Name: メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の皮下感染 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-09T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 学ぶMRSAの皮下感染モデルによる細菌生存と免疫応答の解析。マウスを用いた皮膚軟部組織感染モデルでサイトカイン・ケモカイン動態を評価し、病原性と宿主防御メカニズムを解明する。

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この作品は、バロウズ、ウェルカムキャリア賞でとGY劉への保健助成金AI074832の国立研究所によってサポートされていました。

1。感染のためにMRSAを準備する（感染の2日前） <ol><li>株式の培養液から血液寒天（トリプチケースソイ寒天培地（TSA））プレートへのMRSAの白金耳を接種する。 </li><li>血液寒天プレート上に溶血の表現型を（それぞれのコロニーの周りをクリアゾーン）を確認してください。 </li><li>他の実験との整合性溶血性表現型を持つコロニーを選択してください。 </li><li> 15 mLのスナップキャップチューブに、充当抗生物質、必要に応じて、3 mLのトッドヒューイットブイヨン（THB）にコロニーを接種。 </li><li> 220rpmで振盪しながら37℃で一晩インキュベートする。 </li></ol> 2。感染のためにマウスを準備する（感染前日） <ol><li>マウスのサイズに応じて、マウスの裏面に3 × 4 cmのエリアから毛皮を剃る。 </li><li>剃毛エリアに〜5 mm 3の脱毛剤クリームを（ローカルドラッグストアから購入）を適用します。 </li><li>脱毛剤クリームは約1分間皮膚表面にインキュベートすることができます。 </li><li>のddH 2 Oのウェットペーパータオル</li><li>ぬれた紙タオルで脱毛​​剤クリームをふき取ってください。 </li></ol> 3。 （感染の日に）感染のためにMRSAの準備<ol><li> 50mLのスクリューキャップチューブに、予め温めておいたTHB 10mLで1:500で1:1000に一晩細菌培養液を希釈する。 </li><li> ° Cで約2.5時間540が 2.5に達するまで、220rpmで振盪しながら37℃でインキュベートする。 </li><li> 4℃で10分間3225 × gで遠心分離によってMRSAを収集℃に</li><li>上清を捨てる。 </li><li> 10mLのダルベッコのリン酸塩バクテリアペレットを再懸濁さ生理食塩水（DPBS）はバッファ。 </li><li>手順3と4を繰り返します。 </li><li>所望の濃度でDPBSでバクテリアペレットを再懸濁します。 </li><li>シリアル10 1 10 8に細菌懸濁液を希釈する。 </li><li>血液寒天プレート上にプレート希釈細菌懸濁液を。 </li><li> 37℃で一晩培養する。 </li><li>接種材料の溶血性表現型を観察し、記録する。 </li><li>プレート上でコロニー形成単位（CFU）の数カウント。 </li><li>プレート上のCFUの数に基づいて接種を計算する。 </li></ol> 4。 MRSAの皮下感染（感染日と3日後の感染症について） <ol><li>剃毛面積の皮下100μL細菌懸濁液を注入する。 </li><li>マウスが生きていることを確認するため、注入後3〜5時間のために動物を観察。 </li><li>毎日の動物の背面にある病変を観察し、それが必要なときに毎日の病変面積を記録。病変の観察は、病変のサイズと形態の記録を含める必要があります。皮膚と筋肉の病変の両方は、病変の長さと幅を乗じて定量される。不規則な形状の病変は、より小さな対称の部分に分割し、各部分が同一の方法で測定する必要があります。 、病変の測定には、コンピュータ支援組織形態評価プログラム（でNIHから入手できるオープンソースのImageJを使用することができます<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> 2）。 </li><li>頸椎脱臼が続くイソフルランの吸入により3日目、感染後に動物を生け贄に捧げる。 </li><li>皮膚病変を観察し、記録する。 </li><li>滅菌はさみでニックは皮膚。 </li><li>注意深くオフ皮膚の皮と筋肉で病変を観察し、記録する。 </li><li>消費税​​病変と約2 - 周辺地域から5 mm。 </li><li>脾臓と腎臓を収集する。 </li><li>組織ホモジナイザーを使用して組織をホモジナイズまたは組織とDPBSの100μLを含むマイクロチューブに1 mLのシリンジからプランジャーを繰り返し適用し。 </li><li>各チューブにDPBS 900μLを加える。 </li><li> 5分間ボルテックスのサンプルを。 </li><li>シリアル10 6にDPBS 10 1との希薄懸濁液。 </li><li> THAプレート上にプレートに希釈懸濁。 </li></ol> 5。代表的な結果： <ol><li>すぐにそれぞれの皮下注射後、ブレブは感染が（図1A）が正しく行われているときに皮膚表面に見られます。何ブレブが皮膚表面で観測されていない場合は、注射が深すぎるかもしれない、とこれは（病変サイズ、CFU）感染症の転帰に影響を与える可能性があります。 </li><li>細菌懸濁液は希釈する必要があるとCFUは、各実験のための血液寒天平板上で検討する必要があります。接種材料は、均質な表現型を持っているかどうかを1）;感染症2）正確な生菌数：このステップでは、重要な情報が得られます。 </li><li>病変と細菌の生存には様々な時点で、感染後に評価することができる。ここで、我々は3日、感染後に感染を調べた。と筋肉の表面（図1C上：1 × 10 9：;：病変サイズは皮膚の表面（図1D 1 × 10 9 1 × 10 7 CFU図1B）で分析されています7 CFU）。病変面積は、（mm）×幅（mm）の組織の損傷（図2、図B）を評価するために測定される長さと等しくなります。この結果は、特定の病原性因子による組織の損傷の程度を判断するのに役立ちます。さらに、病変を切除し、DPBS中でホモジナイズし、感染部位での細菌の生存率を示すCFUの数を（図2C）、定量するためにメッキされています。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2528/2528fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。皮膚と筋肉の病変。CD1マウスは、MRSA（LAC）を持つ複数脇腹の皮下に接種した。写真は、時間0と3日目、感染後で撮影したもの。 （）時間0感染後（PI）、（B） - （G）3日目π、B、D.とF：皮膚病変、C、E、およびG：筋肉病変、BとC：1 × 10 9 CFU感染、DとE：1 × 10 7 CFU感染、FとG：モック。 <img src="/files/ftp_upload/2528/2528fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。皮膚病変の大きさと生菌は3日、感染後に感染部位の数でカウント。MRSA（LAC）に感染したCD1マウスの皮膚と筋肉の病変。 （A）皮膚病変の大きさ。 （B）筋病変の大きさ。 （C）全組織CFU。 H：1 × 10 9 CFUの接種、L：1 × 10 7 CFUの接種。 *：P &lt;0.05、Mann - Whitney検定。

