Name: ティック腸内ライム病の病原体の迅速な伝達とローカリゼーションのための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学ぶライム病病原体Borrelia burgdorferiのダニ腸内マイクロインジェクション感染法と免疫蛍光法による局在解析。従来法より短時間で感染ダニを作製し、共焦点顕微鏡で病原体の可視化が可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは心からこのデモの準備の支援のためにパルの研究室のメンバーに感謝。この研究は、NIH / NIAIDからPHS助成AI076684とAI080615によってサポートされていました。

1。若虫マダニ属のマイクロインジェクションscapularisダニ 1。準備針<ol><li>加熱とガラスマイクロピペットプラー装置（成茂）に1mmのガラス毛細管（世界の精密機器を）引いて、いくつかのマイクロインジェクションの針を作製する。慎重に壊れやすいキャピラリーチューブを取り外します。 </li><li>ストアは、ペトリ皿の中で粘着テープで針を（先端を上に向けた状態で）引っ張った。 </li></ol> 2。 B.の準備ブルグドルフェリ <ol><li> B.を育てるmL当たり約10 7の細胞の濃度でまで、BSK文化メディア7のブルグドルフェリ 。スピロヘータはPetroff - Hausser計数室（Hausser科学）を使用して暗視野顕微鏡下でカウントされます。 </li><li>ペレットB.室温で10分間、3,000 xgで遠心分離によってブルグドルフェリ 。 </li><li>上清を除去し、完全に優しくmL当たり10 9細胞の最終濃度に200μL滅菌マイクロチップを通過することによってBSK培地でペレットを再懸濁します。細胞は、高い細胞密度で再懸濁させ、そして、細胞懸濁液は直ちにマイクロインジェクションのために一緒に凝集を使用する必要があります可能性があるため。 </li></ol> 3。準備ティック<ol><li>スライドガラス上に透明な、両面テープを置きます。 </li><li>粘着マット上での作業、慎重に小さなブラシを使用してコンテナから若ダニを除去する。 </li><li>同じ方向を向いて、粘着テープで注入されるダニの必要数、腹側を上に置きます。 </li></ol> 4。注入ティック<ol><li> B.の5μLをロードする20μLmicroloaderピペットチップ（エッペンドルフ）を使用してプルキャピラリー針にブルグドルフェリの文化。閉じ込められた空気の泡のために針を点検し、必要に応じて、細菌培養で針をリロードします。 </li><li>解剖双眼顕微鏡下の目盛りを表示し、ダニの肛門開口部分に焦点を合わせる。ゆっくりと直径がマイクロインジェクションの針を形成し、ダニの肛門開口部のそれよりわずかに小さいチューブを打開するためにキャピラリー針の先端に触れる。非適切な針先でダニを注入しようとするが、注入されたダニの傷害および可能な死の原因として、この手順は重要です。 </li><li>解剖双眼顕微鏡下に固定化したダニを置き、二つの可動肛門のプレートで覆われている肛門絞り、焦点を当てる。細かい鉗子を使用して、軽く触れると肛門開口の近くに任意の領域に非常に穏やかな圧力を適用する。これは、肛門板と腸に接続している肛門細孔の開口部の分離が可能になります。肛門板の強制的な開口部を通って肛門の開口部にわずかに針の先端を慎重に挿入します。ガラスの先端が直腸に接続する半透明の後腸を損傷する可能性があるため、針挿入は最小限に抑える必要があります。自動化されたフットコントロール（エッペンドルフ）を搭載したマイクロインジェクターを使用して、Bを注入する次のパラメータを使用して、 ブルグドルフェリのソリューション：1,000ヘクトパスカル（hPaの）射出圧力、0.2秒噴射時間と8 hPaの補償圧力。それぞれの目盛りは、単回注射を受け取ります。 </li><li>マイクロインジェクションの後、ダニは注射前の状態と同じように動作する必要があります。例えば、ダニは、刺激に応答してクロールする必要があります。 </li><li>我々は通常、ダニは24 °、16時間/ 8時間とC /暗光周期療法、湿度95％に設定した環境室に48時間で回復することができます。チャンバーが使用できない場合は、注入されたダニは、正規のデシケーター室として、密閉容器内で湿った状態で室温で保存することができます。必要に応じてマウスの摂食のために使用される前に、ダニの回復時間も数時間に短縮することができます。 </li></ol> （2）B.共焦点免疫蛍光顕微鏡によるブルグドルフェリのローカライゼーション 1。解剖ティック<ol><li>リン酸の液滴を配置するには、顕微鏡のためのポリ- L -リジンコートしたスライド（シグマ）で解剖し、別のクリーンなガラススライド上に生理食塩水（PBS）を。