Name: マウスの肝臓虚血のためにハンギング軽量システムの利用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 学ぶマウスの肝臓虚血再灌流モデル。ハンギング軽量システムを用いて左肝門三連管を遮断し、組織損傷を最小限に抑えつつ正確な虚血時間制御を実現します。肝酵素測定と組織学的解析で損傷を評価できます。

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現在の研究は、厚生助成金R01-HL092188、R01-DK083385とR01HL098294と、HKEとDFG（ドイツ学術振興）研究フェローシップ（に麻酔教育研究（FAER）助成財団の米国国立研究所によってサポートされていましたGR2121/1- 1）および米国心臓協会グラントAGへ。

一般的な発言。すべての操作は、直立解剖顕微鏡（ライカ）の下や手術凝固装置を用いて実行する必要があります。実験とシャム群のマウスは、結果の比較可能性を確保するために年齢と体重で一致する必要があります。体温、血圧、麻酔と流体管理は、安定した全体の実験中に監視する必要があります。 1。麻酔と手術<ol><li> C57BL / 6マウスは、10から16週齢の範囲内でなければなりません、彼らは性別をマッチさせたそれぞれのグループでなければなりません。 </li><li>ペントバルビタールナトリウム（70 mg / kg体重のIP）にマウスを麻酔し、約麻酔を維持しています。は10 mg / kg / hのペントバルビタールナトリウム。過量投与は有意に血圧を下げることができるので、結果を変更することができます。 </li><li>サーマル·フィードバックに接続された直腸の温度計のプローブを用いた温度制御加熱されたテーブル（RT、Effenberg、ミュンヘン、ドイツ）の上に置いてマウス37℃で体温を維持するためにコントローラ℃、 </li><li>取り外し可能なテープでテーブルに取り付けられた上下肢で、手術のテーブルの上に仰臥位にマウスを置きます。 </li><li>生存実験髪のクリッピングを含む適切な無菌テクニックを、ヨードフォア（例えばBetadine）で皮膚の消毒、オートクレーブ滅菌した器具の取扱いの場合に、外科医のための滅菌手袋が必要とされるマスクを使用します。 </li></ol> 2。ポータルトライアド咬合<ol><li>皮膚をカットするため、マウスの毛アレルギーのリスクを防止することにより、マウスの毛の吸入を防ぐためにミネラルオイルを切開領域をカバーしています。あなたが容易に肝臓を公開できるように、最大​​の上端に白線の正中開腹切開を行います。可能であれば、出血を防ぐために、凝固電極（エルベ、ICC50、チュービンゲン、ドイツ）で切開を行います。 </li><li>尾が方向であることの位置にマウスを使って加熱テーブルを配置外科医にテッド。その位置は、トライアドをローカライズし、縫合糸を配置するために最適な設定を提供します。 </li><li>ポータルトライアドを公開するために湿った綿棒の綿棒を使用して、右側の腸を置換する。 </li><li>少しダイアフラムに向かって中央と左葉と腸に向かって右葉をシフトします。それはあなたの右、左/中央ローブの分岐上にポータルトライアドのクリアな視界が得られます。 </li><li>慎重にポータルトライアドを検査し、当たり障りのないピンセットでそっと右葉を保持します。それはあなたの左のポータルトライアドの素敵なビューを提供します。 </li><li>左から右側に肝動脈、肝静脈、胆管を含む左側のポータルトライアドの下でニードルホルダーを介して、縫合糸（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ7/0ナイロン縫合糸）を一度視覚的に特定された場所に針をマウスの。 </li><li>ステッチは、トライアドの下に密接にする必要があります。深いステッチの下に配置され静脈VACA劣っを傷つけることができるトライアド。したがって、ステッチを配置する前に下大静脈を識別するために、ピンセットで肝右葉を押したままにします。 </li><li>鉗子で右側の針の先端を取り、肝臓を傷つけることなく肝臓領域外にそっと引き出します。 </li><li>縫合エッペンドルフチュー​​ブ（水で満たされた約3グラム）の各端部に接続し、両方の縫合糸は、縫合糸ホルダーを介して終了に配置します。縫合糸は、右のトライアドに干渉しないようにステッチの遠位縫合糸ホルダーを配置します。 </li><li>ウェイトを適用することにより、トライアドは、肝臓の左と中央葉への血液供給の中断を引き起こし、即座に閉塞されます。成功した閉塞は容易に虚血葉の淡い白化の目視検査によって確認することができる。ぶら下がって重みが極から放出されると肝臓が灌流されたときとは対照的に、色の変更はすぐに消えます。この部分肝虚血モデルではblooを維持することで腸間膜混雑を回避する肝右葉にdフロー。 </li><li>腹腔内に腸を交換してください。 37.0で水に浸した濡れた綿棒℃で、肝臓と腸を暖かく保つさらに、手術を終えた後、市販の食品用ラップでマウスを覆う体温が安定して維持する。 </li><li>実験プロトコルごとに、必要に応じて虚血を実行します。定義されている虚血時間のリリース後に中央値と肝左葉の重量と再灌流は直ちに開始されます。この手法は、マウスで可逆的虚血を作り出すことができます。それ以上の虚血時間が実行されません場合、慎重に縫合糸を除去します。 </li><li> 15分前に直接再灌流後の腹腔内に約400μlの塩化ナトリウムを追加します。再灌流時に流体の損失を補償する100μlの量は30分ごとに流体を代用し続けています。 </li><li>生存実験のために手術創は連続筋肉壁の縫合、皮膚wiを使って閉じている4/0縫合番目。 </li></ol> 3。肝灌流の変化以下の結果のパラメータは肝虚血後に肝障害を決定するために推奨されています。 肝酵素（例えば、ALT、AST）および肝臓組織学（H＆E染色）は、以下の肝虚血再灌流3,9を決定します 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2550/2550fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1肝虚血にかける重みシステムのモデル：吊り下げ重量システムは、左と中央葉3の肝虚血を誘発するために設立されました。 （）したがって、尾状核と右葉はそっと左葉から分離した。右葉は明らかに右、中央と左葉の分岐上にポータルトライアドを表示するには、その後わずかにシフトした。 8.0ナイロン縫合糸は、左肝トライアド下に置かれた。 （B）それぞれの縫合糸の端にある小さな重量（3グラムエッペンドルフTU水で満たされたBES）が付属して適用した。肝虚血は、赤から淡い左と中央葉の色の変化によって表示されます。この実験的なデザインは、重量負荷を適用し、解放することによって肝左トライアドの正確な閉塞および再潅流することができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/2550/2550fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2アラニン（ALT）とアスパラギン酸（AST）マウスにおけるアミノトランスフェラーゼの異なる肝虚血時間の影響。部分的なポータルトライアドの虚血は、示された（ - 60分虚血0）として誘導した。再灌流2時間後、ALT（A）とA​​ST（B）を測定した。 7匹/群 - 結果は平均±SE 6のように表される。 0分虚血（偽コントロール）と比較* P &lt;0.05。