<ol><li>Ahn, J. Y., Song, J. Y., Yun, Y. S., Jeong, G., Choi, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+Staphylococcus+aureus-infected+septic+mice+by+suppression+of+early+acute+inflammation+and+enhanced+antimicrobial+activity+by+ginsan%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protection of Staphylococcus aureus-infected septic mice by suppression of early acute inflammation and enhanced antimicrobial activity by ginsan.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 46, 187-197 (2006).</li>
<li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affordable+image+analysis+using+NIH+Image%2FImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41, 47-47 (2004).</li>
<li>Hahn, B. L., Onunkwo, C. C., Watts, C. J., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+dissemination+and+cutaneous+damage+in+a+mouse+model+of+staphylococcal+skin+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Systemic dissemination and cutaneous damage in a mouse model of staphylococcal skin infections.</a> Microb Pathog. 47, 16-23 (2009).</li>
<li>Hruz, P., Zinkernagel, A. S., Jenikova, G., Botwin, G. J., Hugot, J. P., Karin, M., Nizet, V., Eckmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD2+contributes+to+cutaneous+defense+against+Staphylococcus+aureus+through+alpha-toxin-dependent+innate+immune+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">NOD2 contributes to cutaneous defense against Staphylococcus aureus through alpha-toxin-dependent innate immune activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12873-12878 (2009).</li>
<li>Ji, Y., Zhang, B., Van, S. F., Horn, P. W. arren, Woodnutt, G., Burnham, M. K., Rosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+critical+staphylococcal+genes+using+conditional+phenotypes+generated+by+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of critical staphylococcal genes using conditional phenotypes generated by antisense RNA.</a> Science. 293, 2266-2269 (2001).</li>
<li>Somerville, G. A., Beres, S. B., Fitzgerald, J. R., DeLeo, F. R., Cole, R. L., Hoff, J. S., Musser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+serial+passage+of+Staphylococcus+aureus%3A+changes+in+physiology%2C+virulence+factor+production%2C+and+agr+nucleotide+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vitro serial passage of Staphylococcus aureus: changes in physiology, virulence factor production, and agr nucleotide sequence.</a> J Bacteriol. 184, 1430-1437 (2002).</li>
<li>Tseng, C. W., Kyme, P., Low, J., Rocha, M. A., Alsabeh, R., Miller, L. G., Otto, M., Arditi, M., Diep, B. A., Nizet, V., Doherty, T. M., Beenhouwer, D. O., Liu, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Panton-Valentine+leukocidin+contributes+to+inflammation+and+muscle+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin contributes to inflammation and muscle tissue injury.</a> PLoS One. 4, e6387-e6387 (2009).</li>
<li>von Kockritz-Blickwede, M., Rohde, M., Oehmcke, S., Miller, L. S., Cheung, A. L., Herwald, H., Foster, S., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+mechanisms+underlying+the+genetic+predisposition+to+severe+Staphylococcus+aureus+infection+in+the+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunological mechanisms underlying the genetic predisposition to severe Staphylococcus aureus infection in the mouse model.</a> Am J Pathol. 173, 1657-1668 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

<ol><li>マウスの皮膚および軟部組織感染症モデルでは、病原体の生体毒性評価のための強力なツールです。 S.の病原性皮膚および軟部組織感染症の黄色ブドウ球菌は、パラメータの数によって異なります。これらは、接種量、細菌の増殖期、接種の深さ、マウスの年齢、およびマウスの遺伝的背景7、8が含まれています。このモデルを用いて病原性の機能を調べるときに、それは結果に一貫性を持たせることを保証するためにこれらのパラメータをコントロールすることが重要です。我々はSKH1（ヘアレスマウス）、C57BL / 6、BALB / c、およびCD1含め数系統のマウスで皮膚のMRSA感染症を研究している。感染の結果は、マウスの遺伝子構造は、MRSA感染症1の重症度の重要な決定要因であることを他の報告と一致異なる株7に異なります。このマウス系統は、S.の研究に適していることが示されているため、この実験では、CD1マウスを利用する黄色ブドウ球菌の病原因子5は、他の株よりも安価です。 </li><...

<table><tbody><tr><td>THB</td><td>VWR international</td><td>95025-314</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>1 ml シリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>27G1/2 針</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>羊血寒天培地 (TSA)</td><td>VWR international</td><td>90004-328</td><td></td></tr></tbody></table>

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（mrsa）の皮下感染

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSAは、公衆衛生の世界的な脅威であり、MRSAの皮膚および軟部組織感染症は現在、より多くの米国内のすべての軟部組織感染症の半分以上を占めている。間の軟部組織感染症、筋炎、化膿性筋炎、および壊死性筋膜炎は、ますますMRSAが地域社会から生じると関連して報告されている。 MRSAと、より重篤な感染症につながる宿主免疫間の相互作用を理解するために、動物モデルの可用性は、宿主と細菌の要因の調査を可能にする、非常に重要です。いくつかの感染症のモデルがSの病因を評価するために導入されている表在性皮膚感染症の間に黄色ブドウ球菌 。ここで、我々は、皮膚、皮下、および筋肉の病理を調べる皮下感染モデルを説明します。

マウスの皮膚および軟部組織感染症のモデルは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）およびホストの免疫応答の病原性の機能を評価するために利用されている。ここで、我々は、皮膚および軟部組織感染症のための皮下感染モデルを発表した。

