メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の皮下感染

本実験の全体的な目的は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の生存と播種、および感染部位におけるケモカインおよびサイトカインレベルを調べることです。これは、マウスの背中から被毛を除去し、観察領域を明確に確保することで達成されます。次のステップとして、

懸濁液中のMRSAを感染から3日後にマウスに皮下投与します。感染病理および細菌数は、組織ホモジネートを寒天培地で培養し、コロニー形成単位数を測定することで評価できます。こんにちは。私の名前はデ・ロンドンです。

私は博士研究員です。こんにちは、私の名前はMariel Sanchezです。私は博士課程の学生です。そして、私はAndrea Hudaです。

私はリサーチアソシエイトで、セダーサイナイス・メディカルセンター小児科のGeorge Lee研究室に所属しています。この手法は、筋炎、多発性筋炎、壊死性筋膜炎などの重症感染症のモデリングなど、医学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この手法は救急の重症感染症に対する知見を提供できるだけでなく、A群連鎖球菌やその他の生物などの他の系にも適用可能です。

さらに、筋炎や多発性筋炎を引き起こす他の生物の機能と病態についても研究することが可能です。一般的に、この手順に慣れていない方は、caucus areas global regulatorのスタッフの一人が非常に変異しやすいため、苦労する可能性があります。十分な注意を払わなければ、収集されたデータに大きなばらつきが生じ、データの解釈が困難になる恐れがあります。

それでは開始します。BSLレベル2の施設にて、TSAベースの羊血寒天培地プレートと、凍結ブロックを用いて滅菌ループを準備します。保存温度-80°Cで保管していたMercer株のストック培養物を取り出します。

次に、滅菌ループを使用して、ストック培養液から氷の小片をプレート上に少量採取します。Mercerストック培養液の小片を採取したら、凍結融解の繰り返しはストック培養液を損傷させるため、融解を防ぐために直ちにストック培養液をフリーザーに戻してください。ループを用いて寒天培地上に画線し、Mercerの単一コロニーの形成を促進します。

プレートをCO2を添加せずに37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、新しい血液寒天培地プレート、TSAプレート、および3 mLのTHBを入れた15 mLスナップキャップチューブを用意し、それぞれにラベルを貼ります。

一晩培養したM SSAプレートを取り出し、コロニーの溶血表現型を確認します。滅菌ループを用いて、以前の実験コロニーと一致する表現型を持つコロニーを選択してください。同じループを用いた画線法により、選択したコロニーをTHBに接種します。

THB溶液が入ったプレートを37°Cで、220 rpmで振盪しながら一晩インキュベートします。これらの細菌は、後の工程でマウスに皮下感染させるための培養液の接種に使用します。血液寒天培地プレートも同様にインキュベーターに入れます。

翌朝、このプレートを用いて、THB溶液中の細菌の溶血表現型が、最初に選択したコロニーの表現型と一致することを確認します。溶血表現型が元のクローンと一致しない場合は、実験を開始しないでください。マウスをプラットフォームに移し、背中の被毛を剃毛します。

動物が過度に攻撃的な場合は、イソフルランによる鎮静が必要になることがあります。除毛剤（NAなど）を約5 cubic millimeters、除毛部位に塗布してください。NAは地元のドラッグストアで購入可能です。

ベビーオイル配合の除毛クリームを購入してください。ベビーオイルが含まれていない製品はマウスにとって刺激が強すぎます。クリームを皮膚表面に塗布し、約1分間放置します。除毛クリームを塗布している間に、二重蒸留水でペーパータオルを数枚濡らしておきます。1分後、その濡れたペーパータオルを使用して、除毛した部位をきれいに拭き取ってください。

皮膚に除毛クリームが残っていないことを確認してください。50 mLスクリューキャップチューブに10 mLのTHBを入れ、細菌用インキュベーターにて37 °Cで4〜10時間予熱します。一晩培養した細菌培養液20 µLを、予熱したTHBに移します。これにより、一晩培養したmercが希釈されます。

1:500の懸濁液を作成します。チューブを37°Cに設定した振盪インキュベーターに入れ、220 rpmで約2.5〜3時間培養します。その後、さらにTHBを用いて細菌懸濁液を1:10に希釈し、分光光度計で懸濁液を測定します。

514ナノメートルの吸光度で測定します。1/10希釈液の吸光度が0.25に達するまで、懸濁液を37 °Cで220 rpmで振盪しながら再インキュベーションし続けてください。M erを回収するため、50 mLチューブを4 °Cで3,225 ×g、10分間遠心分離し、上清を捨てて再懸濁します。

