拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価

この手順の全体的な目的は、大量のヒトNK細胞を迅速に増殖させることです。まず、バフィーコートまたは全血サンプルからp BMCsまたはNK細胞を単離します。次に、NK細胞増殖において、pbmcを人工抗原提示細胞とともに共培養します。

IL-2を添加した培地を用い、週1回のaPCによる刺激を行いながら、NK細胞数を1 × 10⁶ cells/mL未満に維持して3週間培養します。最終的に、非放射性細胞毒性アッセイを用いて、増殖させたNK細胞の機能的有効性を検証します。この増殖法による典型的なNK細胞の収量は、21日目の時点で中央値21,000倍の増殖となり、カルシウム放出アッセイで判定したところ、様々な腫瘍に対して高い細胞毒性を示すことが確認されました。

NK細胞の分野では、歴史的に大量のNK細胞を得ることが非常に困難であったため、本医学的手法は重要な疑問への回答に寄与します。本技術は、治療に十分な量のNK細胞を生成することが従来困難であったことから、ヒト癌の免疫療法に影響を与えるものです。本手法の実演は、当研究室のシニアリサーチアシスタントであるCecilyが行い、健康なドナーの血液からPBMCsを回収します。

通常、血液銀行のバフィーコートがソースとして使用されます。まず、PBSを加えてバフィーコートの容量を140 millilitersに調整します。次に、35 millilitersのサンプルを15 millilitersのfial PAの上に重ね、密度勾配遠心分離機を用いて400 Gで20分間遠心分離します。

破砕させないように注意しながら、フィコール（Ficoll）と血漿の界面からPBMCを注意深く回収し、赤血球の入ったチューブは後で使用するために取り分けておきます。PBMCをPBSで3回洗浄し、その都度400 Gで10分間遠心分離します。

この分画のP BMCsをNK細胞の増殖に使用します。次に、密度勾配チューブに戻ります。上層を吸引して取り除きます。

RBCsを2本の50 milliliter遠心チューブに移し、50 milliliterの標線までPBSを加えて洗浄します。遠心分離後、RBC層の上部をすくい取るようにして上清を吸引除去します。これにより顆粒球を除去します。

3回洗浄を行い、その後、同量のelse's solutionでRBCsを再懸濁し、4 °Cで最大1ヶ月間保存します。このRBC画分は、2週間の拡大培養の終了時に、NK細胞のroset SEP精製に使用できます。機能的なNK細胞をex vivoで効率的に拡大させるために、膜結合型IL 21を発現するK 5 62クローン9細胞（以下、K 5 62と表記）を使用します。

人工抗原提示細胞としてClone nine IL 21を使用します。まずPBMCをカウントし、NK細胞増殖のために播種する5×10⁶個分となる容量を算出します。PBMC 5×10⁶個に対し、K 5 62 clone nine IL 21細胞 10×10⁶個をカウントし、ガンマ線照射装置を用いて100 Gyで照射します。照射済みの細胞は、将来的に使用するために凍結保存することも可能です。次に、照射済みの細胞をPBSで洗浄し、NK細胞増殖用培地に再懸濁します。

次に、照射した細胞とpbmcを2:1の比率で40 mLのNK細胞増殖培地に加え、T 75フラスコを37 °C、5% CO2のインキュベーター内に直立させて設置します。3日目に、400 ×gで5分間の遠心分離を行い、刺激した細胞を回収します。培地の半分を新鮮なNKEMに交換し、培養を継続します。5日目に再度培地交換を行います。1週間後、細胞数をカウントし、フローサイトメトリーによる表現型解析用に5×10⁵個の細胞を分取します。2回目の刺激に向けて、K 562細胞を1:1の比率でカウントし、照射します。

IL 21細胞を9個クローニングして細胞を拡大し、その後、総細胞数 2.5 × 10⁵ cells/mLとなるようにNK細胞拡大培地で混合します。次に、細胞をT 75フラスコに移し、培養を継続します。10日目と12日目に、NK細胞拡大培地を用いて 2.5 × 10⁵ cells/mLで細胞を継代します。拡大14日目に、再び細胞数を計測し、フローサイトメトリーでサンプルのフェノタイプを解析します。

