Name: 拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶヒトNK細胞の効率的な拡大培養と精製法。末梢血単核球を用いて21日間で21,000倍に増殖させ、機能的な細胞傷害活性を評価する技術です。免疫療法研究に応用可能です。

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著者は、最初のK562 aAPCとmIL21融合ベクターの作成に彼らの仕事のためにローレンスクーパー、Harjeetシン、とLenka Hurtonに感謝します。 この仕事のための資金は、UT MDアンダーソンの医師科学者のプログラム、聖剣帯の財団、およびフレンズの伝説によって提供されていました。

1。バフィーコートから末梢血単核細胞の単離末梢血単核細胞（PBMC）は、白血球除去輸血により誘導された健康なドナーバフィーコートサンプルからをFicoll - Paqueで浮遊密度​​遠心法によって得られる。 <ol><li>をFicoll - Paque遠心分離は、若干変更してあたりの製造者のプロトコルとして行われます。 </li><li> 140mlの最終容積に正常なドナーから血液銀行バフィーコート（典型的なバフィーコートの量が40〜70 mLの場合）にPBSを追加。 </li><li>層をFicoll - Paque（4管）15mLの上にバフィーコートサンプルの35 mLの。 </li><li>ブレーキなしで20分間400グラム間遠心する。 </li><li>をFicoll - PaqueからPBMCを回復する：プラズマのインタフェースを、をFicoll - Paqueの下部にある赤血球を廃棄しないでください。 </li><li> 10分間400グラムで、毎回遠心分離し、PBSでPBMCを三回洗浄する。 </li><li> PBMCを（セクション4）RosetteSepにより単離することができるこの段階では、NK細胞の増殖やNK細胞に直接使用できます</li><li>残りのPBMCを液体窒素で10％のDMSOを含むFBS中で凍結することができます。 </li><li>フィコールを吸引し、2つの50 mLの遠心分離管に手順5から赤血球を集め、PBS（50mLのマークに追加）で3回洗浄、それぞれの時間は、赤血球層の上部は、顆粒球を除去する上清スキミングを吸引除去する。 </li><li>赤血球がNK細胞のRosetteSep精製（ セクション4を参照）のために直ちに使用または4でAlseverのソリューションを等量に格納できる℃で後で使用するために（赤血球は4週間を限度として格納することができます）。 </li></ol> 2。 NK細胞増殖 NK細胞の増殖は、末梢血を使用するか、NK細胞を精製開始することができます。拡大のために使用される末梢血単核球の量が3週間の拡張の終了時に希望するNK細胞の量に基づいて変化させることができる、詳細については、代表的な結果のセクションを参照してください。 （注1を参照） 刺激1 0日目<ol><li>展開される各5 × 10 6 PBMCsをするため、カウント、100 Gyのでガンマ照射器を用いて10 × 10 6 K562 CL9 mIL21を照射します。 </li><li>照射後、NK細胞の膨張媒体（NKEM）のPBSに懸濁するで細胞を洗浄。 </li><li> T75フラスコでNKEM 40ml中の種子10 × 10 6照射K562 CL9 mIL21と5 × 10 6末梢血単核球（1:2比）と37℃のインキュベーター内で直立℃、5％のCO 2を入れてください。 </li></ol> 3日目と5 <ol start="4"><li> 5分間400グラムで、遠心分離により細胞を回収し、新鮮なNKEM（メディア全体のボリュームの新鮮なIL2を加える）とメディアの半分を交換し、培養する。 </li></ol>刺激2 日7 <ol><li>一週間の終わりに培養中の細胞の数を数えます。 </li><li>フローサイトメトリーによる表現型解析のために5 × 10 5細胞を脇に置きます（注2を参照） </li><li>再刺激するそれぞれ5 × 10 6個の細胞の場合は、カウント、100 Gyのでガンマ照射器を用いて5 × 10 6 K562 CL9 mIL21を照射します。 </li><li> （注3を参照）2.5x10合計5個/ mLにNKEMで照射K562 CL9 mIL21（1:1比）を再懸濁しますの等しい数を追加。 </li><li> T75フラスコ中の種子の細胞（フラスコあたり最大50 mL）で。 </li></ol> 10と12日間<ol start="6"><li>セルの数を数える。 </li><li> （注3を参照）、細胞数に基づいて、新鮮なNKEMを使ってメディア全体を変更します。 </li></ol> 14日目<ol start="8"><li>拡張の二週間の終わりに培養中の細胞の数を数える。 </li><li>フローサイトメトリーによる表現型解析のために5 × 10 5細胞を脇に置きます（注2を参照） </li><li>拡張がPBMCから開始された場合はNK細胞はRosetteSep精製プロトコルを使用して展開のこの段階（セクションIVを参照）で精製することができる。拡張は刺激3に進んでNK細胞を精製から開始された場合。 </li><li>精製後にNK細胞（手順8のように）の純度を確認するためにフローサイトメトリーによる表現型解析のために5 × 10 5細胞を脇に置きます。 </li><li>精製されたNK細胞のすべてを（注4を参照）を使用して刺激3に進みます。 </li></ol>刺激3 <ol><li> （注3を参照）、細胞数に基づいてNKEMで照射K562 CL9 mIL21（1:1比）で再懸濁し、NK細胞。 </li></ol> 17と19日間<ol start="2"><li>セルの数を数える。 </li><li> （注3を参照）、細胞数に基づいて、新鮮なNKEMでメディアを変更します。 </li></ol> 21日目<ol start="4"><li>展開の三週間の終わりに培養中の細胞の数を数える。 </li><li>フルNK細胞の表現型の抗体のパネルのためのフローサイトメトリー解析のための1 × 10 6細胞を（表1を参照）回復する。 </li><li>将来の使用のためのバイアルあたり5 × 10 7細胞の最大密度で10％のDMSOを含むFBSで細胞を凍結する。 </li></ol> 3。 NK細胞の細胞傷害性アッセイ<ol><li> NKEMにおけるNK細胞と種のバイアル、PE前日に解凍回復を可能にするために細胞毒性アッセイをrforming。 </li><li>単一のターゲット細胞株を用いてそれぞれのNK細胞の細胞毒性アッセイの場合、6 × 10 5 NK細胞と3 × 5ターゲット細胞（注5を参照）が必要です。 </li><li> NKEMにカルセイン- AMを（在庫1 DMSOのmg / mL）に希釈することによりCAM -メディアを準備する（注6を参照）。 </li><li> （注7を参照）CAM -培地1 mL中に10 6の標的細胞を再懸濁します。 </li><li>時々振とうしながら、37℃で1時間インキュベートする。 </li><li> 1 E：：図1に示すようにT比1 × 10 6細胞/ mLと、対応するU底96ウェルプレート〜10の3ウェルの各々にNK細胞懸濁液の200uLを追加で再懸濁し、NK細胞。 （注8を参照） </li><li> "最大"以外のすべての残りのウェルに完全なメディアの100uLを追加。 </li><li> "最大"に2％トリトンの100uL X - 100を追加。 </li><li> 5その後のEのためのNK細胞の連続希釈を行います。セルの100uLたびに転送することによってT比は、よく混ぜる。最後のウェル（：0.3125:1のT比E）から100uLを捨てる。 </li><li>カルセイン負荷の1時間後、1200rpmで5分間、遠心分離、二回NKEMで標的細胞を洗う。 （注9を参照） </li><li> 1 × 10 5細胞/ mLで標的細胞を再懸濁しますを再カウント。 </li><li> （1 × 10 4 /ウェル）を各ウェルに標的細胞を100μLを加える。細胞接触を開始するには100グラムで1分間遠心。 </li><li> 37℃、4時間、5％CO 2をインキュベートする。 </li><li>一様に放出カルセインを中断するために、100μLのピペッターでピペッティングにより穏やかに文化を混ぜ、細胞をペレットに5分間100グラムでプレートをスピンダウンして気泡をしないように注意しながら新しいプレートに上清100μLを移す。細い針を用いて形成する可能性のある気泡をポップ。 </li><li>蛍光プレートリーダー（励起フィルター485 nmの、発光フィルター530 nm）を用いてプレートをお読みください。ボトムリードが推奨されます。 </li><li> × 100。 - [/（テストリリース - 自発的放出）（自発的な放出は最大放出）]の式に従ってパーセント特異的溶解を計算する</li></ol> 4。 RosetteSepによるNK細胞の精製<ol><li> 50 mlチューブ（：PBMC 100:1 RBC）に、末梢血や拡張された細胞のそれに赤血球の100倍過剰してください。 </li><li>新鮮な赤血球を使用すると、次のステップに進むか赤血球がAlsever sソリューションに格納されている場合、赤血球の数をカウントし、2％FBS三回を加えたPBSと赤血球の適切な（100倍過剰）の量を洗って、1200rpmで遠心分離している場合10分ごとに時間のため。 </li><li>ステップ1.7または末梢血や拡張された細胞の5 × 10 7あたり1mLの最終容量にPBS + 2％FBSでステップ2.10から拡張された細胞由来のPBMCと赤血球を結合する。 </li><li>末梢血や拡張された細胞の1 × 10 6あたりRosetteSepヒトNK細胞の濃縮カクテルの1μLを追加。 </li><li>よく混和して、5分ごとに混合穏やかに室温で20分間インキュベートする。 </li><li>等しい優しくPBS + 2％FBSミックスのボリュームとをFicoll - Paqueの上にレイヤーを追加します。 </li><li> PBMC分離（セクションI）で説明をFicoll - Paque遠心分離の手順を繰り返します。 </li><li>精製後に回収したNK細胞をカウントし、NK細胞の純度（手順8）のためのフローサイトメトリーによってphenotpyingために5x105細胞を脇に置きます。 </li></ol> 5。ノート 注1。NK細胞は、末梢血から、またはRosetteSep精製NK細胞から直接拡張することができます。我々は同じような展開の効率化を指摘しているが、一部のドナーは、拡大する前にRosetteSepによって難易度の浄化、その結果非常に低いN​​K細胞数を持つことができます。 注2。我々は日常的にCD3陰性とCD16 -またはCD56陽性であるものとして、NK細胞を列挙し、拡張時の表現型解析のためにCD56 - FITC、CD16 - PE、およびCD3 - PE - Cy5標識を使用してください。 注3。各メディアの変化や刺激では、2.5 × 10 5 / mLの再懸濁し、細胞が膨張のピークの段階でmL当たり、または200万下のNK / PBMC細胞数を維持する。これは、栄養素の枯渇を防ぎ、最大の拡大と生存を達成するの​​に役立ちます。 注4。NK膨張率は、ドナーに依存しており、刺激の終了時に細胞の1または2の一部は実験的な必要性に応じて凍結させ、一部はさらに拡大することができます。我々は、後で拡張のために凍結細胞を使用して良好な成功を収めている。 注5。我々はNKEMと細胞毒性アッセイをセットアップするためのNKEMの4中に再懸濁さ4 × 10 5カルセイン- AM染色した標的細胞の700 ULSで再懸濁し、7 × 10 5 NK細胞の最小値を使用することをお勧め誤差の余地を可能にするためには。播種標的細胞用マルチチャンネルピ ​​ペットを使用している場合セル（最大6 mLの6 × 10 5〜）の高いボリュームが使用されているメディア流域のサイズに基づいて必要になることがあります。また、推奨されるNK細胞数は、Eのために特別です：T比が高く、Eを使用するため、プロトコルに示す：T比が増加するそれに応じmL当たりNK細胞数（40:1 Eの例：：T比の使用の4 × 10 6細胞/ mL） 注6。我々は、1:500、1:400以下の希釈液を使用して、選択肢の標的細胞株のための予備的カルセイン- AMのローディング滴定を行うことをお勧めします。 1:300、1:200と1:100最大と自発的な放出の間の最適な違いを実現する。 注7。標的として接着細胞株を使用して、最初の非酵素的細胞解離バッファーを用いて、単一の細胞懸濁液を準備する。 ADCCを実行する場合は、CAM -メディアにおける標的細胞の重複チューブを準備する。 注8 ADCCを実行する場合、10:1 Eに対応する3ウェルに同一のNK細胞を追加する：。ADCCのためのT。その他のドナーのために繰り返します。追加の標的細胞に対して、この手順を繰り返します。 注9。ADCC実験を行う場合、カルセイン負荷の45分後に、標的細胞に対するADCCを誘導する特異的抗体の10ugを追加。さらに15分後、1200rpmで5分間、遠心分離、二度完全培地で標的細胞を洗う。 1 × 10 5細胞/ mLで細胞を再懸濁し、プロトコル内の次のステップに進みます。 6。駐在結果<img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。展開がスキームどおりに実行されると、出発物質、1 × 10 9〜10 10細胞（ドナー依存ばらつき）に典型的なNK細胞の収量の範囲として5x106 PBMCを用いて、上記の。図は、NK細胞の倍に膨張を示す（N = 19）、元の製品に存在するNK細胞と比較し（中央値+ / - 四分位）。 <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。展開されたNK細胞はいくつかの例外（CD11b、CD160およびCD244）と展開されていない一次NK細胞に匹敵する様々なNK細胞受容体を発現する。 <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。バフィーコートから末梢血単核球の回収は、ドナーに依存しており、300x10 6から800x10 6の範囲にすることができます。末梢血単核細胞の18％ - NK細胞は2％を含むことができる。拡張セルのRosetteSep精製のため、40〜70％から当日純粋NKセル14の範囲の回復。拡張と浄化の推奨プロトコールに従うことにより、99％のNK細胞の純度が期待できる。 <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。拡張NK細胞は、神経芽細胞腫、AML、骨肉腫や悪性黒色腫（代表的なAMLの殺害は、パーセント特異的溶解として示される）を含む腫瘍細胞株の範囲に対して細胞毒性を示している。

