Name: に対するモノクローナル抗体の受動的な管理 H. capsulatumとその他の真菌病原体 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶヒストプラズマ症に対するモノクローナル抗体の受動的免疫療法。C57BL/6マウスを用いて抗体の保護効果と真菌負荷の減少を評価し、体液性免疫による治療戦略の可能性を探索する。

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1。 H.の成長Capsulatum <ol><li> 20分の紫外線照射で10％の漂白剤でキャビネットをクリーニングして菌を使用のためのバイオセーフティキャビネットを準備します。H.金型のフォームがBSLIIIを必要としながら酵母の段階でcapsulatumは 、 バイオセーフティレベル（BSL）IIの実践が必要です。次の手順で、酵母のフォームを使用してください。 </li><li>次にPBS 5 mlで15 mlコニカルチューブを準備する。 H.のコロニーを収穫BHI血液寒天プレートからcapsulatum（株Hcは ATCC G217B）[グルコース10g / Lの、システイン0.1g / Lの、ペニシリン-ストレプトマイシン1％、ヒツジ赤血球を50ml / L（コロラド血清（株）、コロラド州、米国） ] 37℃で培養または-80℃で凍結した酵母株からアリコートを取り、PBSに追加します。激しくボルテックス細胞を、室温で10分間1100 × gで間遠心します。慎重にペレットが剥がれないように上清を除去し、新鮮なPBS 10mlのを追加します。この手順を3回繰り返します。 50 mLコニカルチューブにPBSとトランスファーの5mLの中に細胞を懸濁する。 </li><li>凝集細胞を破壊するために、26 G1 / 2針を介して酵母の細胞懸濁液を渡すuはバイオセーフティキャビネット（顔の保護を使って）に10mLのシリンジを5回歌う。小さい、均一サイズの酵母を分離するには、室温で1分間を55 × gで細胞を遠心分離し、上位1 mlを削除します。 </li><li> 、16グラム/ Lグルコースを添加したHAM F12培地（GIBCO）を100 mlを含む滅菌三角フラスコに細胞懸濁液を追加して1グラム/ Lグルタミン酸、8.4mg / Lシスチン、6グラム/ Lグルタミン酸、その後37℃で細胞を育てる揺れ150rpmでインキュベーターで48時間° C。 </li></ol> 2。モノクローナル抗体のハイブリドーマの増殖と精製<ol><li> 10％ウシ胎児血清、10％のNCTC、1％非必須アミノ酸、1％ペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEM培地に選択したハイブリドーマを転送する。 37℃で5-7日間細胞培養フラスコ（ベクトンディッキンソン）で細胞を成長させる℃/ 5％CO 2。 </li><li>その後、室温で10分間、1100 × gで培地を遠心し、ペレットを中断することなく、すべての上清を集める。 </li><li>次に、FPLCによってプロテインA / G樹脂を用いて無細胞上清を精製する。 </li><li>モノクローナル抗体の濃度は、標準としてのIgGアイソタイプコントロール（図1B）を使用してキャプチャELISA（1）によって計算することができます。 </li></ol> （3） ヒストプラスマカプスラーツムの 接種の準備 <ol><li> HAM F - 12培地で増殖させた48時間ヒストプラスマカプスラーツム （株Hcは ATCC G217B）酵母の相の文化を取る。 </li><li> 10分1100 xgで細胞を遠心分離します。上清を捨て、新しいPBSを加える。 </li><li> 3.2の手順を3回繰り返します。 </li><li>注射器を使用して26G1 / 2針を通して酵母の細胞懸濁液を5回渡す。 </li><li>ペレット残留細胞のクラスターへ1分、55 × gで懸濁液を遠心分離します。新しいチューブに単一の細胞懸濁液を含む上清を移す。 </li><li>血球計数器を用いて、単一の細胞懸濁液を列挙する。 </li><li> &lt;50μL（図2）のサスペンションで1.25 × 10 7酵母（生存）または5.0 × 10 6（CFU、サイトカイン及び組織学を）達成するために、細胞濃度を調整します。 </li></ol> 4。モノクローナル抗体の腹腔内投与<ol><li>尾と首の首筋（図3A）でマウスを拾う。できるだけtheears（;図3Bと3Cマウスはそれを扱う人を噛まないようにその頭をcannotturnように、十分な皮膚を取ることを確認してください）​​に近いとして、その首の首筋でマウスを固定化する。 </li><li>そっと手のひら（図3D）押し付けテールwiththe小指を安定させる。 </li><li>注入前に血液を探すために吸引する綿棒針を置く前に70％エタノールで注入領域と。 </li><li>で、thelowerの左または右下腹部（腹腔内腔）に500μgを（PBS、アイソタイプコントロール抗体またはモノクローナル抗体1mLのPBSで希釈し、テストする）を含む抗体溶液を注入するために皮膚とabdominalmusclesをpiercetheする26G1 / 2を使用ダイヤフラムandother内臓（図3E）をしないように注意しながら下の位置に頭の中で動物、。 </li><li> needletoが漏れの可能性を減らす撤退する前にしばらく待って。 </li><li>次のステップに進む前に二時間以上待つ。 </li></ol> 5。マウスの麻酔と鼻腔内感染症<ol><li>は100 mg / kg及び10 mg / kgを、それぞれでケタミンとキシラジンを使用して麻酔を準備します。腹腔内のPBSを投与、アイソタイプコントロール抗体、またはそれに関するプロトコルで説明されているように実験的な抗体を実行します。マウスを麻酔し、鼻腔感染症に進む前に、モノクローナル抗体の注射後2時間待機する。 それぞれ100 mg / kgおよび10 mg / kgを、（7）で、ケタミンとキシラジンを使用して麻酔を準備します。 </li><li> 2H待機期間中は、添付の書かれたプロトコルで説明されているヒストプラスマcapsulumの接種を準備する。 </li><li> itens 5.1から5.5にしたがって進んでください。ピンセットで動物を挟まないようTOEと反射がないことを確認し、麻酔が働いていることを確認する。anaesthetization後、軽くナイロンや綿の文字列にその前歯でマウスを中断。動物を中断するために文字列を結びつけるために2列のスタンドを使用してください。 </li><li>密接にマウスの呼吸数をモニターしながら徐々にマイクロピペットを用いてナーレに約50μl接種を管理する。マウスは、動物の肺（図3F）に酵母の沈着を促進するために、鼻腔内感染後2〜5分間のためにこの姿勢で休息することができます。 </li><li>マウスが感染された後、必要に応じて、麻酔から回復するまで慎重に、ヒートランプを利用し、監視し、暖かい環境（25〜37℃間の温度）でマウスを維持する。ときにマウスの目を覚まし、食物と水に随意アクセス権を持つクリーンなケージに戻します。 ケージは私たちの動物施設に戻されるときれいな動物室（BLSI）に保管されている。 </li></ol> 6。生存学<ol><li>頻呼吸、嗜眠、鈍麻、および体重減少のために臨床的に感染したとモック感染動物を評価する。動物は、実験室のメンバーと動物の世話で毎日が毎日二度チェックする必要があります。 </li><li>マウスヒストプラスマ症で、人生の終わり近くになるまで、呼吸数の軽度の増加以外の感染の明らかな兆候は、通常ありません。 通常10〜11日から起こる先進的な疾患で、マウスは著しくtachypneicになり、活動減退している。通常、彼らは急速に瀕死状態になると期限切れになります。 </li><li>苦しめられた動物は、専用のチャンバー内のCO 2を適切に安楽死されるべきである、死亡動物は毎日列挙すべきである。 </li></ol> 7。 CFU学、組織学およびサイトカインの研究<ol><li>収集する各臓器に対して10mLのPBSで15 mlコニカルチューブを準備します。 </li><li>前述のように亜致死inuculum（5.0 × 10 6）を持つ動物7と感染後14日を安楽死させるとすぐに肺、脾臓と肝臓を取り除く。 </li><li>評価される臓器の一部を削除し、ホルマリンで一晩固定を行います。セクションは、病理学的評価のための顕微鏡で検査されます。 </li><li> 5mLのPBSで50 mlコニカルチューブを準備するには、均質化するために各臓器に対して70μmのセルストレーナーをトッピング。滅菌5mLのシリンジのプランジャを使用して50 mLチューブに別々の臓器の残りの各部分を痩せ衰えさせる。 </li><li>次に、シリアルBHI血液寒天プレート（2）で臓器のホモジネート（1:100、1:1000と1:5000）と各希釈のプレートで100μLに希釈します。 </li><li>製造者の指示（Roche社、ドイツ）にしたがってホモジネートするプロテアーゼ阻害剤の錠剤を追加。 </li><li> ° C 14日間および列挙外装フィルムの上まで、37でプレートをインキュベートする。 </li><li> 10分間4000xgで臓器のホモジネートを遠心し、臓器の上清を除去、シューッという音は、メーカーによると、標準的な方法によって実行されるサイトカインのアッセイで使用で使用されます。 </li></ol> 8。 H.に対するモノクローナル抗体の保護Capsulatumは、抗体の特異性およびアイソタイプに依存しています<ol><li>モノクローナル抗体アイソタイプは、H.に対する保護において重要であるcapsulatumは 、HSP60にIgG1またはIgG2aのモノクローナル抗体を投与したマウスとしてHSP60またはいずれかのアイソタイプ対照mAbまたはPBS（図4）にIgG2bモノクローナル抗体を投与したマウスをコントロールと比較して有意に生存期間の延長を持っている。 </li><li>さらに、保護mAbを投与したマウスでは、7日目で肺と脾臓のCFUの数の大幅な削減があったと14日目（図5）で肺に酵母の数字の2と2.5対数単位の減少。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：H.の成長capsulatumとハイブリドーマ。 H.から得られた単一コロニーから（A）液体HAM F - 12培養の準備capsulatumは BHI血液寒天プレート上で増殖。 （B）蛋白質による細胞培養フラスコとモノクローナル抗体の精製のハイブリドーマの成長親和性のcromatographyを使用して、/ Gの樹脂。 <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：H.鼻腔内感染のcapsulatumの接種材料の準備。 H.後に得られた細胞懸濁液注射器や遠心分離によりcapsulatum凝集体の破壊を、血球計でカウントすることによって列挙されます。細胞濃度は&lt;50μLの1.25 × 10 7（生存実験）または5 × 10 6（外装フィルム、サイトカインや組織）に調整されます。 upload/2532/2532fig3.jpg"ALT ="図3"/&gt; 図3：モノクローナル抗体投与時のマウスの扱い。 （A）マウスは、尾部によって取得され、（BとC）theearsに近いとして、その首の首筋を保持することによって固定化されている。 （D）テールは、小指と手のひらの間に開催されます。 （E）抗体のソリューションは、26G1 / 2針を用いて注入されます。 （F）H. capsulatum接種を穏やかにナーレに細胞懸濁液をピペッティングにより鼻腔内に投与される。 <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4：HSP60へのモノクローナル抗体はヒストプラズマ症の病因を変更することができます。 IgG1の500μgの、またはIgG2aモノクローナル抗体2時間前に感染症大幅に生存期間の延長に（P &lt;0.05、対照と比較して）、しかしIgG2bモノクローナル抗体でIP注射。 <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5：7〜14日目の肺のCFUの決定HSP60または無関係な抗体に選択されたモノクローナル抗体でIPを投与したマウスの5 × 10 6 Hcが酵母による致死鼻腔内チャレンジ後には、IgG1およびIgG2aのための真菌負担の減少は、処理された動物のモノクローナル抗体を示した。黒いバーは、7日目と白のバーでの外装フィルムの上から14日後に感染（* 7日間でp &lt;0.001及び** P &lt;0.001の14日後の感染で）を表す。