両面粘着テープで別のスライドガラスを準備する。 </li><li>小さなブラシを使って両面粘着テープで容器と場所からダニを取り除く。 </li><li>解剖顕微鏡でダニを表示し、フォーカス。足の第一および第二の対の間にダニに鋭いカミソリの刃を置きます。しっかりと腹部へのアクセスを許可する2つの部分にダニをカット押し下げます。すぐに、水没PBSの液滴の腹部。 </li><li>非常に微細な鉗子を使用して、カットのサイトの周りに背と腹外骨格をつかむ。慎重に茶色っぽい色の腸憩室を公開するダニから持ち上げ、背側シールドを引き出します。すべての回でPBSの下に解剖ダニを保つように注意してください。 </li><li>半透明の唾液腺のパンdlesは、腸の前方領域の両側に配置され、必要に応じて、この時点で削除することができます。鉗子との場所に残っている外骨格を持って慎重に腹部から腸を引き出します。 </li><li>優しくどんなトラップの組織（例えば、気管を）除去することにより腸をきれいに。 </li><li>微細な鉗子の先端を使用して、すぐにポリ- L -リジンスライドガラス上でPBSの液滴でダニの腸を転送する。微細な刃を使用してより小さな部分に腸を切り離したり、軽く細かい鉗子の先端を押す。慎重に腸組織の周りに余分なPBSを吸引除去する。 </li><li>腸の組織は、室温で風乾する。 </li><li> 10分間アセトンに浸してダニの腸を修正。室温で風​​乾する。スライドは、気密容器内に-20℃で数ヶ月の​​ために、この手順で保存することができます。 </li></ol> 2。染色<ol><li>ティッシュペーパーを使用して、組織の周りに余分な水分を除去し、PAP -ペンなど疎水性のバリアーのライニング装置によって乾燥ダニの腸の周りに円を描く。これにより、その後のインキュベーションステップの間に染色液を保持するのに役立ちます。 </li><li>室温で30分間つまたはブロッキングバッファーの数滴（0.05％PBSのTween - 20、5％ヤギ血清）でダニの腸をカバーしています。ブロッキングのために使用される血清は、抗体の宿主動物のソースによって異なります。スライドが前方にこの点から乾燥させないでください。 </li><li>ゆっくりブロッキングバッファーを吸引除去する。適切なプライマリおよび/または二次抗体溶液と腸をインキュベートします。我々は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）を使用-アンチラベル B室温で1時間ブロッキングバッファーで100倍希釈でブルグドルフェリ抗体（Kirkegaard＆ペリーラボラトリーズ）。光への曝露を制限するためにアルミホイルで容器を覆う。 </li><li>穏やかな吸引によって抗体溶液を取り外します。 4などのラベルティック組織、'、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）またはヨウ化プロピジウムの蛍光色素で腸をインキュベートする。我々は通常、5分間PBSで20μg/ mLのヨウ化プロピジウム（Sigma）を使用してください。室温で。 </li><li> 0.05％のTween - 20 PBSにて3回洗浄する。 </li><li>このようなSlowfade（Invitrogen社）などの褪色防止試薬を含む緩衝グリセロールでスライドをマウントし、慎重にガラスのカバースリップでカバーしています。スライドは、気密容器内で4℃で数ヶ月ごとにこの手順℃で保存することができます。画像とローカライズB.共焦点顕微鏡下でブルグドルフェリ 。 </li></ol> 3。代表的な結果マイクロインジェクションのための若ダニの位置A と B を表す画像ダニの腸内ブルグドルフェリの局在を図1に提示されます。 <img src="/files/ftp_upload/2544/2544fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。マイクロインジェクションとBの局在ダニの腸内にブルグドルフェリ 。 幼虫I.の（A）腹ビューscapularisティックはマイクロインジェクションのために配置されます。挿入したマイクロインジェクションの針（矢印）と肛門絞り（矢じり）がはめ込みに倍率の下に表示されます。細かいforcepは肛門板とマイクロインジェクションのための肛門孔の開口部の分離を許可されて身体に優しい圧力を適用するために使用されます。針が視認性を高めるために、クマシーブリリアントブルー溶液で満たされている。（B）Bの共焦点免疫蛍光イメージングの代表結果ダニの腸内ブルグドルフェリ 。腸憩室の前方領域が表示されます。腸の核とスピロヘータが（矢印）、ヨウ化プロピジウム（赤色）またはFITC結合抗Bと表示されていますそれぞれブルグドルフェリ （緑色）、。バー= 20μmの。

