鼠径リンパ節の生体顕微鏡

本手順の全体的な目的は、鼠径リンパ節への流入動脈をin vivoで可視化し、評価することです。まず、鼠径リンパ節を覆うマウスの鼠径領域の皮膚を慎重に剥離して皮膚弁を作成します。次に、リンパ節領域を覆っている結合組織を剥離します。

次に、リンパ節へ供給される動脈血管系を露出させるため、周囲の脂肪組織を除去する必要があります。最後に、生体顕微鏡を用いてリンパ節血管系の変化を可視化し、評価します。なお、本日ご覧いただく準備例は鼠径リンパ節の微小循環ですが、この手術手技は骨格筋や脳などの他の部位の準備にも応用可能です。

一般的に、この手法を行う際、初心者が苦労する主な理由は2つあります。1つ目は、生きた動物を扱う点であり、2つ目は、非常に狭い範囲で手術を行うため、血管自体や周囲の領域にわずかでも乱れが生じると、実施しようとしている実験に悪影響を及ぼし、致命的な結果を招く可能性がある点です。したがって、この手法を視覚的に確認することは、成功のために不可欠です。

この手法には複雑な工程が多く含まれており、テキストによる説明だけでは実際の操作に落とし込むのが難しい部分があります。正しく実施するためには、実際に映像で確認することが重要です。研究の成功をお祈りいたします。

まずマウスを麻酔し、手術部位を剃毛します。詳細はテキスト原稿を参照してください。その後、マウスを透明な手術台の上に背臥位で固定します。

各足底パッドをテープで固定し、マウスをボードに取り付けます。実験の前日に、製造元の指示に従ってthes guard 180 4を混合します。次に、標準的な使い捨てペトリ皿を型として使用し、混合液を深さ約1/4インチまで注ぎ、一晩硬化させます。ペトリ皿からthes guardを取り出し、手術用ボードの上に配置します。

除毛し麻酔をかけたマウスを解剖顕微鏡下に置きます。5番ステンレス製ピンセットとストレートブレードのスプリング鋏を用い、腹腔の腹側表面に正中切開を加えます。次に、正中切開を四肢に向かって斜めに広げ、皮膚を脊柱方向へ牽引します。

lnが容易に視認できるようになったら、ステンレス製の昆虫ピンとエポキシコーティング済みのイノックス鑷子を用いて、後退させた皮膚をcigar. 180 4 pedestalに固定します。その部位に生理食塩水またはPSSを加えます。

次に、ln周囲を覆っている薄い結合組織の層を取り除きます。ピンセットを用いて結合組織の小さな断片を慎重に掴み、lnから剥離させます。その後、スプリングシザーを使用して、微小血管床が露出するまでLNを覆い、および周囲にある脂肪組織を除去します。

このステップでは、外科器具が目的の血管に接触しないよう、また周囲の組織を操作する際に血管に過度な力を加えて損傷させないよう、細心の注意を払うことが重要です。lnから脂肪を除去するには、結合組織を緩め、鉗子で脂肪組織をまとめて保持し、視野がクリアになるまで脂肪組織を慎重に取り除く方法が最適です。結合組織と脂肪組織が除去されると、LNに隣接する主要な動脈セグメントと、その上に重なる随伴静脈を視認することができます。

解剖顕微鏡下で目的の血管部位を露出させた後、検体を生体顕微鏡に固定します。灌流ラインと吸引ラインを設置します。この手順の間、露出した組織を常に平衡化PSS溶液で灌流し続けることが不可欠です。

PSSの超灌流は重力を利用して行います。まず初期リザーバーから、5%二酸化炭素バランス窒素で灌流され加熱されたウォータージャケット付きリザーバーへ供給し、その後ドリップラインを通じて毎分10 millilitersの速度で流します。吸引ラインを皮膚フラップの下端に配置し、超灌流したPSSを標本から継続的に除去するようにします。その後、循環水槽の温度とPSSの超灌流速度を確認し、約36 degrees Celsiusの最適温度になるよう調整してください。

調製過程において、血管をPSSで少なくとも60分間平衡化させます。直腸温度計を用いて動物が低体温にならないようにし、外部ヒートランプを設置してください。PSSで平衡化させている間に、血管径を定量します。

ビデオキャリパーを用いて複数の時点で測定し、血管が安定したことを確認します。安定とは、直径の変化が20分間にわたり5 µm以内に留まることと定義されます。直径の測定値は、ChartLabソフトウェアを用いてコンピュータに記録します。平衡化期間の後、ここに示すようにフェニレフリンなどの平滑筋特異的アゴニストを用いて血管の状態を評価します。

アゴニストを溶液に添加します。各ログ増加の累積濃度において、8種類のアゴニストを評価する必要があります。各アゴニストの投与間に、SUP fateにアゴニストを添加して累積濃度を増加させます。PSSを用いた洗浄フェーズを30分間、または血管が安静時径に戻るまで実施してください。

以下は、平衡期間後の鼠径リンパ節の代表的な結果です。動脈に生理食塩水を注入すると鮮明な画像が得られ、ここで赤色の矢印で示される供給動脈と、緑色の矢印で示される静脈の両方を識別することができ、これらが鼠径リンパ節に供給しています。グラフは、生理食塩水にフェニレフリンを累積的に添加した際の、鼠径リンパ節供給動脈の典型的な血管反応性応答を示しています。

10⁻⁹ Mから10⁻⁵ Mの濃度において、強力な血管収縮が見られることは、動脈内に正常な平滑筋機能が存在していることを示唆しています。このグラフは、生理食塩水にアセチルコリンを累積的に添加した際の典型的な血管反応作用を示しています。10⁻⁹ Mから10⁻⁵ Mまでの濃度範囲が表示されています。

強力な血管拡張が認められることは、動脈に正常な内皮機能が存在していることを示唆しています。この調製を行う際に留意すべき重要な点の一つは、成功率を最大限に高めるために、血管およびその周辺領域への刺激を最小限に抑えることです。本手順の後、細胞トラフィッキングなどの他の細胞機能を探索するために、蛍光法などの他の手法を導入することが可能です。

本手法の開発により、免疫学と血管生物学という2つの分野が統合され、血管免疫学という新たな分野への道が開かれました。