<ol><li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li>
<li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介するプロトコールは、モノクローナル抗体がH.するということを示していますcapsulatumは、実験マウスヒストプラズマ症のコースを変更することができます。病原体の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体は、宿主と病原体の相互作用中に発生する複雑なダイナミクスを変更することができます。本研究では、腹腔内注射したときmAbが致死ヒストプラズマ症のマウスモデルにおける保護を仲介すること確立し、それはそのようなH2B、Mの抗原（カタラーゼ表面）（3）とHSP60などのワクチン開発のための候補タンパク質を、示唆している。 in vivoで、HcはHSP60とH2Bの保護mAbの投与は、臓器真菌負担と炎症や感染マウスの生存期間の延長を減少させた。 もののH.のためのワクチン開発彼らは必ずしも免疫応答を調整することができないためcapsulatumは研究の刺激的な領域である、予防接種は、免疫低下個体における、効果がない場合があります。したがって、この集団はH.するmAbを主に受動的な治療の恩恵を受...

<table border="1"><tbody><tr><th>マテリアルの名前</th><th>会社</th></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット（BSL2） </td><td></td></tr><tr><td> 15 mLコニカルチューブ</td><td>ファルコン、BD </td></tr><tr><td> HAM F - 12培地</td><td>ギブコ</td></tr><tr><td> 37℃シェーカー</td><td></td></tr><tr><td>渦</td><td></td></tr><tr><td> 50 mLコニカルチューブ</td><td>ファルコン、BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2針</td><td> BD </td></tr><tr><td> 10 mLの注射器</td><td> BD </td></tr><tr><td> 250mLのフラスコ</td><td></td></tr><tr><td> FPLC（ 高速タンパク質液体クロマトグラフィー ）システム</td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> ELISAリーダー</td><td> BioTekの</td></tr><tr><td>麻酔（ケタミンおよびキシラジン） </td><td></td></tr><tr><td>カラムスタンド</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンストリング</td><td></td></tr><tr><td>熱ランプ</td><td></td></tr><tr><td> 70μmセルストレーナー</td><td>ファルコン、BD </td></tr><tr><td> BHI寒天プレート</td><td>ギブコ</td></tr></tbody></table>

に対するモノクローナル抗体の受動的な管理 h. capsulatumとその他の真菌病原体

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

この方法論の利用目的は、抗体または真菌ヒストプラスマカプスラーツム 、2）治療の標的として、病原性因子の役割を検討することによって引き起こされるヒストプラズマ症を予防または治療用ワクチンを持つ個人を保護するために私たちの能力を前進させる）1です。モノクローナル抗体を生成するには、マウスを免疫し、免疫応答は、私たちの研究室で開発された固相ELISAシステムを用いて評価され、最高の応答者のマウスハイブリドーマ細胞との融合の脾細胞の単離のために選択されています。 C57BL / 6マウスは広範囲にH.を研究するために使用されているcapsulatum病因と必要なデータを取得するための最良のモデルを提供しています。感染症におけるモノクローナル抗体の役割を評価するためには、マウス腹腔内には、H.するモノクローナル抗体のいずれかで投与されていますcapsulatumまたはアイソタイプは、静脈内（IV）、腹腔内（ip）、または鼻腔内（の）路線で対照mAbを一致して感染する。科学文献では、マウスの真菌感染症に対するモノクローナル抗体の有効性は、以前の時点でコロニーのforminユニット（CFU）の評価と組み合わせて、エンドポイントとして死亡率に依存しています。彼らは最高の人間の病気を表すように生存（死亡までの時間）の研究が必要である。したがって、我々の介入の有効性は十分に生存曲線なしで確立されませんでした。これは、ワクチンや病原性変異体のテストの有効性を確立する場合も同様です。ヒストプラスマ症で、マウスは、しばしば数時間以上の死者への精力的であることから行く。そのような抗体の投与等の介入の容量は最初に病気から動物を保護することがありますが、病気が短いCFUの実験で再発を実現できないということができる。生存と真菌負担アッセイに加えて、我々は感染症（組織、細胞の採用、サイトカイン応答）に炎症反応を調べる。生存/死の実験に時間のために、マウスは罹患率の兆候を少なくとも1日2回感染して監視されます。真菌の負担、組織病理学、およびサイトカイン応答を評価するために、マウスは感染後の様々な時点で安楽死されています。動物実験は医学のアルバートアインシュタイン大学の動物学研究所のガイドラインにしたがって実行されます。