細菌ペレットを10 mLのDPBSに懸濁し、この重症感染モデルのために遠心分離ステップを繰り返して、細菌を再度洗浄します。細菌ペレットを約1 mLのDPBSに再懸濁し、約1 × 10¹⁰ CFU/mLにします。羊血agarプレートを準備し、DPBSを用いて細菌を10⁻¹から10⁻⁸まで段階的に希釈してプレートに播種します。

段階希釈した細菌懸濁液を10 µLずつ、血液寒天平板に3連（triplicate）で滴下します。プレートを37 °Cで一晩培養します。16〜18時間培養した後、接種菌の溶血表現型を観察し、記録します。

プレート上のコロニー形成単位（CFU）をカウントします。感染接種量は、プレート上のコロニー形成単位数に基づいて算出します。

あらかじめ調製したDPBS中の細菌懸濁液を100 µL取り、シリンジに充填します。注射の前に、マウスの呼吸数が1秒に約1回になるまで鎮静させてください。なお、本ビデオではデモンストレーションのため、安楽死させたマウスを使用しています。

注射後、M serを片側の側腹部に注入します。マウスをケージに戻します。動物室に戻す前に、マウスが生存していることを確認するため、注射後3〜5時間、個体を観察してください。

動物を犠牲にした後、動物の背中の病変を毎日観察します。皮膚上の病変の大きさと状態を測定し、記録します。皮膚および筋肉の病変領域は、病変の長さと幅をミリメートルで乗じることで定量化します。

不規則な形状の病変は、より小さな対称的な断片に分割し、各断片を同一の方法で測定する必要があります。組織採取用に、100 µLのDPBSを入れた1.5 mLマイクロ遠心チューブを用意します。滅菌済みのカミソリで皮膚に切り込みを入れ、滅菌済みのハサミで病変を切除します。

病変部を切除する際は、周囲の健康な皮膚を約2～5 mm含めて切除するようにしてください。切除した病変部は、筋肉病変の解析用組織回収チューブに入れます。皮膚を慎重に剥がし、筋肉組織上の病変の大きさを測定して状態を記録します。

脾臓と腎臓を採取します。これらの組織をそれぞれ個別の回収チューブに入れます。1 mLシリンジを用いて約30秒間攪拌し、組織を均質化します。

各チューブにDPBSを900 µL加えます。THAプレートを準備し、均質化した組織サンプルを5分間ボルテックスします。サンプルを段階希釈します。

懸濁液を10の1乗から10の6乗倍まで段階的に希釈します。96ウェルプレートの各ウェルに、希釈した懸濁液を10 µLずつ分注します。プレートを37 °Cの細菌用インキュベーターで一晩培養します。

翌朝、プレートのコロニー形成単位を計測し、希釈倍数に基づいてコロニー形成単位数を算出します。感染操作が正しく行われていれば、皮下注射の直後に皮膚表面に盛り上がり（bleb）が観察されます。盛り上がりが観察されない場合は、注射が深すぎた可能性があり、感染の結果に影響を及ぼすことがあります。

MSAを用いた感染後、様々な時点で病変サイズと細菌の生存率を評価できます。以下の皮膚病変は感染後3日目に観察されたものであり、片側の側腹部に1×10⁷ CFUを接種したCD-1マウスにおける病変の例です。筋肉の病変は通常、皮膚病変の下方の組織に見られます。

以下は、先に示した皮膚病変写真に対応する筋肉表面病変の例である。これらは、1×10⁷ CFUを接種したマウスにおいて、感染後3日目に観察された筋肉病変である。病変面積は、ミリメートル単位で測定した病変の長さ×幅として決定され、皮膚の組織損傷を評価するために測定される場合がある。

感染部位に局在する細菌のコロニー形成単位数は、切除した病変部で定量することができます。コロニー形成単位数は、毒性因子がMSAに生存上の利点をもたらしているかどうかを示す指標となります。本手順を実施する際は、針および強毒性微生物を使用するため、標準的な安全上の注意事項に従うことが重要です。

最後に、膿瘍モデルとして、当モデルよりも1,000倍低い接種量を用いることで、持続的なRSA感染を促進するS因子は何かといった追加の疑問に答えることができます。Mars Aを満たした注射器での作業は極めて危険であるため、注射器を直接シャープスコンテナに廃棄するなど、針による不慮の刺傷を避けるための予防措置を忘れないでください。また、本実験では、作業エリアの適切な消毒を確実にするため、標準的なBSO2プロトコルに従うことが重要です。

以上になります。ご視聴ありがとうございました。それでは。