Name: ハエでエタノールの感度を測定するために簡単 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学ぶショウジョウバエのエタノール感度測定法。Drosophila melanogasterを用いた正位反射消失に基づく簡便なアッセイで、異なる系統間の酔い感受性や耐性獲得を定量化できます。神経科学と行動生物学研究に有用です。

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我々は、重要な原稿の読み取り、および有用な議論のための研究室のメンバーのためにAylinロダンに感謝。この研究は、NIH、R01AA019526によってサポートされています。

1。暴露室を作成する<ol><li>カミソリの刃を使用して半分にバイアルのプラグをカット。また、綿球を使用してください。 </li><li>ハエがログイン立ち往生しないように滑らかな表面を作るために食品のバイアルの底に、バイアルのプラグの半分、または綿のボールをプッシュ</li><li>複数の曝露チャンバーを作る場合、バイアルのプラグと食品が各チャンバー内の同じ容積を取ることを確認してください。バイアルの側面のマークはこれを容易にすることができます。 </li></ol> 2。ハエを公開<ol><li>酵母のない通常の餌をバイアルに露出する前に1つ性別、年齢1-5日、一日の8ハエを集める。 </li><li>実験者が実際に使用される遺伝子型/株に盲検化されるように、コード内でラベルを付けます。 </li><li>タップして、曝露チャンバー8つのハエを移す。麻酔しないでください。 </li><li>それは簡単に見えるように200プルーフのエタノールに食品染料、例えば、アシッドブルー9、少量のを追加。 </li><li> 0.5mlのエタノールとコートはバイアルのプラグの下部、または綿ボール、。 </li><li>露出のバイアル瓶にエタノールのプラグを差し込みます。アルコールは、バイアルに、ではなくバイアルの壁の方を向いていることを確認してください。 </li><li>カウントアップタイマーを開始します。 </li></ol> 3。記録エタノール誘発性の中毒<ol><li>タイマーが開始された後、各分には、ハエを驚愕し、10秒のためにそれらを観察するためにベンチに暴露室をタップします。 </li><li>毎分固定ハエの数を記録。ハエは、彼らが自分の背中から降りることができない場合は、1つの場所に残っている、または急速に全体の10秒の観測期間を通じて、その翼を振動さ固定です。これらのハエの大多数は急速な翼の運動の期間の間静止しているので、後者のハエは、静止とみなされます。ハエは、彼らが自分の背中から降りるとの距離および/またはバイアルの壁まで歩くことができれば静止していないです。 </li><li> 4つ以上のハエが固定として記録されるときの露光試験が終了しています。 </li><li>ハエを破棄し、後で再利用するために暴露室の空気を外に出して。 </li></ol> 4。 50％の鎮静に時間を決定する 50％の鎮静（ST50）までの期間は、8ハエの4つは静止したままエタノールの暴露の開始後の時間です。これは、次のように決定されます。 次のいずれかの操作を正確に4ハエが静止している最初の測定分。 または：以下つ以上のハエ（Y1）は1時点（分X）、そして次の測定時点においてつ以上（Y2）（X +1分）、式を使用して線形補間ST50で静止している場合： ST50 =（4 - Y1）/（Y2 - Y1）+ X 5。許容範囲を決定するために露出を繰り返してハエを公開<ol><li>あなたの実験で使用されている野生型の対照株のST50（重量）を決定します。 </li><li>前述のようにエタノールにハエの実験群を公開。 </li><li>彼らのST50（1）を測定しますが、時間2倍ST50（重量）に達するまで公開し続ける。 </li><li>バックの空の食品用バイアルにハエを移し、4時間保持する。 </li><li>ハエを再公開し、露出2のST50（2）を決定する。 </li></ol>許容範囲を決定する X100 - （1 ST50（2）/ ST50（1））のような％の許容誤差を計算する。 6。代表的な結果： ここに示されている、我々は遺伝子型と投与量あたりのハエの6-8バイアルで得られたいくつかの代表的な結果は次のとおりです。あなたの標準誤差が大幅に大きい場合、体系的な問題が可能性が発生しました。エタノールは、曝露チャンバーに直面する、とチャンバーが同じボリュームであることを確認してください。 <img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 野生型の図1。用量反応曲線は、エタノールの増加割合にさらさハエ。ハエの八バイアルは、投与量及び性別ごとに暴露された。用量間ST50が増加し、エタノールの投与量（P &lt;0.001）で有意に減少する男性と女性のハエは、（P&gt; 0.22、2ウェイANOVA）各用量で同じST50を示す。過密ボトルの便を運行する航空会社はノートでは、健康なボトルのものより大幅に小さくすることができ、このサイズの違いは、ST50に影響を与える可能性があります。 15から20人の女性と種子各ボトルは、ボトルごとに最適な幼虫の密度を得るために1-2日間敷設。 <img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2 90％、または100％エタノールのいずれかにハエを公開するにはmutation2白ウサギ（P &lt;0.001、2ウェイANOVA）によって引き起こされる前述のエタノール耐性を再現。 <img src="/files/ftp_upload/2541/2541fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3：4時間回復の間隔を隔て、100％エタノールに露出を繰り返し、秒露光（P &lt;0.001、対応のあるtの後にST50の大幅な増加を引き起こす- テスト）。ハエが最初に暴露（そのNAのVE ST50倍に相当）中に24分間暴露されたことに注意してください。短い時間（12分）のための暴露は、再暴露（データは示さず）によりST50の著しい増加を引き起こさなかった。

<ol><li>Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y., Singh, C. S., Moore, M. S. Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).</li>
<li>Rothenfluh, A., Threlkeld, R. J., Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y. Cell. 127, 199-211 (2006).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).</li>
<li>Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. S., Heberlein, U. Neuron. 28, 261-271 (2000).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

本発表では、我々はバイントンらによって記述された以前のアッセイに基づいて、エタノール誘発性中毒を判断する簡単な方法の概要を示している。 2000 1、およびRothenfluhら。 2006 2。アルコール誘発性の鎮静が飲酒の嗜好3と相関しているので、このアッセイは、アルコール使用障害の研究に関連しています。記載のアッセイは、驚愕誘発性負の走地性に基づいており、どのようにアルコール暴露は、この生得的反応に干渉されています。エクスポージャーを開始する前に、すべてあなたのハエが食品のバイアルでハエをタップした後、彼らはすべて10秒の観測時間内に下から上に移動する必要があるすなわち、そのような驚愕に正常な応答を示すことを確認してください。減少負の走地性を持つハエの例としては、ビッグバンに敏感な発作の変異体5と、ドーパミンニューロン6の変性による運動欠損ハエが含まれています。 記載のアッセイは比較的単純であるにもかかわらず、二つの変数は、再現性のある結果を確保するために最も注目に値する。最初に、すべてのエクスポージャーのバイアルは、同じボリュームにする必要があります。これは、バイアルの底部は食品+バイアルプラグ/コットンボールだけでなく、エタノールを含有するプラグインごとにバイアルに同じ距離を挿入するのと同じ量が含まれているかどうかの確認が行われます。完全に空のバイアルは、このアッセイに使用しているが、アッセイのスループットを減少させる、より長いST50の値を導くことができる。 このアッセイはまた、繰り返しのエタノール曝露によって開発公差のハエの量を決定するために適しています。繰り返しの曝露を行うときに変数の数を考慮する必要があります。最初に、間露光間隔は、ここで4時間として記述されています。この変数は変更可能ですが、我々はそれが最初の曝露からエタノールのクリアランスを確保するために、2時間よりも低くしないことをお勧めすることができます。ショルツらを参照してください。エタノール耐性の発達と減衰の速度論のための2000 4。考慮する2番目の変数は、最初の曝露の期間です。これは明らかに制御し、実験的なハエで同じでなければなりません。しかし、これは両方のこれらのハエの系統に供給されるエタノールの同量になる場合があります。鎮静ハエは、以前の後、鎮静株よりも高い線量を受けることがsedatesひずみしたがって、アクティブなハエ2より多くのエタノールを吸収するため、より高い初期投与に起因する多くの耐性を開発する。最初のST50（1）の違いを示す菌株の耐性の開発を比較するとき私達は強くリーダーを注意してください。 我々はここで説明するアッセイは、簡単にかつ再現性アルコールにハエ行動反応を決定するのに便利なツールです。

<table><tbody><tr><td>曝露用バイアル</td><td>www.flystuff.com</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>プラグ</td><td>www.flystuff.com</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>Acid Blue 9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861146</td><td></td></tr></tbody></table>