<ol><li>Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+Lyme+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The emergence of Lyme disease.</a> J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).</li>
<li>Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarthold%2C+SW+%22Borrelia%2C+Molecular+Biology%2C+Host+Interaction+and+Pathogenesis%22">Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis</a>. Samuels, D. S., Radolf, J. D. , Caister Academic Press. Chapter 14 353-405 (2010).</li>
<li>Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OspC+facilitates+Borrelia+burgdorferi+invasion+of+Ixodes+scapularis+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands.</a> J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).</li>
<li>Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+OspA%2FB+in+the+life+cycle+of+the+Lyme+disease+spirochete%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete.</a> J Exp Med. 199, 641-648 (2004).</li>
<li>Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BB0323+function+is+essential+for+Borrelia+burgdorferi+virulence+and+persistence+through+tick-rodent+transmission+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle.</a> J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).</li>
<li>Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TROSPA%2C+an+Ixodes+scapularis+receptor+for+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi.</a> Cell. 119, 457-468 (2004).</li>
<li>Barbour, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+Lyme+disease+spirochetes%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+J+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes.</a> Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).</li>
<li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Ixodes+scapularis+anticoagulation+by+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).</li>
<li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tick+antioxidant+facilitates+the+Lyme+disease+agent%27s+successful+migration+from+the+mammalian+host+to+the+arthropod+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent's successful migration from the mammalian host to the arthropod vector.</a> Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).</li>
<li>Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glass+capillary+tube+feeding%3A+a+method+for+infecting+nymphal+Ixodes+scapularis+%28Acari%3A+Ixodidae%29+with+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi.</a> J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).</li>
<li>Policastro, P. F., Schwan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+infection+of+Ixodes+scapularis+larvae+%28Acari%3A+Ixodidae%29+by+immersion+in+low+passage+cultures+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi.</a> J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).</li>
<li>Fuente, dela, Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+the+study+and+genetic+manipulation+of+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks.</a> Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここでは、細菌性病原体Bと若虫マダニ属のダニの迅速かつ効率的な感染症のためにマイクロインジェクションベースの手順を示すブルグドルフェリ 。我々はまた、Bの検出のための共焦点蛍光抗体法の手順を説明します。 その場でダニの腸内ブルグドルフェリ 。私たちのデモでは、幼虫の腸を含むものの、同様の手順ではまた、幼虫、大人8,9のようなダニの他の発育段階、に適用できます。しかし、その小さいサイズのために、技術は、幼虫で使用するために比較的厳しいかもしれないが、大人チックで使用するためにも適用可能であるべきである。 B.とダニの人工的な感染の他の方法ブルグドルフェリは、このようなガラスキャピラリーチューブ10を介して供給として、または培養液11に浸漬によって、開発されている。これらのメソッドは、効率的で簡単かつ比較的安価である。しかし、これらの手順は、B.の比較的制御されていない転送に依存していますしたがって、個々のダニへのブルグドルフ...