C57BL / 6マウスがHcの病因を研究し、最適なモデルを提供するために使用されています。我々は、この菌に対する体液性免疫の潜在的な利点を模索し、[ヒストンH2Bと熱ショック蛋白質の60kDaへ]いくつかのモノクローナル抗体を生成している我々は腹腔内投与後、その予防効果を試験すること。

に対するモノクローナル抗体の受動的な管理 H. capsulatumとその他の真菌病原体

本手法を用いる目的は、1）抗体またはワクチンを用いて、...を予防または治療することにより、個体を保護する能力を高めることであり、...

本手順の全体的な目的は、ヒストプラズマ症を予防または治療するための抗体やワクチンによって個体を保護する能力を高め、疾患の病原性における毒性因子の役割を検討することである。これは、まず標的抗原に対するモノクローナル抗体を単離し、特性評価を行うことで達成される。本手順の第2ステップでは、選択したモノクローナル抗体を、経鼻感染の2時間前に腹腔内投与する。これらの分子が全身に分布する時間を確保するため、手順の3番目のステップとして、マウスを麻酔し、目的の接種物を経鼻的に感染させます。手順の最終ステップは、動物の健康状態をモニタリングすることです。動物は、真菌量および炎症反応を評価するためにさまざまな間隔で安楽死させるか、あるいは生存率の追跡調査を行います。最終的に、致死量に感染させたマウスに感染前に保護的なモノクローナル抗体を腹腔内投与することで、生存期間の延長および罹患臓器における病理学的反応の変化を示す結果を得ることができます。本手順のデモンストレーションは、真菌の病原性および動物感染モデルにおいて豊富な経験を持つ博士研究員のAlly Emerが行います。抗真菌薬などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、モノクローナル抗体が宿主の潜在的因子を介して作用する特性を持つ分子であることです。疾患に対する反応を視覚的に実証することは、本手法において極めて重要です。モノクローナル抗体の投与および経鼻感染のステップは、動物の取り扱いに関する専門知識を必要とするため、習得が困難です。漂白剤でキャビネットを清浄し、続いてUV照射を行うことで、酵母形態の真菌を取り扱うためのバイオセーフティレベル2キャビネットを準備します。15 mLコニカルチューブに5 mLのPBSを準備します。-80 °Cで凍結保存されたストック分注液からH caps AUMのコロニーを回収し、PBSを用いてボルテックスします。細胞を激しく攪拌し、1100 ×gで10分間遠心分離します。室温にて、ペレットを乱さないように注意して上清を除去し、少なくとも10 mLの新鮮なPBSを加えます。最終洗浄後、この手順を3回繰り返します。細胞を5 mLのPBSに再懸濁します。すべての洗浄は室温で行ってください。凝集した細胞を分散させるため、10 mLシリンジを用いて26ゲージの1/2インチ針で酵母細胞を5回通過させ、50 mLコニカルチューブに回収します。サイズが均一で小さい酵母を単離するためには、細胞を 55 ×g で1分間遠心分離し、上清の 1 mL を取り除きます。この細胞懸濁液を、100 mL の HAM-F12 培地を含む滅菌済みの 250 mL ガラス製エルレンマイヤーフラスコに加え、室温の二酸化炭素濃度で振とう装置を備えたインキュベーター内で 37 °C で 48 時間培養します。この培養液を接種源の調製に使用し、次ステップで作製されるモノクローナル抗体の有効性を評価します。選択したハイブリドーマをDMEM中で5〜7日間培養します。インキュベーション後、細胞培養フラスコからすべての培地を回収して抗体を回収し、その後、培地を1100 ×gで10分間遠心分離します。酵母細胞と同様に、抗体は室温で洗浄することが可能です。ペレットを乱さないように上清を回収します。次に、F-P-L-C-AキャプチャーによるProtein AGレジンを用いて、細胞除去上清を精製します。