Name: マウス膀胱癌の同所性モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶマウス膀胱癌の同所性モデル構築法。カテーテル挿入と電気焼灼による局所熱傷を利用し、MB49細胞を膀胱壁に接着させる手法。最小侵襲で動物福祉を考慮した再現性の高い膀胱がん研究モデルを確立する。

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この作品は、全米科学財団のキャリア賞（CBET - 0846395）と比較医学科、Tulane大学によって資金を供給された。

1。動物<ol><li>雌C57BL/6J、マウス（ ハツカネズミ ） は出荷前にベンダーによって17ネズミのウイルスに感染外部寄生虫、寄生虫endoparasites、および抗体の自由検証されます。マウスは実験動物の管理と利用のためのガイドに従い、Tulane大学のAAALAC認定の動物施設に収容されています1。 </li><li>具体的には、マウスは、広葉樹の寝具で個別に換気されたポリカーボネートcageswithのmicroisolationフィルタートップに収容されたグループ（4-5匹/ケージ）です。彼らはアドリブでペレット化げっ歯類の食品や水道水を提供しています。 </li><li>マウスは、7日間は、研究開始前に順応さが許可されます。 </li></ol> 2。細胞<ol><li>マウス移行上皮癌細胞株MB49は、膀胱腫瘍を生成するために使用されます。 </li><li>細胞は、10％ウシ胎児血清、100単位/ mlペニシリン、および100単位/ mlストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養されています。 </li><li>培養は37℃とメディアの変化と、5％CO 2、2〜3日間維持されます。 </li></ol> 3。動物同所性腫瘍モデルここで説明する膀胱腫瘍モデルの点眼ギュンターらによって記載された手順の変更です。2 <ol><li>麻酔は酸素にイソフルラン2％（MWI / VetOne、メリディアン、ID、カタログ番号501017）で誘導し、0.75から1.25パーセントに維持されている。 （複数の動物をイソフルラン濃度の上昇を必要となる、これを同時に治療することができます。）角膜乾燥を防ぐために、目には人工涙液の眼軟膏で潤滑されています。体の熱は、紙のドレープの下で加熱パッドで維持されます。 </li><li>腰の毛皮は、金属製の接地板との接触を促進するためにクリップされて、そして剃毛面積はelectroconductionゲルでコーティングされています。 </li><li>各マウスは、個別に金属の接地板上に背recumbancyに置かれ、膀胱は尿道、3 / 4インチ、店頭針IVのカテーテルが除去スタイレットで潤滑、24ゲージを使用してカテーテルをしています。 </li><li>膀胱は、尿から排出される、と白金線は、カテーテルの両端に導線が残して膀胱にカテーテルを通して挿入される - カテーテルの内腔の端の約2 mm。ワイヤーは、プラチナのために酸化に対する材料の抵抗で作られています。 </li><li> 2.5 Wの現在は、凝固に設定された電気焼灼器ユニットと線の外側部分に触れて、約0.5秒のために膀胱に適用されます。 </li><li>ワイヤーは、膀胱内の別の場所や適用別の2.5 Wの充電に移動されます。 </li><li>線は削除され、1 × 10 6細胞/ mlの濃度でMB49細胞の100μlを1ミリリットルシリンジを介して膀胱内にカテーテルを介して染み込ませています。 </li><li>シリンジは、細胞懸濁液の流出を防ぐために、カテーテルに接続されたままになり、カテーテルを挿入したマウスは、細胞が火傷のサイトに接続できるように90分間麻酔下で維持されています。 </li><li>無菌生理食塩水の100〜200μlのは、リカバリの前に、各マウスにIP注射によって投与される。 </li><li>潜伏期間の終了時にカテーテルが除去され、動物は、マウスは自分のホームケージに戻される時点で、立直り反射戻り、まで加熱されたパッドの上に回復するために許可されています。 </li></ol> 4。超音波検査<ol><li>腫瘍はマウスは腫瘍の成長を監視するために膀胱の超音波検査を受ける前に3-5日のために拡張されます。 </li><li>上記のような初期の超音波検査の場合、動物は麻酔する。マウスは、背側recumbancyに配置され、腹部の皮膚は、毛皮をクリッピングすることによって調製される。 </li><li> 24ゲージ静脈カテーテルを膀胱に尿道に挿入されます。この時点で、膀胱を排出し、尿は、さらなる分析のために収集することができます。 </li><li>無菌生理食塩水100μlの超音波検査で膀胱の視認性を向上させるためにカテーテルを介して膀胱に滴下される。 </li><li>超音波伝導ゲルを腹部に適用され、超音波検査は、膀胱壁と内腔を評価するために実行されます。 </li></ol> 5。代表的な結果： 腫瘍組織はinnoculation後3-5日表示されるようになります。 5日目で - 私たちの経験では、12匹のマウスの群で、より日常的に50％以上は、（1.0μL、V =π/ 6 · L · W · Hを使用して、0.5）膀胱内で検出可能な組織の塊を持っている。メガバイト49細胞を使用する場合は、腫瘍のサイズは増大し続け、マウスは未処理行けば安楽死は、24日目で必要となります。マウスは、無気力や悪液質になったときに安楽死が推奨されて、フリルの毛皮、ハンチング、および無応答の動作、またはときに彼らは彼らの初期の体重の20％を失うが表示されます。&lt;/ P&gt; 腫瘍は急速に成長し、発展途上腫瘍の細胞が血管新生の血液供給によって保守することができるものよりも速く増殖するので、彼らは表向きは200ミリグラム以上、3のマスに到達した後に壊死のセンターを持つことになります。一つは、また間接的におそらく発展途上腫瘍内に急速な血管新生に関連しているhematurea、のレベルを介して腫瘍の進行を監視することができます。それは一貫して未治療の腫瘍を有するマウスの尿は14日目で血液が含まれていることが指摘された。赤血球の濃度は、これらのマウスでは、時間の経過とともに増加する現れ、尿の量が減少集めた。 50 mgを超える腫瘍はまた、典型的に14日後のinnoculationによって、比較的容易に触診できる。

