</li>
<li>Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-Derived+Cell+Transplantation+and+Differentiation+into+Lower+Urinary+Tract+Smooth+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle.</a> Urology. 57, 826-831 (2001).</li>
<li>Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Orthotopic+Models+for+Bladder+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research.</a> BJU International. 104, 1286-1291 (1988).</li>
<li>Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+new+human+bladder+cancer+cell+line+showing+features+of+squamous+and+glandular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation.</a> Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).</li>
<li>Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vivo+model+to+study+invasion+and+metastasis+of+human+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma.</a> Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).</li>
<li>Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+growth+of+human+bladder+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Urol%22%5BJournal%5D)">In vivo growth of human bladder cancer cell lines.</a> Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).</li>
<li>Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumor+inoculation+and+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU International. 100, 1377-1384 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

マウスの膀胱壁の注入は、膀胱壁の定義の領域に特定の細胞の移植が可能になります。この手法は、膀胱癌、平滑筋、および幹細胞生物学のマウスモデルのための広いアプリケーションを持っています。彼らの成長と分化を生理学的に関連する解剖学的文脈で検討することができるように定義することにより、マウスの膀胱壁の注入は、同所場所に膀胱癌や幹細胞の導入を促進する。実際には、Dinneyら。最初はヌードマウス1の同所性ヒト膀胱癌の異種移植片を研究するために、このテクニックを説明した。 膀胱壁の注入法は膀胱癌および幹細胞研究の1-9の番号に利用されていますが、それが使用される唯一の方法ではありません。多くの科学者は、皮下、腹腔内、または静脈注射によってヌードマウスに膀胱癌細胞を移植しようとしましたが、これらのモデルは、予測可能な腫瘍原性と11-13 in vivoでの細胞株での選択を可能に転移特性を示したいない。さらに、腫瘍細胞とマウス14の経尿道的接種に依存している膀胱癌モデルの数が...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>イソフルラン（Aerrane） </td><td>バクスター</td><td> NDC 10019-773-60 </td></tr><tr><td> 29または30ゲージの針</td><td>ハミルトン</td><td> 7803から06または7803から07 </td></tr><tr><td> 100マイクロリットルのシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td> 7656〜01 </td></tr></tbody></table>

マウスの膀胱壁インジェクション

Mouse Bladder Wall Injection

マウスの膀胱壁の注入は、同所の幹細胞、平滑筋、および癌の生物学を含む膀胱の現象を研究するために便利なテクニックです。注射を開始する前に、外科領域は、石けんと水と消毒液で洗浄する必要があります。手術用機器は使用前に、各動物の間で滅菌する必要があります。各マウスは、吸入イソフルラン麻酔（誘導2-5％、メンテナンス1-3％）とハサミで正中腹部切開を行うことによって露出は膀胱の下に配置されます。膀胱がいっぱいになっている場合、それは2本の指で圧迫穏やかなことで、部分的に減圧される。興味の細胞懸濁液は、intramurally 29または30ゲージの注射針と1ccのまたはより小さいシリンジを使用して膀胱のドームの壁に注入されます。傷は、傷のクリップと温暖化のパッドに回復させたマウスを用いて閉じられます。膀胱壁の注入は、練習で習得することができる繊細な顕微技術です。

マウスの膀胱壁の注入は、同所膀胱の幹細胞と癌の生物学を研究するために有用なアプローチである。この繊細な顕微法は慎重に手法と実践を習得することができます。

マウス膀胱壁への注射は、幹細胞、平滑筋、およびがん生物学を含む膀胱の現象を正位的に研究するための有用な手法である。...

この手順の全体的な目的は、膀胱壁の規定領域に細胞を導入することです。まず、腹部切開を行って膀胱を露出させることでこれを達成します。次に、針の針先（ベベル）を壁内へ挿入します。手順の最終ステップは、シリンジのプランジャーを押し、目的の細胞を膀胱壁に注入することです。細胞の移植が成功したかは、液漏れがなくサイズが安定した、局所的に明確なブレブ（水疱）が形成されることで判断します。マウスへの細胞の経尿道的接種などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、膀胱内のどの位置に細胞を移植させるかを直接制御できる点にあります。筋肉内注射の手技は習得が困難であるため、視覚的な実演による解説が極めて重要です。膀胱への針の挿入位置と正しい角度を把握することが、手技を成功させるために不可欠です。ここでは、実験の目的に応じてマウスの週齢、性別、および系統を選択してください。生後8〜12週齢のマウスを使用します。まず、石鹸と水で手術台の表面を洗浄します。次に、サイドスワイプまたは消毒用ワイプで手術台の表面を拭きます。手術器具は、手術前にオートクレーブで滅菌しておく必要があります。使用直前に器具を70% ethanolで拭き、個々の手術の間にはホットビード滅菌器で再滅菌します。30ゲージの針を装着した100 microliterのHamiltonシリンジを、絶対アルコールを繰り返し吸引した後、滅菌済みリン酸緩衝生理食塩水で洗浄します。麻酔をかけた動物を、正常な体温を維持するための温熱パッドの上に仰臥位で配置します。動物の鼻をイソフルランの気化剤を含むノズルに配置し、十分なレベルの麻酔を維持します。次に、クリッパーを用いて腹部の皮膚から除毛します。手術中の糞便による汚染を防ぐため、使い捨ての滅菌手術用ドレープで肛門を覆います。2枚目の手術用ドレープを下腹部に掛け、手術窓を設けます。解剖顕微鏡で拡大しながら、ベタディンとアルコールを繰り返し塗布して手術部位を滅菌します。ハサミを用いて下腹部正中切開を行います。腹部に穏やかな圧力をかけて、膀胱を露出させます。通常、膀胱は部分的または完全に充満しているため、腹部を加圧することで他の臓器が優先的に押しやられ、切開部位から膀胱が現れます。膀胱が充満している場合は、ドーム部分に穏やかな下向きの圧力をかけて、部分的に減圧してください。滅菌済みのハミルトンシリンジに、サンプル溶液を50 µL充填します。針先を面取り側が上になるようにして膀胱壁に刺入し、サンプル溶液を注入します。注入が成功すると、液漏れがなく、サイズが安定した局所的なブレブ（液溜まり）が形成されます。注射後、切開部を皮膚ステープラーで閉鎖します。マウスを保温パッドの上で回復させます。この手法は、適切に行えば10分から15分で完了します。注入後の連続的な時点における膀胱の組織学的解析を通じて

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