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利害の衝突が宣言されません。

本研究では左肝ポータルトライアドの閉塞にかけるウェイトシステムを使用してマウスモデルにおける虚血を行う手法を説明しています。それは学ぶことが簡単な方法ですが、次の点を考慮する必要があります。初めに非常によくある間違いは、ポータルトライアドと下大静脈を含む深いステッチです。呼吸や心拍​​数が増加し抵抗とマウスの早期死亡の結果心臓に血液を戻すの減少により15分以内に遅くなります。下大静脈の含むを防ぐための最善の方法は、鉗子で右の耳たぶを押したままにしてステッチする前に下大静脈をローカライズすることである。もう一つの重要な問題は、重みがまた右葉への血流を停止し、左右のポータル裁判に過度のストレスになることが重いのではないということです。したがって、エッペンドルフバイアル中の水の量は、マウスの重量とsに調整する必要がありますutureホルダーは、ステッチの場所から遠位に配置する必要があります。ウェイトは低血圧にある場合、反対側を完全に停止されていません。両方ともミスは簡単には、それぞれ中央と左葉右葉または不十分な色の変化の淡いへの追加色の変化で検出されています。したがって、ウェイトを適用後に肝色の変化は10分ごとに制御する必要があります。別の一般的な手術の合併症は、針で肝臓の負傷です。したがって、右の葉は、針の先端が容易に見られ、ニードルホルダーで撮影することができるように当たり障りのない鉗子で押したままにする必要があります。初めにこれらの落とし穴を考慮している場合は肝虚血にかける体重のシステムは、ポータルトライアドのクランプに関連付けられている肝臓の損傷のばらつきを最小化することにより、虚血による再現性の高い傷害を提供しています。壁掛け重量システムを使用して、ポータルのトライアドは、全体を通して一度に操作される外科手術、肝葉に大幅に少ないダメージを与える。さらに、全く肝臓や腸の混雑は、この手法では発生しません。多くの組織の外傷、特に虚血プレコンディショニングの間のような複数の虚血サイクル中にクランプの再適用して、血管クランプを削除し、置き換えることによって発生します。クランプの再適用による肝葉の操作に起因する組織損傷を防止しながら、我々の観察によると、肝臓組織から離れた場所にある重みを掛けるの使用は、信頼性の高い咬合の利点を提供しています。一緒に、本研究では、クランプに関連付けられている変動と制限を最小限に抑え、虚血時の門脈三管閉塞のためにぶら下げ軽量システムの実現可能性を提供しています。したがって、この手法は、肝虚血を研究して検討する他の研究者のために興味があるかもしれません。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム（致命的プラス） </td><td> Vortech製薬Lsは、（株） </td><td> VPL 9372 </td><td>生理食塩水で4 mg / mLの</td></tr><tr><td>縫合糸、プロレン8.0 </td><td>エチコン、米国</td><td> M8739 </td><td>再利用可能な</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td> N / A </td><td>寛大な作動距離を考慮して</td></tr><tr><td>暖房表</td><td> RT、エッフェンベルガー、ドイツ</td><td> N / A </td><td>のみと単一のプロバイダ</td></tr><tr><td>手術器具</td><td> WPI、デュモン</td><td></td><td>鉗子、ニードルホルダー</td></tr><tr><td>凝固剤</td><td>エルベ、ICC50、チュービンゲン、ドイツ</td><td> N / A </td><td> coagulatorsの異なるプロバイダ</td></tr></tbody></table> 表1特異的試薬および装置。

マウスの肝臓虚血のためにハンギング軽量システムの利用

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

虚血による急性肝障害は、いくつかの臨床試験の手続きなどの肝移植、肝腫瘍の切除や外傷の修理時に発生する可能性があると高い死亡率1-2を持つ肝臓に障害が発生することができます。したがって、肝虚血のマウスの研究では、3月9日薬理学的および遺伝学的研究を活用する機会を提供することにより、研究の重要な分野となっています。具体的には、遺伝子の組織特異的欠失（CRE、FLOXシステム）条件付きマウスは、特定の組織10月13日のタンパク質の役割についての洞察を提供しています。ので、手動でマウスのポータルトライアドをクランプに関連付けられている技術的な難しさから、我々は以前に3に記載されているポータルトライアド閉塞用壁掛け重量システムを使用して、体系的な評価を行った。壁掛け重量システムを使用して、我々はまたので、肝葉の損傷を引き起こすことなく、ポータルトライアドの左側の枝の周囲に縫合糸を配置する利用可能な最高のクランプため血管に肝組織の密接な場所の肝組織の損傷を引き起こす可能性があります。さらに、肝トライアドの右枝はまだ右肝葉への血流が維持されるようには腸の混雑は、この手法では発生しませんので、灌流されています。さらに、ポータルトライアドは、全体の手術を通して一度に操作されています。その結果、プレコンディショニングのような手順では、虚血再灌流の短い時間で、簡単に行うことができます。アラニン（ALT）とアスパラギン酸（AST）アミノトランスフェラーゼの血清レベル3,9によって測定された別の虚血再灌流時間を行うことにより、このモデルの体系的評価は、肝臓の損傷による肝虚血時間の密接な相関関係を明らかにした。肝虚血再灌流障害と断続的なハングし体重のシステムを使用する場合は一緒になって、これらの研究は、再現性の高い肝臓の損傷を確認します。したがって、この手法は他の研究者の関心のために役に立つかもしれませんマウスの肝虚血研究におけるED。したがって、ビデオクリップは、この手法の詳細なステップバイステップの説明を提供します。

