頭蓋顔面の開発時には外胚葉上皮のシグナリング特性を評価する

本手順の全体的な目的は、ドナー胚の外胚葉をニワトリ胚の発達中の上顎に移植し、キメラ胚を作製することです。まず、移植用のドナー皮膚を除去し、次いでホスト部位を移植に向けて準備することでこれを達成します。

手順の最終ステップは、ドナー組織をホスト部位に配置し、移植片を固定することです。最終的に、ドナー外胚葉のみが生着した結果を得ることができ、分子生物学的および形態学的解析を通じて、ドナー再コード真皮の機能を決定できます。この手法は、形態形成におけるさまざまな組織の役割を特定するなど、発生生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

本手順の実演は、当研究室のシニアインベスティゲーターであるDr.Dianeが担当します。本手順を開始する前に、培地を調製し、必要なすべての溶液が準備され、適切な温度にあることを確認してください。次に、適切な眼保護具を着用した状態で、マイクロキャピラリーチューブをアルコールランプの炎で加熱し、先端を細く引き伸ばします。

プロパンガスのトーチの炎でタングステン針を加熱し、ガラスピンを用いて先端を鋭くします。卵の端にテープを貼り、殻からドナー胚の抽出を開始します。次に、解剖針の先を使用して、テープの中央に小さな穴を開けます。

10 mLシリンジと18ゲージの皮下注射針を穴に挿入し、卵から1 mLのアルブミンを抽出します。次に、解剖針を用いて殻の上部に小さな穴を開けます。この穴を覆うように、2枚目のテープを貼ります。

2組のピンセットを用いて、卵に円形の開口部を作ります。胚を掴み、洗浄のために氷冷したPBSを入れたディッシュに移します。胚の頭部を取り除いた後、室温で血清不含のDMEMが入った組織培養ディッシュに配置します。

ピンセットで頭部を保持しながら、ディッシュを解剖顕微鏡の下に置きます。スプリングシザーを使用して、上顎とラゴンを頭部の残りの部分から粗解剖します。次に、鋭利なカミソリを装着したブレードホルダーを用い、上顎から前鼻突起を切り出します。

ピペットを用いて前頭鼻突起をPBS中の十分な量のdispaを含む30 mmペトリ皿に移し、氷上で20分間インキュベートします。インキュベーション時間が経過した後、組織を乱さないようにdispa溶液を吸引除去します。その後、1% BSA含有DMEMで組織全体を覆います。

消化を停止させるため、組織を新しい培養皿に移します。次に、解剖顕微鏡下で操作を行います。研磨していないタングステン針で組織を固定し、研磨したタングステン針を用いて操作してください。

外胚葉を他の組織から剥離して分離させます。準備が整ったら、宿主の移植準備が完了するまで、BSAを含むDMEMに入れ、氷上で移植組織を保存します。 previously demonstrated methodを用いて、鶏卵にウィンドウを作成します。

2組のピンセットを使用して、胚を含む卵を実体顕微鏡の下に配置します。IGN膜と羊膜をつかみ、そっと破って穴を開け、宿主胚を露出させます。一方のピンセットで頭部を固定しながら、もう一方のピンセットを右目に当てて圧力を加え、頭部を回転させます。

ピンセットと針を用いて、移植片を収容するためにホストの真皮を除去します。準備した移植片が入ったペトリ皿に、ニュートラルレッドを2 µL加えます。ガラスピペットを使用して、移植片をホストに転送します。

除去した外胚葉に置き換える位置に、移植片を配置します。移植後の移植片を固定するため、移植組織の各角にガラスピンを挿入します。テープでウィンドウをしっかりと閉じます。

解析に必要な発生段階に達するまで、胚をインキュベーターに戻します。この画像は、ウズラ特異的anti Q-C-P-N-A抗体で染色されたウズラの雛のURA組織を示しています。移植された組織は2つの矢印の間に位置しています。マウスと雛のキメラに見られる宿主組織では、QCPN染色の根拠は見られません。ここでも、移植された組織は2つの矢印の間に位置しています。Cでは、sign B two反復配列に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーションの結果を示しています。

クラス1遺伝子のミラーリングにより、sign B 2の発現が、ここに画像で示す移植片からなる領域に限定されていることが明らかになりました。これはトリクローム染色を施したウズラとニワトリのキメラミラーです。トリクローム染色では、コラーゲンと骨が青色に染まります。矢印で示されているように、上顎骨の重複が見られます。この画像は、同様にトリクローム染色を施したマウスとニワトリのキメラミラーを示しています。

上顎骨の重複が見られます。この画像は、マウスとニワトリのキメラ組織を用いた、ニワトリ胚の中胚葉における正常な BMP7 発現の放射性C2ハイブリダイゼーションを示しています。矢印で示されているように、移植片に隣接する中胚葉において BMP7 の発現が誘導されていることがわかります。

このビデオを視聴することで、前額突起および鼻突起の発達を調節するメカニズムを評価するための、ニワトリ胚の操作方法について十分に理解できるはずです。