<table><tbody><tr><td>ガラスキャピラリーチューブ</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>垂直型ガラスピラー</td><td>Narishige International</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser 计数盤（計数盤）</td><td>Hausser Scientific</td><td>3900</td><td></td></tr><tr><td>Microloader ピペットチップ</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet マイクロインジェクター</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td></td></tr><tr><td>FemtJet フットコントローラー</td><td>Eppendorf</td><td>920005098</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td>フィルター滅菌済み</td></tr></tbody></table>

ティック腸内ライム病の病原体の迅速な伝達とローカリゼーションのための方法

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

ライム病はダニ媒介げっ歯類の感染サイクル1で自然に維持されるスピロヘータの病原体ボレリアブルグドルフェリ 、感染によって引き起こされる。ダニ媒介性マウスモデル2は、実験室でライム病を研究するために開発されました。素朴なダニはB.に感染することができますが、 ブルグドルフェリは、感染マウスにそれらを供給することにより、脱皮のプロセスが完了するまでに数ヶ月に数週間かかる。したがって、このようなマイクロインジェクションベースの手続きとして、より迅速かつ効率的なダニの感染のテクニック、、の開発は、ライム病3,4の研究のための重要なツールです。手順は時間が感染したダニを生成するために必要とし、ダニのコホートにおけるスピロヘータの等量の配信を制御できます。これは、B.の世代としては特に重要です。マウスを使って自然な給餌法によるブルグドルフェリ感染したダニは葉ダニの間で病原体の負担の変動で100％の感染率と潜在的に結果を確実に失敗します。さらに、マイクロインジェクションは、B.とダニに感染するために使用することができます。 ブルグドルフェリは、弱毒株は、マウスでは感染を確立できないため、自然にダニ5によって取得できない場合には隔離。この手法はまた、例えば、特異的な抗体または二重のRNA 6座礁、ダニに他の生物学的、さまざまな素材を提供するために使用することができます。この記事では、Bをin vitroで成長にと若ダニのマイクロインジェクションのデモンストレーションを行いますブルグドルフェリ 。我々はまた、共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いてダニの腸内のライム病の病原体の局在化のための方法を説明します。

ライム病の調査研究は、多くの場合、病原体ボレリアブルグドルフェリ、通常は数週間かかるプロセスに感染したダニの発生を必要とする。ここでは、時間内で達成可能なマイクロインジェクションベースのダニの感染症の手順を示しています。我々はまた、ダニの中でB.ブルグドルフェリのin situ局在のための免疫蛍光法を示しています。

ライム病は、自然界においてマダニとげっ歯類の感染サイクルによって維持されているスピロヘータ病原体であるBorrelia burgdorferiへの感染によって引き起こされます 1. ...