ハエでエタノールの感度を測定するために簡単

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

エタノールの原因の低用量は高用量で鎮静している間、非常に活発になるために飛ぶ。与えられたハエ株のエタノール誘発性鎮静に対する感度は、その株のエタノールの嗜好と相関し、したがって、鎮静は、アルコールの反応と飲酒の遺伝学を研究するために、関連性の高い指標です。我々はその酔わせる効果を、エタノール及び測定するためにハエを公開する簡単な方法を示しています。我々が記述するアッセイは、繰り返しの曝露により誘発される急性感度だけでなく、エタノール耐性を決定することができます。それは技術的に関与してセットアップを必要としないため、基本的なフライの文化のツールを使っての検査に適用することができます。

のエタノールの鎮静作用を測定する簡単なアッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em正向反射の消失に基づいて、&gt;ハエは、、説明されています。

低用量のエタノールはショウジョウバエに過剰活動を引き起こし、高用量は鎮静作用をもたらします。特定のショウジョウバエ系統におけるエタノール誘発性鎮静への感受性は...

こんにちは。テキサス大学南西部医学センター精神科のAdrian Rothen博士の研究室に所属しているThomas Maplesです。本日は、エタノールによる鎮静に対するショウジョウバエの感受性を決定するための簡便な手順について実演します。このアッセイは、エタノールへの曝露後にショウジョウバエに見られる、右転反射および歩行能力の喪失に基づいています。この測定法は、異なる系統のdrosophilaおよび変異体間におけるアルコール感受性の違いを決定するために使用できます。また、このアッセイを用いて、ハエに耐性を誘導することも可能です。ここでいう耐性とは、繰り返し曝露されることでアルコールに対する反応が低下することを指します。それでは始めていきましょう。この実験では、以下のバイアルが必要です。1〜2日前に採取した、8匹のショウジョウバエが入ったバイアルを用意してください。曝露試験は、雄または雌のいずれを用いても行うことができます。ただし、各バイアルには1つの性別のみを入れる必要があります。ハエの入っていない空の餌バイアル、カミソリ、綿のような素材で作られた2つのバイアルプラグを用意します。このようなバズプラグがない場合は、脱脂綿でも代用可能です。また、チップ付きの1000 µLマイクロピペット、食料品店で購入できる食用色素を含む200 proofエタノール、およびタイマーを用意してください。最初に行うのは、ショウジョウバエをエタノールに曝露させ、その運動性を観察するための曝露チャンバーの作製です。このチャンバーを作製するには、まずカミソリを用いてバイアルプラグを半分に切断します。次に、切断した片方をバイアルの底に押し込み、餌を覆います。これにより、ショウジョウバエが歩くための、粘着性のない平坦な表面が作られます。脱脂綿を使用する場合は、滑らかに押しつけ、ショウジョウバエが綿の繊維に引っかからないよう、できるだけ毛羽立たないようにしてください。複数のチャンバーを作成する場合は、各チャンバーで餌とバイアルプラグが占めるスペースが同じになるようにしてください。これにより、各チャンバー内のショウジョウバエが同一量のエタノールに曝露されることが保証されます。慣れれば、3本のバイアルに入ったショウジョウバエを並行して曝露させることは容易です。曝露チャンバーが準備できたら、ショウジョウバエをエタノールに曝露させます。まず、8匹のハエが入ったバイアルを曝露チャンバーに移し、もともとハエが入っていたバイアルの栓でチャンバーを密閉します。次に、選択した濃度の染色エタノール500 µLを、綿のようなバイアル栓の片端にピペットで滴下します。その後、曝露チャンバーの栓をエタノールを塗布した栓に交換し、エタノールを塗布した側をチャンバー内に挿入します。エタノールを塗布したプラグを露出チャンバーに挿入した直後に、タイマーを開始してください。エタノールに含まれる染料により、エタノールが塗布された面がバイアルの壁ではなく露出チャンバー側に向いていることを確認できます。これは、バズプラグではなく脱脂綿を使用する場合に特に重要です。脱脂綿はどの面でもバイアル側に向く可能性があるためです。この曝露試験では100% alcoholを使用しており、これが曝露チャンバー内に拡散し、ハエが空気中からそれを吸入します。エタノールを塗布したプラグを曝露チャンバーに添加した後、1分ごとに、何匹のハエが静止状態（自力で体を反転させたり歩いたりできない状態）になったかを確認します。ハエが可動状態で維持される時間が長いほど、各1分間隔における耐性が高いことを示します。チャンバーをベンチ上で軽く叩いてハエを驚かせ、動くことができるすべてのハエが動いていることを確認します。