<ol><li>McKenna, D. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practices+production+of+natural+killer+cells+for+immunotherapy%3A+a+six-year+single-institution+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience.</a> Transfusion. 47, 520-520 (2007).</li>
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<li>Klingemann, H. G., Martinson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications.</a> Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).</li>
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<li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+potential+of+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Replicative potential of human natural killer cells.</a> Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).</li>
<li>Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+with+high+cytotoxicity+by+K562+cells+modified+to+co-express+major+histocompatibility+complex+class+I+chain-related+protein+A%2C+4-1BB+ligand%2C+and+interleukin-15%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15.</a> Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

NK細胞の増殖と活性化のメディア（NKEM） <ul><li> 90パーセントRPMI 1640（Cellgro） </li><li> 10％ウシ胎児血清（ギブコ） </li><li> 1Xペニシリン/ストレプトマイシン（Cellgro） </li><li> 1 × L -グルタミン（Gibco社） <ul><li>使用前にメディアを滅菌フィルタします。 </li></ul></li><li> 50 U / mLのIL2（Proleukin、ノバルティスのワクチンおよび診断、株式会社） <ul><li> - 200 IU /μlのストックから希釈した。毎回使用する直前に、メディアの所望の量にIL2を追加。 </li></ul></li></ul> PBMCおよびNK Cellアイソレーション<ul><li>をFicoll - Paque（GEヘルスケア） </li><li> Alseverの溶液（シグマ） </li><li> RosetteSepヒトNK細胞の濃縮カクテル（Stemcellテクノロジーズ） </li></ul> NK細胞の細胞傷害性アッセイ<ul><li>カルセイン- AM（Invitrogen社） <ul><li>ストック溶液は、50μLのアリコートで凍結1mgの/ mLを、店舗にあります。細胞の染色のための必要な希釈を達成するためにNKEM媒体に溶解。 </li></ul></li></ul>抗体 NK細胞の表現型解析のために使用される抗体のリストを以下の表に記載されています。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td>抗体</td><td>テストごとのボリューム</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td></tr><tr><td>チューブ1 </td><td valign="top">アイソタイプFITC アイソタイプFITC アイソタイプFITC アイソタイプFITC FACSバッファー 合計ボリューム</td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社</td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td>チューブ2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE - Cy5標識 CD16アレクサ647 FACSバッファー 合計ボリューム</td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社</td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td>チューブ3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE - Cy5標識 NKG2D APC FACSバッファー 合計ボリューム</td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen社 R＆Dシステムズ ミルテニーバイオテク社 R＆Dシステムズ BD Pharmingen社 BD Pharmingen社</td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td>チューブ4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE - Cy5標識 CD27 APC FACSバッファー 合計ボリューム</td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社</td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td>チューブ5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266（DNAM - 1）PE CD3 PE - Cy5標識 CD160 Alexa647 FACSバッファー 合計ボリューム</td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td>チューブ6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244（2B4）PE CD3 PE - Cy5標識 CD197（CCR7）APC FACSバッファー 合計ボリューム</td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