この手順の全体的な目的は、Borrelia burgdorferi細胞をダニの腸内にマイクロインジェクションし、局在化させることです。まず、ガラスキャピラリー針を調製し、そこにB. burgdorferi細胞を満たします。次に、マイクロインジェクションによってB. burgdorferi細胞をダニの腸内へと移行させます。次にダニを解剖し、腸組織を取り出します。最後に、ダニの腸におけるbeberg deferの免疫蛍光標識を行います。これにより、共焦点顕微鏡を用いて、ダニの腸内におけるbeberg to ferryの局在を示す結果を得ることができます。こんにちは。メリーランド大学獣医学部の助教、Ruth Paul Paul博士です。本日は、私の研究室のメンバーであるポストドクターのToro Cairoと大学院生のAdam Colemanが、私たちが日常的に行っている微量注入によるダニの人工感染の手順について解説します。微量注入の後、ダニを解剖し、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いてダニの腸管内の細菌をイメージングします。自然感染させたマダニの世代を生成することと比較して、マダニへのマイクロインジェクションの主な利点は、処置にかかる時間です。自然摂食プロセスで感染マダニを生成するには約5週間を要しますが、マイクロインジェクションはこの全工程を数時間に短縮します。この手法は、RNAi用の二本鎖RNAや、特定の抗体干渉用の抗血清など、他の有用な試薬をマダニ内部に注入するためにも応用可能です。まず、ガラスマイクロピペットプラーを用いて、1 mmのガラスキャピラリーチューブを加熱・延伸し、マイクロインジェクション針を数本作製します。脆弱なキャピラリーチューブを慎重に取り除きます。作製した針は、先端を上に向けて、シャーレ内の粘着テープの上にまとめて保管します。次に、B. berg de ferryをBSK培地で培養します。濃度が約10⁷ cells/mLになるよう、3000 ×gで10分間遠心分離してB. berg de ferryをペレット化します。室温で上清を除去し、200 µLの滅菌マイクロチップで穏やかにピペッティングしてペレットをBSK培地に完全に再懸濁し、最終濃度を10⁹ cells/mLに調整します。細胞を高密度で再懸濁しているため、細胞同士が凝集する可能性があります。そのため、細胞懸濁液は直ちにマイクロインジェクションに使用してください。ダニを準備するには、粘着マットの上でガラススライドに透明な両面テープを貼り、容器からダニを慎重に取り出します。小さなブラシを使用して、注入に必要な数のダニを、腹側を上にして同じ方向に向くように両面テープの上に配置します。プールされたキャピラリーニードルに、beberg de ferry培養液を5 µL充填します。20 µLのマイクロロードピペットチップを使用して、ニードル内に気泡が混入していないかを確認し、必要に応じて細菌培養液を再充填してください。必要に応じて、解剖用実体顕微鏡でマダニを観察し、マダニの肛門孔付近に焦点を合わせます。キャピラリーニードルの先端を軽く叩き、管径がマダニの肛門孔よりもわずかに小さくなるように管を破断させ、微量注入用ニードルを作成します。不適切なニードル先端でマダニに注入を試みると、損傷を与え死に至らしめる可能性があるため、この工程は極めて重要です。注射済みのダニについて。固定したダニを実体顕微鏡下に置き、2枚の可動式肛門板で覆われている肛門孔に焦点を合わせます。微細ピンセットを用いて、肛門孔付近の任意の領域に軽く触れ、ごくわずかな圧力を加えます。これにより、肛門板が分離され、腸へとつながる肛門孔が開きます。肛門板を強制的に開いた状態で、針先を肛門開口部に慎重にわずかだけ挿入します。ガラス製の針先が直腸につながる半透明の後腸を傷つける可能性があるため、針の挿入は最小限に留めてください。自動フットコントロール付きマイクロインジェクターを使用し、以下のパラメータでベルグ・ド・フェリー溶液を注入します。注入圧 1000 Hector Pascals、注入時間 0.2 seconds、補正圧 8 Hector Pascal's。マイクロインジェクション後、各組織に1回ずつ注入を行います。マダニは、注射前と同様に、刺激に対して動きを見せるか、または這い回るはずです。