<ol><li>Institute of Laboratory Animal Resources. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).</li>
<li>Gunther, J. H., Jurczok, A., Wulf, T., Brandau, S., Deinert, I., Jocham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+%28MB49%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49).</a> Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).</li>
<li>Zhang, X., Atala, A., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression-targeted+gene+therapy+for+the+treatment+of+transitional+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Expression-targeted gene therapy for the treatment of transitional cell carcinoma.</a> Cancer Gene Ther. 15, 543-552 (2008).</li>
</ol>

動物実験は、Tulane大学のインスティテューショナルケアと使用委員会によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。

異なる結果が予想される必要がありますが、雌マウスに同所性膀胱腫瘍を確立するのこの低侵襲法は、MB49以外の細胞型に対しても適用できます。あまり積極的な腫瘍細胞が使用されている場合、（新たな最適条件を確立するために0.5 W刻みを使用して）わずかにワット数を大きくすると、腫瘍細胞の接着に、より従順エリアをもたらすでしょう、と染み込ませ、細胞のための長い膀胱のインキュベーション時間は、より多くの量のを得られますやけどのサイト（未発表データ）での細胞接着。一部のプロトコルは、電気焼灼、2を介して10 Wを実現するお勧めしますがこれだけの電力が上限を考慮すべきである、とおそらく完全に避けること。他の細胞型が使用されているときに配信細胞の濃度を増加させることも成功のチャンスを増やすことができます。

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6J マウス</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>3-5週齢</td></tr><tr><td>ポリカーボネート製ケージおよび換気ラック</td><td>Lab Products</td><td>Super Mouse 750</td><td>327mm x&lt;br/&gt;190mm x&lt;br/&gt;143mm</td></tr><tr><td>ハードウッド製敷材</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Laboratory &amp;#8211;grade SaniChips</td><td></td></tr><tr><td>げっ歯類用飼料</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Rodent Diet 2019</td><td></td></tr><tr><td>静脈カテーテル</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>009231</td><td>24 G x &amp;#190; in. </td></tr><tr><td>電気焼灼装置</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>Aaron 900</td><td></td></tr><tr><td>超音波診断装置</td><td>Sonosite</td><td>180 Plus (Vet)</td><td></td></tr><tr><td>MB49細胞株</td><td>Wake Forest University Baptist Medical Center</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100106 500A57B</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス膀胱癌の同所性モデル