拡大、精製、及びヒト末梢血nk細胞の機能的評価

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells 

ナチュラルキラー（NK）細胞は、感染性微生物や種々の腫瘍に対する免疫監視に重要な役割を果たしている。 NK細胞とin vitroで拡大する機能の利用が限られては、NK細胞免疫療法の開発が制限されています。ここでは、効率的に人工的な抗原提示細胞（aAPC）として、膜結合IL21の発現K562細胞を用いた機能性NK細胞のex vivoでの膨大な量を拡大する方法を説明します。 これまでNK細胞養子療法はT細胞やNK細胞のポジティブセレクションの枯渇が続くドナーの定常状態の白血球除去輸血により得られた細胞の製品を利用してきた。製品は通常一晩IL - 2で活性化し、次の1日目に投与される。ため、末梢血中のNK細胞の低周波から、NK細胞の比較的小さな数字は、臨床試験で配信されている。 in vitroで NK細胞を伝播することができないことは、最適な臨床転帰のために十分な細胞数を生成するための制限要因となっている。 NK細胞のいくつかの拡張（1〜2週間以上5〜10倍）が高用量IL - 2単独2を介して達成されている。自家T細胞の活性化は、地元のサイトカイン3のリリースによって、おそらくまた、NK細胞の増殖を媒介することができる。間葉系間質または人工的な抗原提示細胞（AAPCS）によるサポートは、末梢血と臍帯血4の両方からNK細胞の拡張をサポートすることができます。抗体でコーティングされたビーズで組み合わせてNKp46とCD2活性化は、現在21日間で約100倍に拡大、その結果、NK細胞の拡大（Miltenyi Biotec社、オーバーンカリフォルニア州）のために販売されている。 aAPC -拡張使用するか、活性化NK細胞の臨床試験が進められ、大幅な拡張なしにプライムと活性化NK細胞5に白血病細胞株CTV - 1を使用して、1つです。二審は21日6で平均490倍の拡大を達成するため、NK細胞の増殖のためにEBV - LCLを利用しています。三番目はK562ベースaAPCを利用して4 - 1BBL（CD137L）と21日の平均NK拡大277倍を達成した膜結合型IL - 15（MIL - 15）7、形質導入。 NK細胞はK562 - 41BBL - mIL15を使用して展開、がaAPCが展開されていないNK細胞と比較してin vitroおよび in vivo での高い細胞毒性であり、ADCCに参加、その増殖が老化テロメアの短縮8に起因することによって制限されます。さらに最近ではNK細胞の350倍の拡大は、K562表現MICA、4 - 1BBLとIL15 9を使用して報告した。 NK細胞の拡大の私達の方法はここに21日の中央値は21,000倍に拡大を達成する老化することなく、NK細胞の急速な増殖を生成する説明。

