Name: 鼠径リンパ節の生体顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 学ぶ鼠径リンパ節の生体顕微鏡法で、マウスのリンパ節微小血管をリアルタイムに可視化する技術。皮膚弁作成と組織剥離により、血管応答や細胞動態の研究に応用可能な方法を習得できます。

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この作業は、保健研究のカナダの協会、北のBCの血液研究所と大学のためのイノベーション、ブリティッシュコロンビア州センターの大学のためのカナダの財団によって運営されている。

1。試薬の調製<ol><li>実験全体で使用される試薬は、外科的プロトコルを開始する前に準備する必要があります。すべてのソリューションは、無菌操作を使用して行われたことに注意してください。 </li><li>基本的な塩溶液と炭酸水素ナトリウム溶液：生理食塩水を（PSS）ベストつのコンポーネントで用意されています。 4の20倍濃度と店舗℃で、両方のソリューションを準備する20Xでの重炭酸ナトリウムは360.0mMのNaHCO 3（84.01g/mol）であり、20X濃度で基本的な塩溶液は、2638.0mM塩化ナトリウム（58.44g/mol）、94.0mM塩化カリウム（74.56g/mol）、40.0mMのCaCl 2•2H 2ですO（147.02g/mol）、および23.4mMのMgSO 4•7H 2 O（246.48g/mol）。解決策は、前、次の化学物質を加えることに明確になるまでのソリューションは、一つずつ追加されるはずのdH 2 Oと化学物質で作製し、攪拌してください</li><li>重炭酸ナトリウムおよび基本的な塩溶液の等量を希釈し、1X濃度（のdH 2 O中の各重炭酸ナトリウムと塩基性塩のソリューションの2つのPSSの2L希釈100mLのために希釈することにより、PSSの2Lの準備</li><li> 37℃の水浴中にPSSとPSSを含む場所2Lのメスフラスコ。外科手術開始前1時間、5％CO 2 /バランスの窒素ガスでソリューションを平衡化する。 </li><li>血管作動性化学物質は、（例：フェニレフリン、アセチルコリン、ニトロプルシドナトリウム）最高-20℃でdH2Oで1M濃度に調製し、100μlのアリコートに格納されています</li></ol> 2。動物の準備<ol><li>マウスの重量を決定し、腹腔内注射によって90mg/kgでペントバルビタールナトリウムの初期投与量を管理する。手順ではマウスは、継続的につま先のピンチと呼吸数の精査を経由して麻酔の平面のために監視されます。麻酔の平面を維持するために20mg/kgで、必要に応じてペントバルビタールナトリウムの追加の注射を投与する必要があります。ノーザンBCの大学の動物実験委員会（ACUC）によって承認された動物のケアのプロトコルで説明されている麻酔の外科的平面は、連邦政府と制度の規定に従って維持されている。 </li><li>シェーバーで腹部と脇腹/ヒップエリアから毛を取り除く。アルコールに浸した綿棒で、残りの抜け毛を削除し、テープでエリアをパッティング。この実験的な手順は、端末であるため、これで十分です。 </li><li>仰臥位での明確な手術ボード上にマウスを置いて、ボードにそれぞれの足蹠をテープでボードにマウスを添付。体温は、外部の熱のランプを経由して維持され、その低体温は麻酔薬の結果として発生しないように直腸の温度計を介して監視されます。 </li></ol> 3。外科手術<ol><li>全体の外科手術中に曝露された組織が常に平衡加温したPSS溶液を用いて灌流保管されていることを確認します。手術器具との利益の血管に接触するか、またはそれらのまわりの脂肪組織や結合組織を操作することによって、それらに多くの力に置くことによって、血管を傷つけることにも重要です。 </li><li>解剖範囲の下にマウスを置きます。腹腔内の腹側表面に沿って正中切開を行い、マウスの脊柱に向かって皮膚を引っ込める。 </li><li>皮膚はLNが容易に見えるように収納されると、透明なSylgard 184の台座の上に皮膚をピン。 </li><li> LNの周りの領域を重ね合わせる結合組織の薄い層を削除します。 </li><li>脂肪組織のオーバーレイをオフにして、微小血管床が露出するまでリンパ節を囲む。