Name: のために人間のルシフェラーゼ-タグ付き悪性末梢神経鞘腫瘍細胞の同所Xenografting in vivoでテスト (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学ぶルシフェラーