マウスでイメージ細菌感染にルシフェラーゼを用いた

生きている動物における細菌感染症の生物発光イメージングのための方法が説明されています。病原体は、生きた動物における感染症の光学全身イメージングを可能にルシフェラーゼを発現するように変更されます。動物モデルは、ルシフェラーゼを発現する病原体に感染し、病気の結果として得られるコースは、生物発光イメージングによってリアルタイムに可視化することができます。

次の実験の全体的な目標は、宿主の組織や臓器内での感染生物の局在化を可能にする、生きた動物の感染の定量的画像を取得することです。麻酔マウスは、最初に気管内に生物発光細菌に感染します。その後、感染したマウスにルシフェリアンを注射し、IVISシステムでのライブイメージングを行うことができます。

全身画像が得られたら、感染した肺を採取します。単離された臓器のイメージングを実施して、病原体の真の局在を実証することができます。イメージング後、肺を均質化し、微生物負荷を定量化するために細菌増殖培地に希釈プレーティングします。

最終的には、宿主内に存在する病原体の位置と数をリアルタイムで示す結果が得られます。この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、微生物感染の空間ティックに関する洞察を提供するリアルタイムイメージングにより、生きた動物で病原体を視覚化および監視できることです。この手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるMihi Chang博士と、私の研究室の研究者であるSWAT Cilloです。

腹腔内投与から始め、マウスの体重1グラムあたり100マイクログラムのケタミンと10マイクログラムのキシラジンを含む予混合麻酔薬溶液を6〜12週齢のバルブCマウスに注射します。麻酔薬が効くまでマウスをケージに戻します。麻酔が完全かどうかを判断するには、各マウスのフットパッドを握り、ペダル反射反応が発生しないことを確認します。

動物が完全に麻酔されたら、1匹のマウスを取って挿管します。仰向けになって立ちます。テープを使用して、マウスの脚と腕をスタンドに固定します。

挿管スタンドに輪ゴムを固定します。次に、マウスの上切歯の下に置きます。マウスが固定されたら、鉗子を使用して舌を口からそっと引き出します。

次に、耳鏡で鏡をマウスの口の中にそっと挿入し、中咽頭の腹側にある食道の前にある喉頭の開口部を見つけます。喉頭の開口部が特定されたら、ガイドワイヤーを含む22ゲージの1インチカテーテルを、カテーテルハブが切歯に到達するまで気管に挿入します。ガイドワイヤーを取り外し、カテーテルをプラスチックポンプに接続します。

次に、カテーテルに空気を送り込みます。挿管が正しければ、マウスの胸部が膨らみます。カテーテルの正しい配置を確認したら、50マイクロリットルの生物発光細菌溶液を希望の濃度でカテーテルにピペットで注入し、50マイクロリットルの空気を含む1ミリリットルの注射器を取り付けて、溶液をマウスの肺に押し込みます。

2〜3回、カテーテルを取り外し、マウスをケージに戻して、麻酔から回復させます。生物発光イメージングを行う前に、イソフルランを使用してマウスを麻酔します。マウスが完全に麻酔されたら、マウスを誘導チャンバーから取り出し、動物の目を保護するために光学軟膏を穏やかに塗布します。

イメージング中に、マウスをそれぞれイメージングチャンバーに入れ、麻酔マニホールド上のノーズコーンの1つを配置します。マウス間にライトバッフルを使用して、隣接する動物の被写体間の光の反射を防ぎます。最後に、各マウス腹腔内にルシファーの体重1グラムあたり150マイクログラムを注射します。

ルシファーが動物の体全体に10分間分散するのを待ちます。その後、イメージングを開始します。リビングイメージングソフトウェアを起動し、IVISイメージングシステムを初期化します。

最初にパラメータを設定するには、シーケンス設定をクリックします。次に、発光および写真イメージングモードを選択します。画像シーケンスの一部として写真の発光画像と構造光画像を選択し、DLIT 3D再構築を可能にします。

次に、露光時間を1分に設定します。次に、ビニングを中程度に、Fストップを1に調整します。励起フィルターをブロックに設定し、蛍光フィルターを3D再構成用に開くと、異なる波長の複数のフィルターが有効になります。

信号ソースの正確な位置特定を可能にするには、可視化するマウスの数に対応する FOV を選択します。すべての設定を定義したら、アクイジションコントロールパネルのイメージウィザードで[追加]をクリックしてシーケンス設定を追加し、[アクイジション]をクリックしてアクイジション中にイメージングシーケンスを開始します。画像編集ウィンドウに実験の詳細と条件を記録し、画像を保存します。

最後に、マウスをイメージングチャンバーから取り出し、ケージに戻します。動物が麻酔から回復するまで、常に動物を監視してください。組織イメージングのために、マウスを人道的に安楽死させます。

この時点で、各マウスの肺を無菌的に採取し、臓器を滅菌ペトリ皿に移します。感染した肺が入ったペトリ皿をイメージングチャンバー内に置き、このビデオで前述したのと同じ方法で生物発光画像を取得します。画像が得られたら、イメージングチャンバーからペトリ皿を取り出し、滅菌鉗子を使用して、ホモジナイザーを使用して1ミリリットルの滅菌PBSを含むチューブに肺を移し、肺を2〜5分間均質化します。

肺ホモジネートの段階希釈液を滅菌PBSで調製します。次に、各希釈液の100マイクロリットルを選択培地を含むシャーレにプレートします。細菌のコロニーがはっきりと見えるまで、培養物を摂氏37度でインキュベー

次に、CFUをカウントして感染レベルを評価します。リビングイメージソフトウェアを起動し、ファイルブラウザから目的の画像ファイルを開きます。ツールパレット内。

画像調整をクリックして、補正とフィルタリングの設定、およびカラースケールのしきい値を変更します。発光強度を定量化するには、プルダウンリストから関心領域またはROIツールを使用し、ROI形状の数とサイズを選択します。次に、ROI測定をクリックし、定量データ出力を保存して3D画像を再構築します。

まず、構造化されたライト画像を含む画像シーケンスを読み込みます。ツールパレットのサーフェストポグラフィーをクリックします。次に、プルダウンリストで[再構築]タブを選択して、サーフェストポグラフィーを生成します。

次に、ツールパレットから[DILT 3D再構築]を選択します。プルダウンリストの[プロパティ]タブをクリックし、組織のプロパティとソーススペクトルをMuscleに設定します。「解析」タブをクリックし、解析する波長を選択します。

次に、[開始]をクリックします。すべての設定を調整したら、[再構築]をクリックして3D解析を開始します。3D再構成が完了したら、3Dビューを選択して結果タブをクリックして結果を表示し、光子密度、データボクセル、アルゴリズムパラメータを表示し、結果を保存して、データと画像をエクスポートしてさらに分析することができます。

この図に示すように、生物発光細菌の10〜6番目のCFUを気管内に感染させた右の2匹のマウスは、肺領域から強い信号を発しますが、左の非感染マウスはそうではありません。同様の分析:感染したマウスの解剖された肺のみを使用したところ、発光は他の密接に並置された組織からではなく、肺から発せられていることが確認されました。サンプルから発せられるシグナルは、関心領域内の全フラックスとして簡単に定量化できます。

トモグラフィー解析により、これらの画像に赤いボックスとして表示されている発光体の位置が、3D再構成によって決定されたマウスの肺を含む領域内にあることが確認されました。最後に、左側の測定された光子密度曲線と右側のシミュレートされた光子密度曲線との間の類似性は、再構成の品質が良好であることを証明しています。このビデオを見れば、前例に感染した動物を画像化する方法や、回想のローカリゼーションと定量化のために画像を分析する方法を十分に理解できるはずです。