精製した抗体をどの程度注入すべきかを決定するため、Eli SAを用いてモノクローナル抗体濃度を算出します。付属の書面プロトコルに従い、PBSアイソタイプコントロール抗体または実験用抗体を腹腔内に投与します。モノクローナル抗体の注入後、マウスを麻酔して経鼻感染に進むまで2時間待ちます。待機時間中に、付属の書面プロトコルに従ってHistoplasma capsulatum接種液を調製し、2つのクランプスタンドの間にナイロン製または綿製の紐をきつく結び、スタンドを離して紐を張ることで、マウスへの感染に使用する紐装置を組み立てます。麻酔薬としてケタミン 100 mg/kgおよびキシラジン 10 mg/kgを用意します。抗体が十分に拡散する時間を置いた後、このタイミングで調製することが可能です。マウスに麻酔を施し、足指への刺激に対する反応がないことを確認して鎮静状態であることを確かめてください。ピンセットでつまみます。マウスの前歯をそっと掴み、紐に吊り下げます。マイクロピペットを使用して、約50 µLの接種液を気管内にゆっくりと投与します。マウスの呼吸数を注意深くモニタリングしながら、経鼻感染させた後、酵母が肺に沈着しやすいよう、この状態で2～5分間安静にします。麻酔から回復するまで、必要に応じてヒートランプを慎重に使用し、管理された温暖な環境下でマウスを維持してください。マウスが覚醒したら、清潔なケージに戻します。餌と水は自由摂取（ad libido）とし、感染動物および模擬感染動物の臨床評価を行います。頻呼吸、嗜眠、および体重減少の有無を確認するため、研究員は1日2回、飼育員は1日1回、動物の状態をチェックしてください。終末期に至るまでの慢性ヒストプラズマ症では、呼吸数のわずかな増加以外に、感染の明らかな兆候は見られないのが一般的です。疾患が進行すると、マウスは著しく痩せ細り、活動性が低下します。通常、その後急速に状態が悪化し、死亡に至ります。苦痛状態にある動物は、専用のチャンバー内で二酸化炭素を用いて適切に安楽死させる必要があります。足指への刺激に対する反射反応の消失によって死亡を確認し、安楽死させた動物の数は毎日記録してください。回収する臓器ごとに、10 mLのPBSを入れた15 mLコニカルチューブを用意します。以前に示した通り、5 × 10⁶の亜致死量接種液を感染させた動物を安楽死させ、直ちに肺、脾臓、および肝臓を摘出します。5 mLのPBSを入れた50 mLコニカルチューブを用意します。ホモジナイズする各臓器用に、70 µmのセルストレーナーをセットしたペトリ皿を用意します。各臓器を5 mLプランジャーで個別に磨砕し、50 mLチューブに移します。次に、臓器ホモジネートを1:100、1:1,000、1:5,000の3段階で段階希釈し、その100 µLをBHI培地に播種します。血液寒天培地を用いて、通常の室温レベルの二酸化炭素濃度に設定したインキュベーター内でプレートを37°Cで最大14日間培養し、モノクローナル抗体のCFUを計測します。HCAPsに対する防御においてはアイソタイプが極めて重要であり、HSP 60に対するIgG1またはIgG2aモノクローナル抗体で処理したマウスは、HSP 60に対するIgG2bモノクローナル抗体、アイソタイプコントロールモノクローナル抗体、またはPBSを投与したコントロールマウスと比較して、生存期間が有意に延長しました。さらに、防御的なモノクローナル抗体を投与したマウスでは、7日目の肺および脾臓におけるCFU数が有意に減少し、14日目の肺における酵母数は2および2.5 logユニット減少しました。本手順の後、コロニー形成単位を示す真菌負荷の測定や、感染に関与するサイトカインの解析、および組織形態の評価などの他の手法を実施することで、抗体による疾患修飾の作用機序の解明など、さらなる疑問に対する検討を行うことができます。ノックアウトマウスを取り扱う際は、生物学的安全条件の下で作業すること、および鼻腔内感染については動物愛護規定に従って作業することが重要です。