メイン動脈セグメントはLNに隣接して産むと、一般的に静脈によってオーバーレイされる。全体の手術は約30分かかります。 </li></ol> 4。イメージングと血管の解析<ol><li>興味の血管セグメントは解剖範囲で露出されると、生体内顕微鏡で準備を確保する。動物はしばらくの間実験の期間中は、生体内顕微鏡で明確な手術ボード上に残っていることに注意してください。外科の項中に説明されているように体温は熱のランプを経由して維持され、直腸温度計によって測定される。セクション2.1で説明したように麻酔の面はまた、実験を通してモニターされる。 </li><li>灌流と吸引ラインを設定します。 PSSの灌流は、5％CO 2バランス窒素によって灌流されているウォータージャケット温水タンク（ウォータージャケットを循環水浴中で循環し、加熱される）、にと10ミリリットルの速度でドリップラインダウン、貯水池からの重力供給によって発生する/分。吸引ラインは、準備から灌流PSSを引く継続するために使用する必要があります。前の実験に吸引ラインとウォータージャケットが完全に洗浄され、各実験後に保存されていることに注意してください。これは、次の実験の前に無菌性を保証します。 </li><li> superfusing PSSの温度を確認してください。の温度を調整する° Cの準備を越え〜37の温度を達成するために水浴及び/またはPSS灌流の速度を循環。 </li><li>血管系は、少なくとも60分間PSSと平衡とビデオキャリパーを使用して血管の直径を定量化することができます。通常は、血管の直径は、容器が安定して確保するために（例えば、少なくとも40、50、および60分）複数のポイントで決定されるべきである。 </li><li>平滑筋特異的アゴニスト（例：フェニレフリン、PE）と内皮細胞特異的アゴニスト（例：アセチルコリン、アセチルコリン）を使用して、容器の健全性を評価する。アゴニストの濃度は、アゴニストに応じて調整する必要がありますが、PEとAchのための容器はsuperfusateに累積加算（10 - 9M〜10 - 5M）で各濃度で評価すべきである。各アゴニストのアプリケーションは、安静時の直径に船が戻るまでPSSを使用して洗浄の段階（通常は30分）で区切る必要があります。 </li><li>実験をトレース容器の健全性、その後の血管作用薬、蛍光標識、およびセルの次の評価を行うことができる。 </li><li>実験終了後動物をペントバルビタールナトリウムの過剰摂取を与えられます。動物は、つま先のピンチと呼吸運動や心臓の拍が不足しても応答がないことを保証するために監視されます。そのような時にこれを頸部脱臼が続いている。 </li></ol> 5。代表的な結果： 平衡期間は、次の準備には鼠径リンパ節を供給する細動脈と細静脈の両方の識別を可能にする明確なイメージを生成する必要があります。細動脈と明らかに血管の直径を計算するために重畳されるビデオのキャリパーのために観察される細静脈の壁を可能にするために船を囲む最小の脂肪細胞があるはずです。成功する準備の積分点では、細動脈の内腔を通って血管緊張のかなりの程度（すなわち、細動脈がvasoconstrictとそれぞれ筋肉と血管内皮特異的なアゴニストを滑らかにするvasodilateする能力を持っている）があることを移動する血​​液の豊富な供給を持っているです。 。 <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="図1"> 図1。生理食塩水と側面に沿って主要な静脈（緑の矢印）を実行しているで平衡化したリンパ節を供給鼠径リンパ節飼料細動脈（赤矢印）の生体顕微鏡像。 <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="図2"> 図2。濃度から生理食塩水に累積加算により灌流フェニレフリン（PE）への正常な血管作動性応答10 -9 M〜10 -5 M堅牢な血管収縮の存在は、動脈内に存在する通常の平滑筋の機能の示唆するものである。 <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="図3"> 図3。濃度10 -9 Mから10 -5 Mと生理食塩水に累積加算により灌流アセチルコリン（ACH）のノーマル血管反応堅牢な血管拡張の存在は、動脈内に存在する正常な内皮機能の示唆するものである。