免疫蛍光顕微鏡観察のためにマダニを解剖するには、まず解剖用の清潔なガラススライドにリン酸緩衝生理食塩水の液滴を1滴、ポリLリシンコーティングされたスライドにさらに1滴置きます。顕微鏡観察用に、両面テープを貼った別のガラススライドを用意します。次に、容器からマダニを取り出し、両面テープの上に置きます。解剖顕微鏡でダニに焦点を合わせ、小さなブラシを用いて位置を調整します。ダニの第1脚と第2脚の間に鋭利なカミソリの刃を置きます。強く押し下げてダニを2つに切り分け、腹部を露出させた後、細いピンセットを用いて直ちに腹部をPBSの一滴の中に浸します。切断部位の周囲の背側および腹側の外骨格を掴みます。背甲を慎重に上に持ち上げてダニから引き離し、茶褐色の腸憩室を露出させます。解剖中のダニが常にPBSに浸かっているように注意してください。半透明の唾液腺束は腸の前部の両側に位置しており、必要であればこの時点で除去することができます。ピンセットで残りの外骨格を固定し、腹部から腸を注意深く引き出します。気管などの挟まった組織を取り除き、腸を丁寧に洗浄します。細いピンセットの先を用い、ダニの腸を速やかにポリLリジンコートガラススライド上のPBS液滴に転送します。細いブレードを使用するか、精密ピンセットの先端で軽く押すことで、腸管を小さく断片化します。腸管組織周囲の余分なPBSを注意深く吸引します。腸管組織を室温で風乾させます。ダニの腸管をアセトンに10分間浸して固定します。室温で自然乾燥させてください。この段階で、スライドは密閉容器に入れ-20 °Cで数ヶ月間保存することが可能です。腸管の免疫蛍光標識を行うには、固定したダニの腸管の周囲をPAPペンまたはその他の疎水性バリア形成剤で囲みます。これにより、その後のインキュベーション工程において染色液を保持させることができます。ダニの腸にブロッキングバッファーを1滴または数滴滴下し、室温で30分間静置します。ブロッキングに使用する血清は、抗体の宿主動物の種類によって異なります。ここから先、スライドが乾燥しないようにしてください。ブロッキングバッファーをゆっくりと吸引します。腸管を適切な一次抗体および／または二次抗体溶液でインキュベートします。本手順では、フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）標識抗B. berg抗体を使用します。ブロッキングバッファーで100倍に希釈した抗体を、1時間作用させます。室温にて、光への曝露を制限するために容器をアルミホイルで覆います。抗体溶液を穏やかな吸引によって除去します。DPIやプロピジウムヨードなどの蛍光染料を用いて、マダニ組織を標識するために腸管をインキュベートします。通常、20 µg/mLのヨウ化プロピジウムを含むPBSを用い、室温で5分間処理した後、0.05% Tween 20含有PBSで5分間、3回洗浄します。最後に、抗退色剤を含む緩衝グリセロールでスライドを封入し、カバーガラスで慎重に覆います。スライドは、この段階で密閉容器に入れ、4 °Cで数ヶ月間保存することが可能です。その後、共焦点顕微鏡を用いて画像を撮影し、局在を確認します。ここでは、視認性を高めるためにクマシブリリアントブルーを満たした針を用いたダニへの微量注入を示しています。微細ピンセットを用いて体に緩やかな圧力をかけることで、肛門板を分離させ、微量注入のための肛門孔を開かせることができます。ここでは、腸管内にbeberg ferryが含まれた腸憩室の前部領域を示しています。腸核とスピロヘタは、それぞれプロピジウムヨードまたはfitzy結合抗beberg ferryで標識されます。習熟後、10匹のマダニに、自然状態で10万個の生存個体を含むferをマイクロインジェクションすることが可能であることがわかりました。マダニはすぐに他の実験に使用できますが、通常は処置後の生存を確認するため、1～2日待ってから次へ進みます。このビデオを視聴することで、共焦点免疫蛍光染色の結果を用いて、マイクロおよび局所的なバリアバグをダニの腸内に導入し、人工感染ダニを作製する方法について深く理解できるはずです。ダニおよび Borrelia burgdorferi などのヒト病原体を充填した微細ガラス針を扱う作業には危険が伴います。ダニと針の位置に常に注意を払い、常にバイオセーフティーレベル2の予防措置を講じてください。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

