ティック腸内ライム病の病原体の迅速な伝達とローカリゼーションのための方法
2011年2月14日
ライム病の調査研究は、多くの場合、病原体ボレリアブルグドルフェリ、通常は数週間かかるプロセスに感染したダニの発生を必要とする。ここでは、時間内で達成可能なマイクロインジェクションベースのダニの感染症の手順を示しています。我々はまた、ダニの中でB.ブルグドルフェリのin situ局在のための免疫蛍光法を示しています。
この手順の全体的な目標は、ダニ腸内のボレリア ベルク デ フェリー細胞をマイクロ インジェクションして局在化することです。これは、最初にガラスキャピラリー針を準備し、それらをbeberg de ferryセルで満たすことによって達成されます。次に、beberg defer細胞をマイクロインジェクションによりダニ腸に移します。
次に、ダニを解剖し、腸組織を切除します。最後に、ダニ腸内でのbeberg deferの免疫蛍光標識が行われます。最終的には、共焦点顕微鏡を使用して、ダニ腸内でのベバーグからフェリーへの局在を示す結果を得ることができます。
こんにちは、私はDr.ルース・ポール・ポール、メリーランド大学獣医学部助教授です。今日は、私の研究室のメンバーであるポスドク研究員のトロ・カイロと大学院生のアダム・コールマンの2人が、研究室で日常的に行っているマイクロインジェクションによるマダニの人工感染の手順を紹介します。マイクロインジェクション後、ダニを解剖し、共焦点CE顕微鏡を使用してダニ腸内の細菌を画像化します。
自然感染したダニの世代のダニマイクロインジェクションの主な利点は、手順の期間です。マイクロインジェクションは、自然な摂食プロセスによって感染したダニを生成するために約5週間かかるため、数週間の時間から全体の手順を短縮します。この技術は、RNAi用の二本鎖RNAやダニ内部の特異的抗体干渉用の抗血清など、他の有用な試薬を注入するためにも適応させることができます。
ガラスマイクロピペットプル装置で1ミリメートルのガラス毛細管を加熱して引っ張ることにより、いくつかのマイクロインジェクション針の作製を開始する。壊れやすい毛細管を慎重に取り外します。プールした針は、先端を上に向けて粘着テープでペトリ皿に保管します。
次に、BSK文化でb berg de ferryを育てます。中程度から10〜7細胞/ミリリットルのペレットbベルグ・ド・フェリーを3000倍Gで10分間遠心分離することにより。室温でスナットを取り外し、200マイクロリットルの滅菌マイクロチップを穏やかに通過させて、ペレットをBSK培地に再懸濁し、最終濃度10〜9細胞/ミリリットルにします。
細胞は高い細胞密度で再懸濁され、一緒に凝集する可能性があるため、細胞懸濁液はダニを準備するためにマイクロインジェクションにすぐに使用し、粘着性のあるマットで作業するガラススライド上に透明な両面粘着テープを置き、容器からダニを慎重に取り除きます小さなブラシを使用して、注入する必要な数のダニを同じ方向を向いた粘着テープ腹側に置きます。5マイクロリットルのbeberg de ferry培養物をプールされた毛細管針にロードします。20マイクロリットルのマイクロロードのピペットチップを使用して、針に気泡が閉じ込められていないか検査し、細菌培養物で針を再ロードします。
必要に応じて、解剖双眼顕微鏡でダニを観察し、ダニの肛門開口部領域に焦点を合わせます。マイクロインジェクション針を形成するダニの肛門開口部の直径よりもわずかに小さいチューブを壊すために、毛細血管針の先端にそっと触れます。不適切な針先でダニを注入しようとすると、怪我をしたり、死亡する可能性があるため、この手順は重要です。
注入されたダニに。固定されたダニを解剖双眼顕微鏡の下に置き、2つの可動肛門プレートで覆われた肛門開口部に焦点を合わせます。細い鉗子を使用して、肛門の開口部の近くの任意の領域に優しく触れ、非常に穏やかな圧力をかけます。
これにより、肛門板を分離し、腸につながる肛門孔を開くことができます。アナルプレートの強制的な開口部から、針の先端をアナル開口部に少し慎重に挿入します。針の挿入は、ガラスの先端が直腸につながる半透明の後腸を損傷する可能性があるため、最小限に抑える必要があります。
自動フットコントロールを装備したマイクロインジェクターを使用して、次のパラメータを使用してbeberg de ferryソリューションを注入します。1000 Hector Pascalsの注入圧力0.2秒の注入時間、および8 Hector Pascalの補償圧力。各ダニは、マイクロインジェクションに続いて1回の注射を受けます。
ダニは、注射前と同様の刺激に反応して動きの兆候を示すか、這う必要があります。免疫蛍光顕微鏡法のためにダニを解剖するには、まず、解剖のためにきれいなスライドガラス上にリン酸緩衝生理食塩水の液滴を置き、別の液滴をポリLリジンコーティングスライドに置きます顕微鏡検査のために、両面粘着テープで別のスライドガラスを準備します。次に、ダニを容器から取り出し、両面粘着テープの上に置きます。
解剖顕微鏡のビューの下にある小さなブラシを使用して、ダニに焦点を合わせ、鋭いかみそりの刃をダニの1番目と2番目の脚のペアの間に置きます。ダニを2つに切るようにしっかりと押し下げ、腹部を露出させ、細い鉗子を使用して腹部をすぐにPBSの液滴に沈めます。切り傷の部位の周りの背側と腹側の外骨格をつかみます。
背側シールドを慎重に引き上げてダニから離し、茶色がかった色の腸の憩室を露出させます。解剖ダニを常にPBSの下に保つように注意してください。半透明の唾液腺束は、腸の前部の両側にあり、必要に応じてこの時点で除去できます。
残りの外骨格を鉗子で所定の位置に保持し、腹部から腸を慎重に引き出します。気管などの閉じ込められた組織をすべて取り除いて、腸を慎重に洗浄します。細い鉗子の先端を使用して、ダニの腸をポリLリジンガラススライド上のPBSの液滴にすばやく移します。
細かい刃を使用するか、細い鉗子の先端で優しく押すことにより、腸を小さな断片に分離します。腸組織の周りの余分なPBSを慎重に吸引します。腸組織を室温で風乾させます。
ダニの腸をアセトンに10分間浸して固定します。それを風乾させてください、室温のスライドは、このステップでマイナス20°Cで気密容器に数ヶ月間保管することができます。腸の免疫蛍光標識には、パップペンまたはその他の疎水性バリアライニングデバイスで固定されたダニ腸の周りに円を描きます。
これにより、その後のインキュベーションステップで染色液を保持することができます。ダニの腸を1滴または数滴のブロッキングバッファーで30分間覆います。室温で。
ブロッキングに使用される血清は、抗体の宿主動物の供給源によって異なります。この時点からスライドを乾燥させないでください。ブロッキングバッファーをゆっくりと吸引します。
腸内を適切な一次抗体および/または二次抗体溶液とインキュベートします。フルオレセイン、イソチオシアネート、またはFXI標識の抗Bバーグを使用しています。抗体をブロッキングバッファー中で1〜100希釈で1時間延期します。