<ol><li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li>
<li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li>
<li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li>
<li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li>
<li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li>
<li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介する鼠径リンパ節の生体顕微鏡は、生体内のリンパ節の画像の微小血管系に機能を提供しています。従って、それは直接、リアルタイムで観察する手段を容易にします。 LN微小血管系のイメージングは​​1つが免疫応答と血管の間のインターフェイスを研究することができるユニークなサイトです。この準備を使用して、フォーカスが免疫応答、血管系の変化で、または2つの間の相互作用で特に指示することができます。 すべての実験的アプローチと同様に、標準的な生体顕微鏡は、利点と限界の両方があります。ここで説明する準備のような標準IVMは、、簡単に修正することができる、と以前に蛍光トレーサーの染料または標識細胞集団の導入による落射蛍光顕微鏡法を可能にするために著者らによって実証されている。標準IVMは、3次元イメージングの可能性を与え、二光子顕微鏡または血管造影、細胞の追跡がまだであることが細胞間および細胞 - 血管系の相互作用を可能にする二次元で達成されることによって与えられることになるようトレースをしていませんが、観察し、定量化し、蛍光抗体での生体内投与し、その後の染色と組み合わせてリアルタイムでタンパク質/マーカーの発現に関するデータを提供するために使用することができます。 特に、代替のイメージング技術は、画像の静的な環境を必要とする、外科領域または平らな準備でカバースリップのほかのクランピングすることは頻繁に必要とされる。この制限は、、積極的に血管の整合性と生理学等またはIVMの準備中のように行わ血管拡張の実験のような他の手法の使用を評価するための準備を介して血管または他のメディエーターを灌流することを排除しない場合は。さらに、標準IVMは完全に平らな準備を必要とせず、そのような動物の呼吸によって生成されるように、運動の影響を受けません。これは、標準のIVMが高い再現性とより多くの外科領域で使用することができます。これは、ここで説明鼠径リンパ節の準備が例示される。リンパ節の大きさや形を考えると、準備が組織を傷つけることなく平坦にすることができないと、ノードの位置は、動物の呼吸のために重要な動きを生じさせる。このような問題は、他の方法で克服するのは困難ですが、簡単に説明した標準IVMの準備を使用して処理されています。 要約すると、上記の詳細製剤は、他の生化学、血管、および/またはそのような活性化または標識された細胞のサブセットの転送、低酸素症の誘導、および血管メディエーターの枯渇の過剰発現などの免疫学的手法は、任意の数と組み合わせることができます。しかし、追加のアプリケーションは、最初の準備の健康に依存しています。したがって、それは常にイメージングと評価されている血管の状態をテストすることが重要です。健康の準備を達成するためのキーポイントは、準備が常に体温で平衡化PSSで灌流して手術中に外科領域に配置接触し、ストレスを最小限に抑えている保証しています。

<a href="https://app.jove.com/t/6652">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/2551">10.3791/2551</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/2551">Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node</a>. The Authors&#160;and Discussion&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>シグマアルドリッチ</td></tr><tr><td>ニトロプルシドナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td></tr><tr><td>フェニレフリン</td><td>シグマアルドリッチ</td></tr><tr><td>アセチルコリン</td><td>シグマアルドリッチ</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム七水和物</td><td>シグマアルドリッチ</td></tr><tr><td> Pentobarbitolナトリウム</td><td></td></tr></tbody></table>

