ヒートショック法による大腸菌へのプラスミドDNAの形質転換

こんにちは、アレックス・ホージです。私はカリフォルニア大学アーバイン校の生理学および生物物理学部のジムホールラボで働いています。そして今日は、各ショックの方法で電気的に有能な大腸菌を変換する方法を紹介します。

そこで今日は、この手法を使って、ゼブラフィッシュの全マウント化を行うための問題を行っているため、私のレーション製品で大腸菌を変換しています。では、これからトランスフォーメーションを開始します。だから最初にあなたはあなたの水浴槽またはドライババスを42度にする必要があります。

あなたはちょうど氷で主要都市から取ったあなたのバクテリアを持っている必要があります。今日、私たちはitiesからの電気的能力細胞と氷中のあなたのDNAを使用しています。また、自宅の温度または37°CのSOC培地のチューブとLVと抗生物質培地のプレートが必要です。

そこで、今度はバクテリアと一緒にDNAを加えます。だから、バクテリアを汚染しないように、炎の隣で作業します。だから私はバクテリアと一緒にレーションを追加します。

それは50マイクロリットルのバクテリアで、すぐに氷の中に戻り、バクテリアとDNAを混ぜるために少しフリックすることができます。そして、氷の中で最大15分間放置することができます。さて、15分が経過し、バクテリアを42度に45秒間置くヒートショックを行う準備が整いました。そこで、チューブを氷から直接取り出し、42度セット、30タイマー45秒で、その後、非常に速く氷に戻し、42度から直接氷の上に置きます。

そして、2分間待ちます。そこで、SOC培地をバクテリアに加え、37°Cで30分間置くことにします。そこで、500マイクロリットルのSOC培地を吸い、それをバクテリアに入れて、小さな間に合わせの部屋に入れます。

ですから、インキュベーターにイードチューブと仮設チャンバーを使用する場合は、イーンドチューブを水平に置くようにしてください。これで、チューブをシェーカーに入れる準備が整いました。だから、この小さなチャンバーは37度で30分間あります。

さて、37度でのインキュベーションが終了し、lbと抗生物質にバクテリアをプレートします。ですから、私の場合はクロラールです。だから私は各サンプルの50マイクロリットルで、プレートの上に置きます。

だから、残りの500マイクロリットルで、あなたは小さな卓上でそれらを回転させ、いくつかはそれをバクテリアを剥がすために拒否します。それで、化後、私たちは良いペレットを手に入れます、そして私たちが今やろうとしていることは、ほとんどすべてのSOC媒体を取り除き、ちょうど50マイクロリットルを残して、そして我々はこの50マイクロリットルの濃縮されたバクテリアをメッキすることができます。だから私は約450マイクロリットルを支払いました。

これだけ残します。そこで、パレットをSOCメディアの左50マイクロリットルに吊り下げます。そして、その後、この50マイクロリットルを別のプレートにプレートすることができます。

だから、私は各パレットに抵抗し、それからそれを人形にして皿に盛り付けます。したがって、サンプルごとに最後に2つのプレートがあります。だから今、私たちはバクテリアをLBプレートに広げなければなりません。

そこで、オートクレーブガラスビーズをいくつか使用しますが、パイプパストを使用してスプレッダーに成形することもできます。だから私はペトリ皿にいくつかのビーズを置くつもりです。それは好きです。

まあ、10 15。ですから、ビーズを加えた後、すべてのプレートをそのように山に置き、そっと振って、ビーズがバクテリアをプレートのいたるところに均等に広げるようにします。だから、プレートが乾くまでプレートを動かします。

つまり、ビーズと一緒に移動するときに大きな液体の筋が見えないようにする必要があります。例えば、そのプレートでは、ビーズが一緒につぶれて、たくさんの筋が見られる傾向があります。1つ、ビーズが自由に動く、1つが乾いているのは汗です。

これでプレートが乾いてきたので、ビーズを捨てることができます。だから、私はただそのように引っ張って、あなたがそれらをリサイクルできるようにしています。では、プレートを37のインキュベーターに一晩入れ、37のインキュベーションの12時間後にプレートを逆さまにして置くと、プレートがインキュベーターから出されます。

そして、ご覧のとおり、50マイクロリットルのプレートには、残りのプレートをプレートにしたプレートよりもコロニーが少なくなっています。バクテリアを形質転換する際に重要なことは、プレート上に適切な量のコロニー、適切な密度を持つことです。ですから、この場所ではコロニーが非常に少ないですが、より多くのコロニーが必要な場合は、このプレートでちょうど適切な密度、つまりプレートあたり約100コロニーの良い例を持つことができます。

このプレートは、コロニーが多すぎて個々のコロニーを選択できないため、悪い例です。そこで、各変換によって大腸菌を変換する方法を示しました。したがって、この手法の非常に重要な側面は、衝撃の前にすべてまたは氷を冷たく保つことです。

その後、通常は45秒、氷の中ではさらに42度に戻ります。そして、他のすべては暖かい温度または37度でなければなりません。そこで、今度はPCRスクリーニングでコロニーをスクリーニングします。

ですから、ポイントの1つは、2つのプレートを持つことです。ですから、1つは、多くのコロニーがあり、コロニーが1つ少ないと予想しています。そして重要なことは、ビーズやパイプパストを使用してプレートを非常に乾燥させることです。

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