ここでは、効率的に拡大し、精製ヒトNK細胞の数が多いし、その機能を評価する方法を説明します。

拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価

ナチュラルキラー（NK）細胞は、さまざまな感染性微生物や腫瘍に対する免疫監視において重要な役割を果たしています。……の可用性が限られているため、

この手順の全体的な目的は、大量のヒトNK細胞を迅速に増殖させることです。まず、バフィーコートまたは全血サンプルからp BMCsまたはNK細胞を単離します。次に、NK細胞増殖において、pbmcを人工抗原提示細胞とともに共培養します。IL-2を添加した培地を用い、週1回のaPCによる刺激を行いながら、NK細胞数を1 × 10⁶ cells/mL未満に維持して3週間培養します。最終的に、非放射性細胞毒性アッセイを用いて、増殖させたNK細胞の機能的有効性を検証します。この増殖法による典型的なNK細胞の収量は、21日目の時点で中央値21,000倍の増殖となり、カルシウム放出アッセイで判定したところ、様々な腫瘍に対して高い細胞毒性を示すことが確認されました。NK細胞の分野では、歴史的に大量のNK細胞を得ることが非常に困難であったため、本医学的手法は重要な疑問への回答に寄与します。本技術は、治療に十分な量のNK細胞を生成することが従来困難であったことから、ヒト癌の免疫療法に影響を与えるものです。本手法の実演は、当研究室のシニアリサーチアシスタントであるCecilyが行い、健康なドナーの血液からPBMCsを回収します。通常、血液銀行のバフィーコートがソースとして使用されます。まず、PBSを加えてバフィーコートの容量を140 millilitersに調整します。次に、35 millilitersのサンプルを15 millilitersのfial PAの上に重ね、密度勾配遠心分離機を用いて400 Gで20分間遠心分離します。破砕させないように注意しながら、フィコール（Ficoll）と血漿の界面からPBMCを注意深く回収し、赤血球の入ったチューブは後で使用するために取り分けておきます。PBMCをPBSで3回洗浄し、その都度400 Gで10分間遠心分離します。この分画のP BMCsをNK細胞の増殖に使用します。次に、密度勾配チューブに戻ります。上層を吸引して取り除きます。RBCsを2本の50 milliliter遠心チューブに移し、50 milliliterの標線までPBSを加えて洗浄します。遠心分離後、RBC層の上部をすくい取るようにして上清を吸引除去します。これにより顆粒球を除去します。3回洗浄を行い、その後、同量のelse's solutionでRBCsを再懸濁し、4 °Cで最大1ヶ月間保存します。このRBC画分は、2週間の拡大培養の終了時に、NK細胞のroset SEP精製に使用できます。機能的なNK細胞をex vivoで効率的に拡大させるために、膜結合型IL 21を発現するK 5 62クローン9細胞（以下、K 5 62と表記）を使用します。人工抗原提示細胞としてClone nine IL 21を使用します。まずPBMCをカウントし、NK細胞増殖のために播種する5×10⁶個分となる容量を算出します。PBMC 5×10⁶個に対し、K 5 62 clone nine IL 21細胞 10×10⁶個をカウントし、ガンマ線照射装置を用いて100 Gyで照射します。照射済みの細胞は、将来的に使用するために凍結保存することも可能です。次に、照射済みの細胞をPBSで洗浄し、NK細胞増殖用培地に再懸濁します。次に、照射した細胞とpbmcを2:1の比率で40 mLのNK細胞増殖培地に加え、T 75フラスコを37 °C、5% CO2のインキュベーター内に直立させて設置します。3日目に、400 ×gで5分間の遠心分離を行い、刺激した細胞を回収します。培地の半分を新鮮なNKEMに交換し、培養を継続します。5日目に再度培地交換を行います。1週間後、細胞数をカウントし、フローサイトメトリーによる表現型解析用に5×10⁵個の細胞を分取します。2回目の刺激に向けて、K 562細胞を1:1の比率でカウントし、照射します。IL 21細胞を9個クローニングして細胞を拡大し、その後、総細胞数 2.5 × 10⁵ cells/mLとなるようにNK細胞拡大培地で混合します。次に、細胞をT 75フラスコに移し、培養を継続します。10日目と12日目に、NK細胞拡大培地を用いて 2.5 × 10⁵ cells/mLで細胞を継代します。拡大14日目に、再び細胞数を計測し、フローサイトメトリーでサンプルのフェノタイプを解析します。ロゼットSEP精製プロトコルを用いて、このPBMC由来の細胞増殖物を精製し、フローサイトメトリーによるフェノタイプ解析でNK細胞の純度を確認します。