鼠径リンパ節の生体顕微鏡

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

体全体にあるリンパ節は、（LNの）、、免疫システムの不可欠なコンポーネントです。彼らはそれゆえ、適応免疫応答の誘導のためのサイトとして機能し、エフェクター細胞の開発。このように、LNSは、侵入病原体と戦うと健康を維持するための鍵となります。研究へのLNの選択は、アクセシビリティと希望するモデルによって決定され、鼠径リンパ節はよく位置しており、容易に皮膚および性器粘膜感染症の生物学的に関連するモデルの研究をサポートしています。 鼠径LNは、すべてのLNSのように、血でそれを提供する広範な微小血管のネットワークを持っています。一般的には、この微小血管ネットワークは高内皮細静脈（HEVのを）供給続いて枝とLNの主要な飼料細動脈が含まれています。ハイブリッド自動車は、恒常性と感染の両方の間にLNに免疫細胞の人身売買を容易にするために特化されます。ハイブリッド車は、このような状況の両方でLNに人身売買を規制する方法強烈な探求の領域です。 LNフィード細動脈、ハイブリッド車で直接上流の影響力を持っており、LNへの栄養素と細胞を豊富に含む血液の主な供給です。さらに、フィードの細動脈の変化は、適応免疫応答の誘導を促進に関与している。 LN微小血管系では、LNに最適な血液供給を維持し、適切なLN関数とその後の免疫応答において重要な要素であるLN、中に免疫細胞の流入を調節するのに明らかな重要性を持っています。 in vivoでの LN微小血管系を研究する能力は、免疫系および微小血管系の相互作用とLN内でお互いにどのように影響するかを解明する鍵となります。ここでは、鼠径リンパ節のin vivoイメージングのための手法を提案する。私たちは、健康な血管の研究、数時間にわたって実行可能な血管のイメージングを維持する能力、および容器の大きさの定量化を確保する方法に特に注意を払って、LNの微小血管のイメージングに焦点を当てる。血管作用薬だけでなく、携帯電話のトラフィックをトレースし、定量化する可能性のある微小血管の灌流のための方法も紹介されています。 鼠径LNの生体顕微鏡は、微小血管の機能と免疫細胞、LN、および微小循環の間に直接的なインタフェースのリアルタイムインタフェースを直接評価することができます。多くの免疫学的手法と同様に他のLNSの血管系を研究するために操作蛍光細胞標識と一緒に使われることが潜在的なこの手法。

鼠径リンパ節（LN）の生体顕微鏡検査を行うための手法が説明されています。そのような技術は、リアルタイムを可能に<em&gt; in vivoで</em&gt;ホメオスタシスと感染時の両方のリンパ節の微小血管系と構造の研究。この手法は、細胞のトラフィッキングの研究にと他のリンパ節の部位に適応することができます。

体中に配置されているリンパ節（LN）は、免疫系の不可欠な構成要素である。リンパ節は、適応免疫の誘導の場として機能し、...