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の皮下感染

MRSAは世界的な公衆衛生上の脅威となっており、現在、皮膚および軟組織感染症におけるMRSA感染は、全軟組織感染症の半分以上を占めています。

本実験の全体的な目的は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の生存および播種、ならびに感染部位におけるケモカインおよびサイトカインレベルを調べることです。これは、マウスの背中の被毛を除去し、明確な観察領域を確保することで達成されます。第2のステップとして、懸濁液中のMRSAを感染3日後にマウスに皮下投与し、組織ホモジネートをアガープレート上で培養してコロニー形成単位数を決定することで、感染病理および細菌数を評価します。こんにちは。私はDe Lordonです。私はポストドクター研究員です。こんにちは、Mariel Sanchezです。私は博士課程の学生です。そして、私はAndrea Hudaです。私はリサーチアソシエイトであり、セダーサイナイス・メディカルセンター小児科のジョージ・リー研究室に所属しています。この手法は、筋炎、多発性筋炎、壊死性筋膜炎などの重症感染症のモデリングなど、医学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この手法は、緊急性の高い重症感染症に関する知見を提供できるだけでなく、A群連鎖球菌やその他の微生物などの他の系にも適用可能です。さらに、筋炎や多発性筋炎を引き起こす他の生物の機能および病原性を研究することも可能です。一般的に、この手順に不慣れな方は、caucus areas global regulatorのスタッフの一員が非常に変異しやすいため、苦労する可能性があります。十分な注意を払わない場合、収集したデータに大きなばらつきが生じ、データの解釈が困難になる恐れがあります。それでは始めましょう。BSL2施設にて、TSAベースの羊血液寒天培地プレートと、凍結保存ストックを用いた滅菌ループを準備します。保存温度-80°Cで保管されているMercer株のストック培養物を 꺼냅니다。次に、滅菌ループを用いて、ストック培養液から氷の破片を少量取り出し、プレート上に置きます。Mercerストック培養液の小さな破片を採取したら、すぐにストック培養液をフリーザーに戻してください。繰り返しの凍結融解はストック培養液を損傷させるため、融解を避ける必要があります。ループを用いて寒天培地上に画線し、Mercerの単一コロニーの形成を促進させます。プレートをCO2を添加せず、37°Cで一晩インキュベートします。翌日、新しい血液寒天培地プレートとTSAプレートを用意してラベルを貼り、15 mLのスナップキャップチューブに3 mLのTHBを分注します。一晩培養したM SSAプレートを取り出し、コロニーの溶血表現型を確認します。滅菌ループを用いて、以前の実験コロニーと一致する表現型を持つコロニーを選択します。同じループを用いた画線法により、選択したコロニーをTHBに接種します。THB溶液を入れたプレートを37°Cで、220 rpmの振盪条件下で一晩培養します。これらの細菌は、後の工程でマウスに皮下感染させるための培養液の接種に使用します。血液寒天培地プレートも同様にインキュベーターに入れます。翌朝、このプレートを使用して、THB溶液中の細菌の溶血表現型が、最初に選択したコロニーの表現型と一致することを確認します。溶血表現型が元のクローンと一致しない場合は、実験を開始しないでください。マウスをプラットフォームに移し、背中の被毛を剃毛します。動物が過度に攻撃的な場合は、イソフルランによる鎮静が必要になることがあります。除毛クリーム（NAなど）を、除毛した部位に約5立方ミリメートル塗布してください。NAは地元のドラッグストアで購入可能です。ベビーオイル配合の除毛クリームを購入してください。ベビーオイルが含まれていない製品は、マウスにとって刺激が強すぎます。除毛クリームを皮膚表面に塗布し、約1分間放置します。クリームを塗布して待機している間に、二重蒸留水で数枚のペーパータオルを湿らせておきます。1分後、その湿ったペーパータオルを使用して、除毛した部位をきれいに拭き取ってください。皮膚に除毛クリームが残っていないことを確認してください。37°Cの細菌インキュベーター内で、50 mLスクリューキャップチューブに入れた10 mLのTHBを4〜10時間予熱します。Bacteria培養液20 µLを予熱したTHBに移します。これにより、オーバーナイト培養したmercが希釈されます。1:500の懸濁液を作成します。チューブを37 °Cに設定した振盪インキュベーターに入れ、220 rpmで約2時間半から3時間培養します。さらに多くのTHBを用いて細菌懸濁液を1:10に希釈し、分光光度計で懸濁液を測定します。514ナノメートルでの吸光度を確認します。