我々は、ポータルトライアド閉塞のためにぶら下がって体重システムの新規マウスモデルを確立した。この手法は、マウス肝モデルにおける虚血の今後の調査のための役に立つかもしれません。

虚血による急性肝障害は、肝移植、肝腫瘍切除、外傷修復などのさまざまな臨床手技の際に起こり得ます。

本手順の目的は、再灌流障害の研究のために肝虚血を誘発することです。まず、肝葉を露出させます。次に、門脈、肝動脈、および胆管を含む左肝三つ組（left liver triad）を露出させます。分離後、左三門脈周囲を縫合し、吊り下げ式錘システムを用いて肝虚血を誘発します。虚血後、特定の時点で錘を持ち上げ、再灌流を開始します。最終的に、虚血および再灌流後の肝損傷の程度は、血液中のLTおよびSTの測定、および肝組織学的検査によって得ることができます。肝虚血のためにクランプを使用するなどの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、縫合が肝組織に損傷を与えず、虚血のタイミングをより正確に制御できることです。組織を傷つけることなく再現性のある肝虚血を得るには、縫合糸を正確な位置に配置することが極めて重要であるため、本手法の視覚的な実演が不可欠です。まず、滅菌済み器具および手術に必要なすべての材料を揃え、手術領域を準備します。次に、麻酔をかけたマウスを温度制御された加温テーブルの上に仰臥位で配置します。トライアドの特定と縫合を容易にするため、取り外し可能なテープでマウスの上肢と下肢を台に固定します。マウスと加温台を、尾が術者の方を向くように配置します。次に、体温を維持するため、サーマルフィードバックコントローラーに接続された直腸プローブを挿入します。マウスの被毛の吸入を防ぎ、アレルゲンへの曝露を軽減するため、切開部位をミネラルオイルで覆います。動物の準備が整ったら、正中線腹腔切開を行う前に麻酔深度を確認してください。肝臓が容易に露出するまで、白線を切開し続けます。次に、濡らした綿棒を用いて腸管を退け、門脈三つ組（portal triad）を露出させます。視認性を高めるため、中葉と左葉を横隔膜側へ、右葉を腸管側へ移動させます。鈍端鉗子で右葉を固定し、左門脈を明確に視認できるようにします。三管（portal triad）と下大静脈。左側の門脈三管の周囲に慎重に縫合糸をかけます。これには肝動脈、肝静脈、および胆管が含まれます。ピンセットを使用して針の先端を右側から掴み、肝臓を傷つけないように注意しながら、縫合糸をゆっくりと引き抜きます。ステッチは三管（triad）の直下に配置してください。それより深く入れると、下大静脈（vena cava inferior）を損傷する可能性があります。縫合が完了したら、両端に重り付きのエンドチューブを装着します。準備ができたら、これらの重りを、縫合糸よりも遠位にある縫合糸ホルダーの上に置きます。ここに示すように、虚血を開始させるために、両方の重りを縫合糸ホルダーの上に載せます。これにより肝三つ組管が直ちに閉塞し、肝臓の左葉および中葉への血流が遮断されます。正中葉および左肝葉が蒼白になることで、遮断が成功したことを確認します。この部分的な肝虚血モデルでは、右肝葉への血流を維持することで、腸間膜のうっ血を回避しています。あらかじめ設定した虚血時間が経過したら、重りを上げて縫合糸の緊張を解除します。肝臓に再灌流が行われるにつれて、色の変化が見られるはずです。腸管を腹腔内に戻し、温水に浸した濡れた綿球を用いて肝臓と腸管を保温します。再灌流期間の後、血液および肝組織を採取し、肝虚血後の肝損傷の程度を評価することができます。肝損傷の程度は、組織をヘマトキシリン・エオジンで染色することで判定できます。ここで示している健全な組織は、虚血肝と比較して、肝細胞の空胞化や腫脹が少ないことがわかります。ここでは、肝酵素であるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）が、肝損傷の一般的なマーカーとなります。虚血時間を延長させると、LTおよびASTの両方のレベルが上昇しました。マスター1名。この手法は、適切に実施すれば10分以内に完了させることができます。虚血による肝損傷に関するさらなる疑問を解決するために、虚血プレコンディショニングなどの他の手法を実施することができます。

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