本手順の全体的な目的は、鼠径リンパ節への流入動脈をin vivoで可視化し、評価することです。まず、鼠径リンパ節を覆うマウスの鼠径領域の皮膚を慎重に剥離して皮膚弁を作成します。次に、リンパ節領域を覆っている結合組織を剥離します。次に、リンパ節へ供給される動脈血管系を露出させるため、周囲の脂肪組織を除去する必要があります。最後に、生体顕微鏡を用いてリンパ節血管系の変化を可視化し、評価します。なお、本日ご覧いただく準備例は鼠径リンパ節の微小循環ですが、この手術手技は骨格筋や脳などの他の部位の準備にも応用可能です。一般的に、この手法を行う際、初心者が苦労する主な理由は2つあります。1つ目は、生きた動物を扱う点であり、2つ目は、非常に狭い範囲で手術を行うため、血管自体や周囲の領域にわずかでも乱れが生じると、実施しようとしている実験に悪影響を及ぼし、致命的な結果を招く可能性がある点です。したがって、この手法を視覚的に確認することは、成功のために不可欠です。この手法には複雑な工程が多く含まれており、テキストによる説明だけでは実際の操作に落とし込むのが難しい部分があります。正しく実施するためには、実際に映像で確認することが重要です。研究の成功をお祈りいたします。まずマウスを麻酔し、手術部位を剃毛します。詳細はテキスト原稿を参照してください。その後、マウスを透明な手術台の上に背臥位で固定します。各足底パッドをテープで固定し、マウスをボードに取り付けます。実験の前日に、製造元の指示に従ってthes guard 180 4を混合します。次に、標準的な使い捨てペトリ皿を型として使用し、混合液を深さ約1/4インチまで注ぎ、一晩硬化させます。ペトリ皿からthes guardを取り出し、手術用ボードの上に配置します。除毛し麻酔をかけたマウスを解剖顕微鏡下に置きます。5番ステンレス製ピンセットとストレートブレードのスプリング鋏を用い、腹腔の腹側表面に正中切開を加えます。次に、正中切開を四肢に向かって斜めに広げ、皮膚を脊柱方向へ牽引します。lnが容易に視認できるようになったら、ステンレス製の昆虫ピンとエポキシコーティング済みのイノックス鑷子を用いて、後退させた皮膚をcigar. 180 4 pedestalに固定します。その部位に生理食塩水またはPSSを加えます。次に、ln周囲を覆っている薄い結合組織の層を取り除きます。ピンセットを用いて結合組織の小さな断片を慎重に掴み、lnから剥離させます。その後、スプリングシザーを使用して、微小血管床が露出するまでLNを覆い、および周囲にある脂肪組織を除去します。このステップでは、外科器具が目的の血管に接触しないよう、また周囲の組織を操作する際に血管に過度な力を加えて損傷させないよう、細心の注意を払うことが重要です。lnから脂肪を除去するには、結合組織を緩め、鉗子で脂肪組織をまとめて保持し、視野がクリアになるまで脂肪組織を慎重に取り除く方法が最適です。結合組織と脂肪組織が除去されると、LNに隣接する主要な動脈セグメントと、その上に重なる随伴静脈を視認することができます。解剖顕微鏡下で目的の血管部位を露出させた後、検体を生体顕微鏡に固定します。灌流ラインと吸引ラインを設置します。この手順の間、露出した組織を常に平衡化PSS溶液で灌流し続けることが不可欠です。PSSの超灌流は重力を利用して行います。まず初期リザーバーから、5%二酸化炭素バランス窒素で灌流され加熱されたウォータージャケット付きリザーバーへ供給し、その後ドリップラインを通じて毎分10 millilitersの速度で流します。吸引ラインを皮膚フラップの下端に配置し、超灌流したPSSを標本から継続的に除去するようにします。その後、循環水槽の温度とPSSの超灌流速度を確認し、約36 degrees Celsiusの最適温度になるよう調整してください。調製過程において、血管をPSSで少なくとも60分間平衡化させます。直腸温度計を用いて動物が低体温にならないようにし、外部ヒートランプを設置してください。PSSで平衡化させている間に、血管径を定量します。ビデオキャリパーを用いて複数の時点で測定し、血管が安定したことを確認します。安定とは、直径の変化が20分間にわたり5 µm以内に留まることと定義されます。直径の測定値は、ChartLabソフトウェアを用いてコンピュータに記録します。平衡化期間の後、ここに示すようにフェニレフリンなどの平滑筋特異的アゴニストを用いて血管の状態を評価します。アゴニストを溶液に添加します。各ログ増加の累積濃度において、8種類のアゴニストを評価する必要があります。各アゴニストの投与間に、SUP fateにアゴニストを添加して累積濃度を増加させます。PSSを用いた洗浄フェーズを30分間、または血管が安静時径に戻るまで実施してください。以下は、平衡期間後の鼠径リンパ節の代表的な結果です。動脈に生理食塩水を注入すると鮮明な画像が得られ、ここで赤色の矢印で示される供給動脈と、緑色の矢印で示される静脈の両方を識別することができ、これらが鼠径リンパ節に供給しています。グラフは、生理食塩水にフェニレフリンを累積的に添加した際の、鼠径リンパ節供給動脈の典型的な血管反応性応答を示しています。10⁻⁹ Mから10⁻⁵ Mの濃度において、強力な血管収縮が見られることは、動脈内に正常な平滑筋機能が存在していることを示唆しています。このグラフは、生理食塩水にアセチルコリンを累積的に添加した際の典型的な血管反応作用を示しています。10⁻⁹ Mから10⁻⁵ Mまでの濃度範囲が表示されています。強力な血管拡張が認められることは、動脈に正常な内皮機能が存在していることを示唆しています。この調製を行う際に留意すべき重要な点の一つは、成功率を最大限に高めるために、血管およびその周辺領域への刺激を最小限に抑えることです。本手順の後、細胞トラフィッキングなどの他の細胞機能を探索するために、蛍光法などの他の手法を導入することが可能です。本手法の開発により、免疫学と血管生物学という2つの分野が統合され、血管免疫学という新たな分野への道が開かれました。

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