叩いた後、1分ごとの間隔でハエが動き出したり、自力で起き上がったりする時間を与えるため、10秒間観察します。実験開始時に、8匹のハエのうち何匹が静止しているかを記録します。ほとんどのハエは、驚くとすぐにバイアルの壁を駆け上がります。100%エタノールに約6分間さらされると、動きが鈍くなり、12分までには不規則な動きを見せることがあります。ほとんどのハエは静止状態となり、歩行や、仰向けになった状態から自力で起き上がることができなくなります。自力で起き上がり、歩行できる個体のみを「移動可能（mobile）」なハエとしてカウントしてください。足や翅をその場で動かすだけの個体は「静止（stationary）」したハエとしてカウントします。また、観察期間中ずっと仰向け状態でいる個体も、自力で起き上がれないことは中毒の兆候であるため、「静止」としてカウントしてください。10秒間の観察時間中、絶えず激しく翅を振動させている個体は、たとえ位置が変わったとしても、同様に「静止」としてカウントします。これらの個体の大部分は、急速な翅の動きの間は静止しているためです。要約すると、自力で転がり、歩くことができるハエは「可動（mobile）」であり、自力で転がることができず、脚や翅をその場で動かしている、あるいは翅を急速に振動させているハエは「不動（stationary）」と定義します。これらの基準を適用すると、エタノール蒸気への曝露時間が長くなるにつれて、より多くの野生型ハエが不動状態になることがわかります。このアッセイでエタノール感受性を定量化するために用いられる値が、中央鎮静時間（median sedation time：MST）です。MSTを、曝露チャンバー内の8匹のハエのうち4匹が静止状態になるまでに必要なエタノール曝露時間（分）と定義します。特定の観察時点でちょうど4匹のハエが静止している場合、この値は容易に決定できます。例えば、曝露11分後にちょうど4匹のハエが静止していれば、MSTは11となります。曝露から11分後にちょうど4匹のハエが静止しており、12分後も同様である場合は、ハエが最初にSTに達した時間であるため、最初の値を採用します。特定の観察時点で4匹のハエが静止していない場合は、4匹が静止した時間を線形補間する必要があります。例えば、曝露9分から10分の間に静止しているハエの数が3匹から5匹に跳ね上がった場合、グラフからMSTが9.5分であると決定できます。このアッセイを用いて収集された以下のデータは、この実験デザインがエタノール感受性を測定する正確な方法であることを示しています。以下の実験では、バー内に示されている通り、6〜8本のバイアル（N=6-8）を使用しました。100% Ethanolに曝露させた野生型雄 flies のMSTはおよそ11分であり、標準誤差は小さい値でした。日ごとの変動は小さく、ほとんどの場合統計的に有意ではありませんが、実験群と対照群は同日に並行して測定することを推奨します。また、A日目とB日目に曝露されたハエは同一個体ではないことに注意してください。これらは同一の遺伝的系統の兄弟姉妹であり、100%Ethanolに曝露された雄および雌のハエにおいてMSTに差は見られませんでした。それでも、1つの性別のみを用いることを推奨します。雄および雌のショウジョウバエを濃度を上げたエタノールにさらすと、エタノール濃度の増加に伴いMSTが統計的に有意に減少することを示す良好な用量反応曲線が得られます。このアッセイは、より精巧なエタノール気化装置を用いて測定された既報の表現型も再現しており、right rabbit 1変異を持つハエではMSTの有意な増加が認められました。この増加は、100%および90%のエタノールにおいて観察されました。このアッセイを用いて、ショウジョウバエにおけるエタノール耐性を誘導し、測定することも可能です。耐性とは、耐性を誘導するためにあらかじめアルコールに曝露させた後、アルコールに対する反応が減少することを指します。ショウジョウバエが入ったバイアルを、MSTの約2倍の時間、エタノールに曝露させます。例えば、これらのベルリン野生型系統の雄を100%エタノールに24分間さらします。曝露後、8匹のハエをそっと叩いて餌入りのバイアルに戻し、4時間休ませます。4時間の回復後、バイアルにハエの元のMSTを記録し、全く同じハエを同量のエタノールに再び曝露させ、2回目のMSTを記録します。このグラフからわかるように、2回目のエタノール曝露におけるMSTは、1回目の曝露時のMSTよりも有意に高く、ショウジョウバエがエタノールの鎮静作用に対して耐性を獲得したことを示しています。耐性の指標は、ある個体群の2回目のMSTを同じ個体群の1回目のMSTで除し、そこから1を引くことで算出されます。この値は耐性率（%）として表され、本実験では約50%となりました。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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