精製されたNK細胞に対し、照射済みのK 5 62 clone nine IL 21細胞を1:1の比率で加えて3回目の刺激を行います。最終的に21日目に、完全なフェノタイプ解析用抗体パネルを用いたフローサイトメトリーにより、増幅させたNK細胞を解析します。10% DMSOを含むFBSを用いて、最大密度5×10⁷ cells/vialで細胞ストックを凍結します。細胞傷害性試験には、新鮮なNK細胞または凍結保存されたNK細胞のいずれかを使用します。凍結NK細胞を使用する場合は、まずNK細胞のバイアルを融解し、試験当日に細胞を回復させるためNKEM中で24時間播種します。10⁶個のターゲット細胞をcalcium AMを含む1 mLのNKEMに再懸濁し、U底96ウェルプレートを用いて37 °Cで時々振盪しながら1時間インキュベートします。1×10⁶ cells/mLに懸濁したNK細胞200 µLを3連で加え、指示通りに細胞の連続希釈を行います。1時間のカルシウムローディング後、標的細胞をNK細胞増殖培地で2回、400 Gで5分間遠心分離して洗浄します。次に、標的細胞を再度計数し、1 × 10⁵ cells/mLで再懸濁します。96ウェルプレートの各ウェルに標的細胞を100 µLずつ加え、100 Gで1分間遠心分離して細胞接触を開始させ、37 °C、5% CO2条件下で4時間インキュベートします。遊離したカルシウムを均一に懸濁させるため、ピペッティングにより培養液を穏やかに混合し、100 Gで5分間遠心分離して細胞ペレットを作成した後、上清100 microlitersを新しい平底96ウェルプレートに移します。その際、気泡が入らないように注意し、必要に応じて細い針を用いて気泡を除去してください。励起フィルターを485 nanometers、蛍光フィルターを530 nanometersに設定した蛍光プレートリーダーを用いてプレートを測定します。特異的溶血率を算出します。通常、バフィーコートから単離した5×10⁶個のPBMCを拡大培養すると、1×10⁹個から10¹⁰個のNK細胞が得られます。拡大培養されたNK細胞は、バフィーコート中の未拡大の一次NK細胞と同等のさまざまなNK細胞受容体を発現しています。14日目において、NK細胞はPBMCの2～18%を占める可能性があります。増殖させた細胞をロゼットSEP法で精製すると、CD3陰性CD56陽性細胞によって示される99%のNK細胞純度で、培養液中に存在するNK細胞の40～70%を回収できます。増殖させたNK細胞は、神経芽細胞腫、AML、骨肉腫、メラノーマを含むさまざまな腫瘍細胞株に対して細胞傷害活性を示すことが実証されています。ここでは、代表的なML殺傷能を特異的溶血率（%）として示しています。ライブBIOTビデオでは、カルシウムAmをロードした神経芽細胞腫細胞株CHP 1 34に対するNK細胞の殺傷能を示しています。この手順の後、NK細胞の機能に関するさらなる疑問を解決するために、NK細胞によるサイトカイン産生の解析や、動物腫瘍モデルへの適応転移などの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、大量のNK細胞を増殖および精製する方法について十分に理解できるはずです。これは、末梢血単核細胞から直接行い、その後にNK細胞を精製することで達成できるほか、ロゼット法で精製したNK細胞を用いて増殖を開始することも可能です。開始時点では、一般的なバフィーコートから1,500万〜4,000万個のNK細胞が得られ、本手法で説明するスキームを用いることで、これらすべてを利用して非常に大量のNK細胞を増殖させることができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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インビトロおよびインビボ研究のためのマウス不変性ナチュラルキラーT細胞の精製と拡大

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膜結合型IL-21修飾B細胞株を用いたナチュラルキラー(NK)およびCAR-NK細胞増殖法

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ヒト増殖電位幹細胞からのナチュラルキラー細胞の作製

学ぶヒトNK細胞の効率的な拡大培養と精製法。末梢血単核球を用いて21日間で21,000倍に増殖させ、機能的な細胞傷害活性を評価する技術です。免疫療法研究に応用可能です。

拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価

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