室温では、光への露出を制限するために、容器をアルミホイルで覆います。穏やかに吸引して抗体溶液を除去します。蛍光色素で腸をインキュベートし、DPIやヨウ化プロピジウムなどのダニ組織を標識します。
通常、PBS中のヨウ化ペリジウム20マイクログラム/ミリリットルを室温で5分間使用し、0.05%tween 20のPBSで5分間3回洗浄します。最後に、スライドをAntifa試薬を含む緩衝グリセロールにセットし、ガラスカバーで慎重に覆います。スリップスライドは、このステップで摂氏4度で数ヶ月間、気密容器の画像と共焦点顕微鏡下で局所的なb berg de ferryに保存することができます。
ダニのマイクロインジェクションは、視認性のためにクマシブリリアントブルーで満たされた針で示されています。細い鉗子を使用して体に穏やかな圧力をかけることで、アナルプレートを分離し、マイクロインジェクションのためのアナル毛穴を開くことができます。ここでは、腸内憩室の前部領域が腸内のベバーグフェリーで示されています。
腸核とスピロヘータは、それぞれヨウ化プロピジウムまたはフィッツィ結合抗ベベルグフェリーで標識されています。マスターすると、10ダニがマイクロインジェクションパワーになり、自然に10万人が生き残り、ferに感染することがわかりました。マダニはすぐに他の実験に使用できますが、通常は1日か2日待って、マダニが手順を生き延びたことを確認してから進めます。
このビデオを見た後、共焦点免疫フローを使用して、ダニ腸内でマイクロおよび局所的なバリアバグによって人工感染ダニを生成する方法を十分に理解しているはずです。マイクロ ダニやブレリア・ブリオール・フライなどのヒトの病原体が詰まった細いガラス針を使った作業は、作業中に危険な場合があります。ダニや針の位置に注意し、常にバイオセーフティレベル2の予防策を実践してください。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この研究は、ボレリア・ブルグドルフェリでダニを感染させるためのマイクロインジェクションベースの方法を提示し、ダニ感染に必要な時間を大幅に短縮します。さらに、ダニ組織内で病原体を局在化させるための免疫蛍光技術を示します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 微生物学
- 媒介生物学
- 病原体局在化
背景
- ライム病はボレリア・ブルグドルフェリ細菌によって引き起こされます。
- ダニはこの病原体の主要な媒介者です。
- 従来のダニ感染方法は時間がかかります。
- 迅速な感染方法は研究効率を高めることができます。
研究目的
- B. ブルグドルフェリでダニを感染させるためのより迅速な方法を開発すること。
- ダニ組織内で病原体の局在化を可能にすること。
- ダニと病原体の相互作用についての理解を深めること。
使用した方法
- マイクロインジェクション用のガラス毛細管針の準備。
- B. ブルグドルフェリ細胞をダニの腸にマイクロインジェクションすること。
- 腸組織を分離するためにダニを解剖すること。
- 腸組織におけるB. ブルグドルフェリの免疫蛍光標識。
主な結果
- B. ブルグドルフェリをダニの腸に成功裏にマイクロインジェクションすること。
- 免疫蛍光を通じて病原体の効果的な局在化を示すこと。
- 共焦点顕微鏡を使用して結果を視覚化すること。
- この方法はダニ感染の時間を大幅に短縮します。
結論
- マイクロインジェクション技術はダニ感染の代替手段として実行可能であること。
- 免疫蛍光により病原体の正確な局在化が可能であること。
- このアプローチはライム病伝播に関するさらなる研究を促進する可能性があること。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid and controlled infection of tick vectors with Borrelia burgdorferi enables efficient study of pathogen-vector interactions critical for Lyme disease research. This microinjection approach reduces infection timelines from weeks to hours, supporting high-throughput screening and mechanistic de-risking in early discovery. The method provides reproducible pathogen delivery, enhancing predictive confidence in target validation and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Borrelia burgdorferi-tick gut interactions to validate therapeutic targets involved in pathogen persistence and transmission.
- Operational Value: Delivers standardized pathogen loads across tick cohorts, reducing variability in infection models and improving assay reproducibility.
- Predictive Value: Supports functional target de-risking by allowing controlled exposure to pathogen strains, including those attenuated in murine models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates infected tick tissues suitable for downstream immunofluorescence and confocal imaging assays to quantify pathogen localization and burden.