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このビデオは、マウスモデルで実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するための抗原アジュバントエマルジョンを生成する効率的な均質化技術を示しています。このエマルジョンは、水相に自己抗原であるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)を含み、不活化病原菌を含む連続的な油相に囲まれています。エマルジョンは、抗原の持続的な放出を確保し、免疫応答を持続させます。...

自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原アジュバントエマルジョンの調製

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、多発性硬化症の確立された動物モデルである。 C57BL / 6マウスは、中枢神経系における自己反応性免疫細胞によって引き起こさ昇順弛緩性麻痺をもたらす、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）ペプチド35-55（MOG 35-55）で免疫する。疾患の誘導およびモニタリングのためのプロトコルを説明する。...

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG<sub&gt; 35〜55</sub&gt;）C57BL / 6マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘発

ハイブリドーマ技術に基づくモノクローナル抗体の生成に最適化されたプロトコールが提示されます。マウスを免疫複合体で免疫した。脾臓細胞は、不死性骨髄腫細胞とPEGおよび電気インパルスによって融合されました。抗体産生ハイブリドーマ細胞は、HATおよび抗原特異的ELISAスクリーニングによって選択されました。...

ハイブリドーマ技術によってマウスモノクローナル抗体の作製

準備および様々 なイムノアッセイ用天然物に対するモノクローナル抗体の評価のための詳しいプロトコルを説明します。この手順には、予防接種、細胞融合、スクリーニング、肯定的なクローンとモノクローナルハイブリドーマ準備のため間接競合 elisa 法が含まれています。MALDI TOF MS と ELISA...

天然物に対するモノクローナル抗体の作製

本稿は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するプロトコルを提示する。中枢神経系(CNS)における浸潤リンパ球の単離および特徴付けの方法も提示され、リンパ球がCNS自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを示す。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

このプロトコルは、マウスにプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)を誘発するための手順を概説しています。この方法は、マウスモデルシステムで信頼性が高く堅牢な眼の炎症を引き起こすのに役立つ手順を概説します。このプロトコルを使用して、免疫学的、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスアッセイでさらに評価するために、単一の動物からブドウ眼と炎症を起こしていない仲間の目を生成しました。...

感染後ブドウ膜炎のモデルとしてのプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)

多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するために、マウスを自己抗原および完全なフロイントアジュバントを含む油中水型エマルジョンで免疫する。これらのエマルジョンの調製にはいくつかのプロトコルがありますが、ここでは、エマルジョン調製のための迅速で単純で標準化された均質化プロトコルを示します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原/アジュバントエマルジョンを調製するための迅速、簡便、標準化されたホモジナイズ法

ここでは、加熱死菌菌アビウム亜種パラ結核を含む不完全フロイントアジュバントに懸濁した免疫原性エピトープミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)35-55を使用して、C57BL/6マウスで実験的自己免疫性脳脊髄炎を積極的に誘導するための代替プロトコルを提示します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における自己抗原の免疫原性増強における 抗酸菌パラ結核の アジュバント活性

免疫適格マウスを気管内に接種するための寒天ビーズ包埋 型マイコバクテリウム膿瘍 の調製

学ぶヒストプラズマ症に対するモノクローナル抗体の受動的免疫療法。C57BL/6マウスを用いて抗体の保護効果と真菌負荷の減少を評価し、体液性免疫による治療戦略の可能性を探索する。

に対するモノクローナル抗体の受動的な管理 H. capsulatumとその他の真菌病原体

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