ロゼットSEP精製プロトコルを用いて、このPBMC由来の細胞増殖物を精製し、フローサイトメトリーによるフェノタイプ解析でNK細胞の純度を確認します。精製されたNK細胞に対し、照射済みのK 5 62 clone nine IL 21細胞を1:1の比率で加えて3回目の刺激を行います。最終的に21日目に、完全なフェノタイプ解析用抗体パネルを用いたフローサイトメトリーにより、増幅させたNK細胞を解析します。

10% DMSOを含むFBSを用いて、最大密度5×10⁷ cells/vialで細胞ストックを凍結します。細胞傷害性試験には、新鮮なNK細胞または凍結保存されたNK細胞のいずれかを使用します。凍結NK細胞を使用する場合は、まずNK細胞のバイアルを融解し、試験当日に細胞を回復させるためNKEM中で24時間播種します。10⁶個のターゲット細胞をcalcium AMを含む1 mLのNKEMに再懸濁し、U底96ウェルプレートを用いて37 °Cで時々振盪しながら1時間インキュベートします。1×10⁶ cells/mLに懸濁したNK細胞200 µLを3連で加え、指示通りに細胞の連続希釈を行います。

1時間のカルシウムローディング後、標的細胞をNK細胞増殖培地で2回、400 Gで5分間遠心分離して洗浄します。次に、標的細胞を再度計数し、1 × 10⁵ cells/mLで再懸濁します。96ウェルプレートの各ウェルに標的細胞を100 µLずつ加え、100 Gで1分間遠心分離して細胞接触を開始させ、37 °C、5% CO2条件下で4時間インキュベートします。

遊離したカルシウムを均一に懸濁させるため、ピペッティングにより培養液を穏やかに混合し、100 Gで5分間遠心分離して細胞ペレットを作成した後、上清100 microlitersを新しい平底96ウェルプレートに移します。その際、気泡が入らないように注意し、必要に応じて細い針を用いて気泡を除去してください。励起フィルターを485 nanometers、蛍光フィルターを530 nanometersに設定した蛍光プレートリーダーを用いてプレートを測定します。

特異的溶血率を算出します。通常、バフィーコートから単離した5×10⁶個のPBMCを拡大培養すると、1×10⁹個から10¹⁰個のNK細胞が得られます。拡大培養されたNK細胞は、バフィーコート中の未拡大の一次NK細胞と同等のさまざまなNK細胞受容体を発現しています。

14日目において、NK細胞はPBMCの2～18%を占める可能性があります。増殖させた細胞をロゼットSEP法で精製すると、CD3陰性CD56陽性細胞によって示される99%のNK細胞純度で、培養液中に存在するNK細胞の40～70%を回収できます。増殖させたNK細胞は、神経芽細胞腫、AML、骨肉腫、メラノーマを含むさまざまな腫瘍細胞株に対して細胞傷害活性を示すことが実証されています。

ここでは、代表的なML殺傷能を特異的溶血率（%）として示しています。ライブBIOTビデオでは、カルシウムAmをロードした神経芽細胞腫細胞株CHP 1 34に対するNK細胞の殺傷能を示しています。この手順の後、NK細胞の機能に関するさらなる疑問を解決するために、NK細胞によるサイトカイン産生の解析や、動物腫瘍モデルへの適応転移などの他の手法を実施することができます。

このビデオを視聴することで、大量のNK細胞を増殖および精製する方法について十分に理解できるはずです。これは、末梢血単核細胞から直接行い、その後にNK細胞を精製することで達成できるほか、ロゼット法で精製したNK細胞を用いて増殖を開始することも可能です。開始時点では、一般的なバフィーコートから1,500万〜4,000万個のNK細胞が得られ、本手法で説明するスキームを用いることで、これらすべてを利用して非常に大量のNK細胞を増殖させることができます。