1/10希釈した懸濁液の吸光度が0.25に達するまで、37°Cで220rpmの振盪を伴いながら懸濁液を再インキュベートし続けます。Mを回収するために、50mLチューブを4°Cで3,225×g、10分間遠心分離し、上清を捨てて再懸濁します。細菌ペレットを10 millilitersのDPBSに懸濁し、この重症感染モデルのために遠心分離ステップを繰り返して細菌を再度洗浄します。細菌ペレットを約one milliliterのDPBSに再懸濁し、1 × 10¹⁰ colony forming units per milliliterになるように調整します。羊血 agar platesを準備し、細菌をDPBSで10⁻¹から10⁻⁸まで段階的に希釈してプレートに播種します。段階希釈した細菌懸濁液を10 µLずつ、血液寒天平板に3連で滴下します。プレートを37 °Cで一晩培養します。16〜18時間培養した後、接種菌の溶血表現型を観察し、記録します。プレート上のコロニー形成単位（CFU）を計測します。感染接種量は、プレート上のコロニー形成単位数に基づいて算出されます。あらかじめ調製したDPBS中の細菌懸濁液を100 µLとり、シリンジに充填します。注入前に、マウスの呼吸数が1秒に約1回になるまで鎮静させてください。なお、このビデオではデモンストレーション目的として、安楽死させたマウスを使用しています。注入後、M serを片側の側腹部に注射します。マウスをケージに戻します。動物飼育室に戻す前に、マウスが生存していることを確認するため、注射後3〜5時間は動物を観察してください。動物を屠殺した後、動物の背中にある病変を毎日観察します。皮膚上の病変の大きさおよび状態を測定し、記録します。皮膚および筋肉の病変領域は、病変の長さと幅をミリメートル単位で乗じることで定量化します。不規則な形状の病変は、より小さく対称的な断片に分割し、各断片を同一の方法で測定する必要があります。組織採取用に、100 µLのDPBSを入れた1.5 mLマイクロ遠心チューブを準備します。滅菌済みカミソリで皮膚に切り込みを入れ、滅菌済みハサミで病変を摘出します。病変部を切除する際は、患部の周囲の正常な皮膚を約2〜5 mm含めて切除してください。筋肉の病変を解析するため、切除した病変部を組織回収チューブに入れます。皮膚を慎重に剥離し、筋肉組織における病変の大きさを測定し、その状態を記録してください。脾臓と腎臓を採取します。これらの組織をそれぞれ個別の回収チューブに入れます。1 mLシリンジを用いて約30秒間撹拌し、組織をホモジナイズします。各チューブに900 µLのDPBSを加えます。THAプレートを準備し、ホモジナイズした組織サンプルを5分間ボルテックスします。サンプルの段階希釈を行います。懸濁液を10の6乗倍まで段階希釈します。96ウェルプレートに、各段階希釈懸濁液を10 µLずつ分注します。プレートを37 °Cの細菌用インキュベーターで一晩培養します。翌朝、プレートのコロニー形成単位（CFU）を計数し、希釈倍率に基づいてCFU数を算出します。感染操作が正しく行われていれば、皮下注射の直後に皮膚表面に盛り上がり（bleb）が観察されます。盛り上がりが観察されない場合は、注射が深すぎた可能性があり、感染の結果に影響を及ぼすことがあります。病変の大きさおよび細菌の生存率は、MSA感染後のさまざまな時点で評価できます。以下の皮膚病変は感染後3日目に検査されたものであり、片側の側腹部に1×10⁷ colony forming unitsを接種したCD1マウスにおける病変の例です。筋肉の病変は通常、皮膚病変の下方の組織に見られます。以下は、前述の皮膚病変写真に対応する筋肉表面病変の例です。これらは、$1 \times 10^7$ colony forming unitsを接種したマウスにおいて、感染後3日目に観察された筋肉病変です。病変面積は、ミリメートル単位で測定した病変の長さ $\times$ 幅として決定され、皮膚の組織損傷を評価するために測定されます。感染部位に局在する細菌のコロニー形成単位（CFU）数は、切除した病変部位で定量することができます。CFU数は、毒性因子がMSAに生存上の利点をもたらしているかを示す指標となります。この手順を行う際は、針および強毒性の微生物を使用するため、標準的な安全予防策を講じることが重要です。最後に、膿瘍モデルとして、我々のモデルよりも1,000分の1の低濃度の接種量を用いることで、持続的なRSA感染を促進するS因子は何かといった追加的な疑問に対する回答を得ることができます。Mars Aを充填したシリンジの取り扱いは極めて危険であるため、シリンジを直接シャープスコンテナに廃棄するなど、針による不慮の刺傷を避けるための予防策を忘れないでください。また、本実験では、作業エリアを適切に消毒するために、標準的なBSL-2プロトコルに従うことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。それでは。

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