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

この簡単な手順では、膀胱腫瘍は、カテーテルの使用、地元の焼灼、およびその後の細胞接着を介して雌C57マウスで確立されています。彼らの膀胱は尿道カテーテルを挿入し、排水された後、動物は再び尿道や膀胱を損傷することなく、膀胱に白金線の挿入を可能にするためにカテーテルをされています。カテーテルは、火傷を作成するために膀胱内に電流を導通されるワイヤーのための絶縁体として機能するようにテフロンで作られています。電気焼灼器ユニットは、細胞外の層を離れて燃焼し、その後のカテーテルを通して膀胱に懸濁液に配信される癌細胞のための付着部位を提供し、ワイヤの露出終わりに2.5W提供する目的で使用されます。細胞は、カテーテルを除去した後、90分間膀胱、そして自然に排出することを許可膀胱内に残ります。腫瘍の発達は、超音波を介して監視されます。特定の注意は、添付のビデオではカテーテル挿入のテクニックに支払われます。

膀胱腫瘍は、カテーテル、局所焼灼、および火傷のサイトへの癌細胞のその後の付着を介して低侵襲的にメスのマウスで確立されている。

この簡便な手順では、カテーテル挿入、局所焼灼、および...を用いて、雌のC57マウスに膀胱腫瘍を誘発します。

私はWT Godbe教授です。Georgina Dobe博士と共に、マウス膀胱癌の正位移植モデルを構築する方法をご紹介します。まず、本処置に向けた動物の準備手順から説明します。本日使用するマウスは、Jackson Laboratoriesから購入した雌のC57BL/6です。カテーテル挿入が容易であるため、雌を選択しました。週齢3～5週で、体重が通常16～20 gの範囲にあるマウスを使用し、酸素流量0.8～1 L/min、イソフルラン濃度2%に設定した人工呼吸器を用いて麻酔をかけました。角膜の乾燥を防ぐため、呼吸数は常にモニターしました。1時間半以上かかるこの処置の間、人工涙液点眼軟膏を眼上に直接塗布して眼内に塗り込み、眼を潤します。また、電気焼灼術中に使用する金属接地プレートとの接触を促すため、腰背部の被毛を刈り取ります。この電気焼灼術によって、膀胱内に熱傷部位を形成します。この焼灼部位は、膀胱腔内に導入された腫瘍細胞の接着点として機能します。本プロトコルで用いるその他の手法はカテーテル挿入に大きく依存しており、ここでは24ゲージのIVカテーテルを使用します。スタイラスを安全に取り除いて廃棄した後、尿道への損傷を防ぎ、挿入を容易にするために、KYゼリーやアストログライドなどの潤滑剤でカテーテルのシースを潤滑します。カテーテル挿入の際は、鉗子で外陰部を固定します。カテーテルを挿入する際、尿道への配慮を伴うカテーテル挿入手技が必要となるため、ここではその詳細を説明します。術野をより明確にするため、外科用ループの使用を推奨します。ここでは、マウスの骨盤外解剖図を示しています。外尿道口を囲む陰門を指し示しています。カテーテル挿入を行う際、構造物の中央に挿入しようとする傾向がありますが、尿道口は底側に位置しています。構造物を優しく転がして上方へ押し出し尿道へのアクセスを容易にするよりも、鉗子で陰茎を把持した方が簡単であることが分かりました。尿道口の直下にある膣にカテーテルを挿入しないよう注意してください。注意すべきもう一つのパラメータは、カテーテル挿入の角度です。通常は、動物の縦軸に対して平行に真っ直ぐ挿入しがちですが、最初の一挿入の後に角度を急にした方が、カテーテルの挿入が多少容易になります。その後、カテーテル挿入の角度を浅くすることで、動物への外傷を防ぐことができます。ここでは、Beck博士が急角度で挿入しています。カテーテルは外陰部の底部から挿入される点に注目してください。カテーテルをひねることで尿道を潤滑にし、挿入を容易にできる場合があります。最初に挿入した後、角度を緩やかにすることで、直接膀胱へと挿入することが可能です。熟練者が行う場合にどれほどの時間を要するかにご注目ください。ただし、すべての挿入にこれほどの時間がかかるわけではありません。ここでは、最善の

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