- Operational Value: Produces quantifiable, microscopy-ready outputs that enable standardization of pathogen detection readouts across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates preparation of large numbers of uniformly infected ticks, supporting assay reproducibility and platform reuse in vector-based screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a disease-relevant system for studying Borrelia burgdorferi localization in the tick gut, bridging in vitro findings to vector-based pathophysiology.
- Mechanistic De-risking: Enables visualization of pathogen distribution within tick tissues, informing hypotheses about tissue-specific virulence factors and transmission mechanisms.
- Preclinical Model Refinement: Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering consistent pathogen exposure for evaluating intervention efficacy in tick-borne disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation by enabling rapid generation of infected tick vectors and standardized pathogen localization readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of pathogen-vector interactions by delivering controlled quantities of Borrelia burgdorferi to the tick gut for mechanistic interrogation.
- Screening: Produces standardized, infected tick tissues suitable for quantitative immunofluorescence assays, enhancing reproducibility in pathogen detection workflows.
- Analytics: Generates confocal microscopy-based readouts of pathogen localization and burden, enabling comparative analysis across experimental conditions and interventions.
- Translational Research: Connects in vitro pathogen culture to tick tissue localization, supporting biomarker alignment and pathophysiological relevance in vector-borne disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for infecting ticks with diverse biological agents, including antibodies and RNAi reagents, extending utility beyond Borrelia burgdorferi studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in pathogen-vector interactions through localized pathogen detection.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of tick infection models, reducing time and resource investment compared to natural feeding methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency in early discovery by providing rapid, standardized pathogen exposure models for target de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of Lyme disease research initiatives through reliable, high-fidelity infection models that reduce biological variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection techniques, tick handling, and confocal immunofluorescence microscopy.
- Depends on glass capillary needle preparation, microinjector instrumentation, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of injection parameters and gut dissection protocols across teams to ensure consistent pathogen delivery and localization readouts.
- Adaptation to different tick species or pathogen strains may require optimization of needle size, injection pressure, and bacterial concentration.
- Practical limitations include the technical skill required for successful microinjection and gut dissection, as well as the need for biosafety level two containment when handling human pathogens.