methods-for-rapid-transfer-localization-lyme-disease-pathogens-within

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ダニ媒介性病原体が病気を引き起こす方法感染したダニの体液のコレクション、唾液腺、唾液は勉強することが重要です。このプロトコルでは、餌から体液と唾液腺を収集する方法を示しています...

マダニScapularisダニの唾液、唾液腺、および体液コレクション

ライム病は、北米で最も一般的に報告された媒介疾患である。原因物質、 ボレリア·ブルグドルフェリティックマダニによって送信されたスピロヘータ細菌である。動物モデルでの感染の伝播および検出は、我々はここで説明するダニ送り、使用することによって最適化されています。...

ライム病研究における送信および外因診断法のために動物にダニの摂食

Nested pcr 法は、ライム病ライム病の病原のプローブ DNA を抽出し目盛りに適用できる敏感な具体的で、わかりやすい手法です。最初の PCR 実験は遺伝子特定のプライマーを使用し、内部のプライマーを使用して後続の反応のためのテンプレートとなる長い amplicons...

Nested pcr 法を使用してのタイマー刻みでライム病ライム病スピロヘータを検出

ここでは、空間的そして一時的変更されたホール マウント in situ...

ホール マウントIn Situハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化

16S rRNA 配列ベクトル内で微生物の同定と解析を可能にするための次世代シーケンス プロトコルをご紹介します。このメソッドには、DNA 抽出、増幅し、pcr 法によって、フローセルとバイオインフォマティクスをシーケンス処理シーケンス...

次世代の 16S rRNA 増幅シーケンスによる目盛りマイクロバイ評価

ダニ hemolymph の分析は、いくつかの病原体が病気を引き起こす方法と、ダニ免疫学的がこの感染症にどのように反応するかに関する重要な情報源を表しています。本研究は、真菌 propagules を接種し、 Rhipicephalus microplusうっ積の雌から hemolymph...

無脊椎動物の病理学研究に向けた Hemolymph のMetarhizium Blastospores の収集とRhipicephalus Microplusダニへの接種の開示

細菌細胞間でDNAを移動するバクテリオファージの能力は、それらを細菌宿主の遺伝子操作のための効果的なツールにします。ここで紹介するのは、...

ライム病スピロヘータ・ボレリア・ブルグドルフェリのファージ媒介遺伝子操作

ここに提示されるのは、様々なダニの生活段階の部分的または完全な充血を可能にするために、人工膜システム を介してインビトロで...

肩甲骨イクソデスのためのダニ人工膜給餌

エレクトロポレーションは、外因性DNAを リケッチア属に導入するための迅速で広く採用されている方法です。このプロトコルは、 リケッチア属における偏性細胞内細菌の形質転換のための有用なエレクトロポレーション法を提供する。...

リ ケッチア 属菌を蛍光タンパク質発現シャトルベクターでダニ細胞株に形質転換するエレクトロポレーション法

ここでは、与えられた個々のダニの解剖に続いて、唾液、血リンパ、唾液腺、および中腸を収集し、ダニ媒介病原体の組織特異的局在を研究して、ベクターコンピテンスと病原体とマイクロバイオームの相互作用の理解を進めるプロトコルを提示します。...

個々のマダニ(Acari:Ixodidae)からの唾液、血リンパ、唾液腺、および中腸の抽出

この方法は、3Dプリントされたチャンバーとラボで製造されたシリコーン膜を組み合わせた 、in vitro...

イソディッドダニ研究における人工膜を通って血液を供給するイソディッドマダニ研究

学ぶライム病病原体Borrelia burgdorferiのダニ腸内マイクロインジェクション感染法と免疫蛍光法による局在解析。従来法より短時間で感染ダニを作製し、共焦点顕微鏡で病原体の可視化が可能です。

ティック腸内ライム病の病原体の迅速な伝達とローカリゼーションのための方法

さらに動画を探す