ハエでエタノールの感度を測定するために簡単

こんにちは。テキサス大学南西部医学センター精神科のAdrian Rothen博士の研究室に所属しているThomas Maplesです。本日は、エタノールによる鎮静に対するショウジョウバエの感受性を決定するための簡便な手順について実演します。このアッセイは、エタノールへの曝露後にショウジョウバエに見られる、右転反射および歩行能力の喪失に基づいています。

この測定法は、異なる系統のdrosophilaおよび変異体間におけるアルコール感受性の違いを決定するために使用できます。また、このアッセイを用いて、ハエに耐性を誘導することも可能です。ここでいう耐性とは、繰り返し曝露されることでアルコールに対する反応が低下することを指します。それでは始めていきましょう。

この実験では、以下のバイアルが必要です。1〜2日前に採取した、8匹のショウジョウバエが入ったバイアルを用意してください。曝露試験は、雄または雌のいずれを用いても行うことができます。

ただし、各バイアルには1つの性別のみを入れる必要があります。ハエの入っていない空の餌バイアル、カミソリ、綿のような素材で作られた2つのバイアルプラグを用意します。このようなバズプラグがない場合は、脱脂綿でも代用可能です。また、チップ付きの1000 µLマイクロピペット、食料品店で購入できる食用色素を含む200 proofエタノール、およびタイマーを用意してください。

最初に行うのは、ショウジョウバエをエタノールに曝露させ、その運動性を観察するための曝露チャンバーの作製です。このチャンバーを作製するには、まずカミソリを用いてバイアルプラグを半分に切断します。次に、切断した片方をバイアルの底に押し込み、餌を覆います。

これにより、ショウジョウバエが歩くための、粘着性のない平坦な表面が作られます。脱脂綿を使用する場合は、滑らかに押しつけ、ショウジョウバエが綿の繊維に引っかからないよう、できるだけ毛羽立たないようにしてください。複数のチャンバーを作成する場合は、各チャンバーで餌とバイアルプラグが占めるスペースが同じになるようにしてください。

これにより、各チャンバー内のショウジョウバエが同一量のエタノールに曝露されることが保証されます。慣れれば、3本のバイアルに入ったショウジョウバエを並行して曝露させることは容易です。曝露チャンバーが準備できたら、ショウジョウバエをエタノールに曝露させます。

まず、8匹のハエが入ったバイアルを曝露チャンバーに移し、もともとハエが入っていたバイアルの栓でチャンバーを密閉します。次に、選択した濃度の染色エタノール500 µLを、綿のようなバイアル栓の片端にピペットで滴下します。その後、曝露チャンバーの栓をエタノールを塗布した栓に交換し、エタノールを塗布した側をチャンバー内に挿入します。

エタノールを塗布したプラグを露出チャンバーに挿入した直後に、タイマーを開始してください。エタノールに含まれる染料により、エタノールが塗布された面がバイアルの壁ではなく露出チャンバー側に向いていることを確認できます。これは、バズプラグではなく脱脂綿を使用する場合に特に重要です。脱脂綿はどの面でもバイアル側に向く可能性があるためです。

この曝露試験では100% alcoholを使用しており、これが曝露チャンバー内に拡散し、ハエが空気中からそれを吸入します。エタノールを塗布したプラグを曝露チャンバーに添加した後、1分ごとに、何匹のハエが静止状態（自力で体を反転させたり歩いたりできない状態）になったかを確認します。ハエが可動状態で維持される時間が長いほど、各1分間隔における耐性が高いことを示します。

チャンバーをベンチ上で軽く叩いてハエを驚かせ、動くことができるすべてのハエが動いていることを確認します。叩いた後、1分ごとの間隔でハエが動き出したり、自力で起き上がったりする時間を与えるため、10秒間観察します。実験開始時に、8匹のハエのうち何匹が静止しているかを記録します。

ほとんどのハエは、驚くとすぐにバイアルの壁を駆け上がります。100%エタノールに約6分間さらされると、動きが鈍くなり、12分までには不規則な動きを見せることがあります。ほとんどのハエは静止状態となり、歩行や、仰向けになった状態から自力で起き上がることができなくなります。

自力で起き上がり、歩行できる個体のみを「移動可能（mobile）」なハエとしてカウントしてください。足や翅をその場で動かすだけの個体は「静止（stationary）」したハエとしてカウントします。また、観察期間中ずっと仰向け状態でいる個体も、自力で起き上がれないことは中毒の兆候であるため、「静止」としてカウントしてください。10秒間の観察時間中、絶えず激しく翅を振動させている個体は、たとえ位置が変わったとしても、同様に「静止」としてカウントします。これらの個体の大部分は、急速な翅の動きの間は静止しているためです。

要約すると、自力で転がり、歩くことができるハエは「可動（mobile）」であり、自力で転がることができず、脚や翅をその場で動かしている、あるいは翅を急速に振動させているハエは「不動（stationary）」と定義します。これらの基準を適用すると、エタノール蒸気への曝露時間が長くなるにつれて、より多くの野生型ハエが不動状態になることがわかります。このアッセイでエタノール感受性を定量化するために用いられる値が、中央鎮静時間（median sedation time：MST）です。

MSTを、曝露チャンバー内の8匹のハエのうち4匹が静止状態になるまでに必要なエタノール曝露時間（分）と定義します。特定の観察時点でちょうど4匹のハエが静止している場合、この値は容易に決定できます。例えば、曝露11分後にちょうど4匹のハエが静止していれば、MSTは11となります。

曝露から11分後にちょうど4匹のハエが静止しており、12分後も同様である場合は、ハエが最初にSTに達した時間であるため、最初の値を採用します。特定の観察時点で4匹のハエが静止していない場合は、4匹が静止した時間を線形補間する必要があります。例えば、曝露9分から10分の間に静止しているハエの数が3匹から5匹に跳ね上がった場合、グラフからMSTが9.5分であると決定できます。このアッセイを用いて収集された以下のデータは、この実験デザインがエタノール感受性を測定する正確な方法であることを示しています。

以下の実験では、バー内に示されている通り、6〜8本のバイアル（N=6-8）を使用しました。100% Ethanolに曝露させた野生型雄 flies のMSTはおよそ11分であり、標準誤差は小さい値でした。日ごとの変動は小さく、ほとんどの場合統計的に有意ではありませんが、実験群と対照群は同日に並行して測定することを推奨します。

また、A日目とB日目に曝露されたハエは同一個体ではないことに注意してください。これらは同一の遺伝的系統の兄弟姉妹であり、100%Ethanolに曝露された雄および雌のハエにおいてMSTに差は見られませんでした。それでも、1つの性別のみを用いることを推奨します。

雄および雌のショウジョウバエを濃度を上げたエタノールにさらすと、エタノール濃度の増加に伴いMSTが統計的に有意に減少することを示す良好な用量反応曲線が得られます。このアッセイは、より精巧なエタノール気化装置を用いて測定された既報の表現型も再現しており、right rabbit 1変異を持つハエではMSTの有意な増加が認められました。この増加は、100%および90%のエタノールにおいて観察されました。

このアッセイを用いて、ショウジョウバエにおけるエタノール耐性を誘導し、測定することも可能です。耐性とは、耐性を誘導するためにあらかじめアルコールに曝露させた後、アルコールに対する反応が減少することを指します。ショウジョウバエが入ったバイアルを、MSTの約2倍の時間、エタノールに曝露させます。

例えば、これらのベルリン野生型系統の雄を100%エタノールに24分間さらします。曝露後、8匹のハエをそっと叩いて餌入りのバイアルに戻し、4時間休ませます。4時間の回復後、バイアルにハエの元のMSTを記録し、全く同じハエを同量のエタノールに再び曝露させ、2回目のMSTを記録します。

このグラフからわかるように、2回目のエタノール曝露におけるMSTは、1回目の曝露時のMSTよりも有意に高く、ショウジョウバエがエタノールの鎮静作用に対して耐性を獲得したことを示しています。耐性の指標は、ある個体群の2回目のMSTを同じ個体群の1回目のMSTで除し、そこから1を引くことで算出されます。この値は耐性率（%）として表され、本実験では約50%となりました。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。