チキンの聴性脳幹スライスの準備と文化

この手順の全体的な目標は、in vitroの全細胞生理学または長期の器官型培養に使用するニワトリ、聴覚脳幹スライスを準備することです。これは、最初に卵子から胚を取り除くことによって達成されます。手順の2番目のステップは、頭蓋骨から脳を解剖し、聴覚脳幹領域を分離することです。

手順の3番目のステップは、ビオーム上に脳幹領域のスライスを準備することです。手順の最後のステップは、脳幹スライスを生理学記録用のチャンバー内に配置するか、ミルポアプレート上に置いて培養することです。最終的には、生理学的記録または長期的な器官型培養を通じて、ニワトリ胚からの健康な聴覚脳幹スライスを示す結果を得ることができます。

こんにちは、私の名前はアルマンド・シドルです。この2つの方法は、鳥類の聴覚発達に関する洞察を提供することができる。また、このバイノーラル聴覚回路のユニークな構造と機能による、トポグラフィーのエクソン再生、樹状突起のダイナミクス、および内因性およびシナプス特性の研究にも使用できます。

一般的に、この手法に不慣れな人は苦労します。組織は、生理学的および培養的アプローチのための生存可能なサンプルを得るために、迅速に解剖、スライス、および保存する必要があります。まず、蒸留水1ミリリットルあたり40ミリグラムの寒天を加え、電子レンジで沸騰するまで加熱して、4%寒天溶液を作ります。

熱い寒天溶液をシャーレに注ぎ、固まったら固まるまで冷まします。寒天の小さなブロックを切り取り、ビブラートステージに接着します。次に、後で使用するために500〜1000ミリリットルの人工脳脊髄液またはCSFを準備します。

95%酸素、5%二酸化炭素pH範囲、7.2〜7.4、および295〜310ミリオスモル/リットルの浸透圧の混合物で連続的に泡立つことにより、ビブラートステージチャンバーで使用します。A CSFが泡立っている間、70%エタノールで培養領域、ビブラム、ブレードへの解剖を清掃します。ビブラムブレードを蒸留水ですすぎ、乾燥させて解剖領域に清潔な液体吸収パッドを置き、通常はメス、はさみ、ピンセット、かみそりの刃、ピン、シャーレ、および滅菌組織培養フードの下のへらからなる適切な解剖ツールをレイアウトします6の鶏胚ごとに1ウェルを満たします。

ウェルプレートに1ミリリットルの培養物を入れ、培地に置き、摂氏35度と二酸化炭素5%でインキュベートします。必要な数の培養膜インサートを準備し、後で使用するためにフードに保管します。解剖パッドで使用します。

光源の下に卵を置き、胚の空気で満たされた空間、通常は卵子の大きな面を見つけます。へらの平らな端を使用して卵の大きな面を割って開き、メンブレン袋を露出させます。メスやハサミで膜嚢にスライスを作り、へらでニワトリの胚の頭をやさしく抽出します。

ハサミを使う。胚の頭をすばやく斬首します。かみそりの刃の先端を目の真ん中の少し後方に置き、頭蓋骨を通して正中線切開を甘やかすための吻側を作ります。

若い胚に穏やかな圧力をかけます。古い胚にはあまり圧力をかけません。切開が行われたので、さらに使用してください。

高齢の動物が頭蓋骨を露出させ、正中線を確認するために、皮膚と羽をそっと脇に押します。切る。強い圧力を使用して、カミソリの刃でスライスすることにより、頭蓋骨の吻側部分をブロックします。ブレードを目の後方に配置し、頭蓋骨と脳組織全体を急速に切り取ります。

詰まったティッシュを、こよち側を上にしてペトリ皿に置きます。組織を外側の筋肉領域に固定し、泡立てた状態で完全に沈めます。CSFです。

頭蓋骨の尾側領域、頭の両側にある目に見える首の筋肉のわずかに前方にある小さなはさみで正中線から横方向に切開します。頭蓋骨と組織を引き離して、小脳と脳を露出させます。脳組織が露出したので、小脳と脳幹を見つけて、頭蓋骨から組織を取り除きます。

小さなハサミを使用して、腹側の脳幹を囲む付着した組織を頭蓋骨の基部からそっと切り取ります。頭蓋骨から脳幹を切除したら、眼鏡を通して葉巻で満たされたペトリ皿に脳幹を固定します。次に、小さなハサミで茎を切って小脳を完全に取り除き、第4脳室の床を露出させます。

ピンセットを使用して、脳幹の表面から膜である組織と血管を取り除き、視神経テタに横方向の切り込みを入れます。脳幹を解放するには、角度のついたピンセットを使用して、寒天ブロックの前のビブラムステージに少量の瞬間接着剤を静かに、しかし迅速に置きます。脊髄で脳幹を持ち上げ、吻側を下にして背側をビブラムブレードに向けて、組織を瞬間接着剤の上に置きます。

余分な接着剤をペーパーティッシュまたはフィルターペーパーで取ります。ビブラムステージに約100ミリリットルの酸素化ACSFを静かに充填します。スライシングを急いで行う場合は、用意した酸素化A CSFを使用しても大丈夫です。

最初のセクションから。ビブラムブレードをビブラムステージに対して20〜22度の角度になるように配置します。ビブラムを最大振動振幅で開始します。

次に、組織の上部がブレードと平行になるように、ステージをブレードの上に移動します。スライスする前に。ブレードを脳幹組織に向かってすばやく動かしますが、ブレードが組織に接触する直前にかなり速度を落とします。

ブレードが所定の位置にあるので、できるだけゆっくりと前進して組織をスライスし始めます。組織の冠状部分全体を通過したら、絵筆でスライスをブレードからそっと離して捨てます。ビブラートステージを300〜500マイクロメートル刻みで下げてスライスします。

再び、脳幹組織に解剖学的特徴が見えるまで繰り返し、前のスライスをすべて破棄します。次に、聴覚構造を含む脳幹組織を200〜1000でスライスして収集します。マイクロメートルの厚さは、スライスの順に使用可能なスライスを慎重に収集します。

スライスをin vitro生理学に使用する場合(このビデオの後のセクションで説明します)、この時点で、上部が開いた中空のプラスチックチューブと下部にナイロンメッシュが接着されたカスタムチャンバーに個別に保管する必要があります。各チャンバーは、約350ミリリットルのA CSFが連続的に泡立てられるより大きな貯蔵チャンバーに取り付けられています。スライスを有機的な典型的な培養に使用する場合は、氷上の48ウェルプレートにゴム球を一端に取り付けたファイヤーポリッシュガラスピペットを使用して、約500ミリリットルのA CSFを含むスライスをスライスコレクション転写する直後の次のセクションを参照してください。

ウェルごとに1つのスライスを配置し、スライスの順序を維持します。終了したら、1つの脳のすべてのスライスを収集し、48ウェルプレートを組織培養フードに持って行きます。インキュベーターから以前に準備した6ウェルプレートを取り出し、フードにも持って行きます。

メンブレンインサートを培地の入ったウェルに入れ、その下に気泡が溜まっていないことを確認します。ガラスピペットを使用して、A CSFの滴中の1スライスを湿ったメンブレンに移します。上部に残っている余分なA CSFをマイクロピペットで挿入して取り除きます。

メンブレンごとに最大4つのスライスを繰り返し、スライスが互いに接触したり、メンブレンの縁に触れたりしないようにスライスを配置します。培養物は摂氏35度のインキュベーターで保存し、組織培養フードの下で週に3回培地を交換して維持します。ゴム球の一方の端に取り付けられたファイヤーポリッシュガラスピペットを使用して、各スライスを個々の保持チャンバーに入れます。

スライスの順番を維持し続けます。保持チャンバーは、以前に調製したA CSFで満たし、生理学実験中ずっと95%の酸素、5%の二酸化炭素の混合物で連続的に泡立てる必要があります。保持チャンバーを摂氏35度の水浴に約1時間入れてスライスを平衡化させ、次に室温で30分間休ませます。

スライスは、温かいお風呂から取り出してから最大6時間使用できます。室温で30分後、スライスをホールディングチャンバーから顕微鏡に取り付けられた0.5ミリリットルの記録チャンバーに移し、電気生理学的実験を行うことができます。ここには、ニワトリの聴覚回路の代表的な概略図とin vitroスライス画像が示されています。

スライス画像は聴性脳幹領域の典型であり、練習すれば簡単に識別できます。耳鼻咽喉科の興奮性入力は、聴覚神経またはNからマグノ細胞核またはNMおよび角核またはNna核の両方に投影されます。NMは、脳幹の両側の核、ラミン、またはNLに両側の興奮性入力を投影します。

上オリバー核またはSONからの抑制性入力は、na、nm、およびnlに投射されます。ここでは、E 11 チキンの聴覚脳幹の冠状スライスが 7 日後に示されています。文化で。

ニューロンは、免疫組織化学的方法を使用して標識され、体細胞と樹状突起で発生する微小管関連タンパク質2に対する抗体は、ニューロンを緑色で標識します。NMニューロンと軸索のクラスターは、rin色素のエレクトロポレーションによって赤色で標識されます。白い矢印で示されている同側のnm軸索終末は、背側のNL樹状突起に突き出ているのがわかります。

ここに示されているのは、培養中の4日間および7日間における急性組織および培養組織からの過分極および脱分極電流ステップに応答した重ね合わせ膜電圧変化です。過分極電圧低下の変化、外向き電流の大幅な減少、およびスライス培養アプローチで同様に発生する単一活動電位の発火に注意してください。年齢相当の急性組織休止膜電位はマイナス55からマイナス60ミリボルトの間でした 一度習得すると、このテクニックは正しく行われれば15分以内に実行できます。

この手順を試みている間は、適切な滅菌技術を使用することを忘れないでください、そしてこのビデオを見た後、生理学的記録または培養に使用するために鶏の聴覚編組茎スライスを準備する方法についてよく理解しているはずです。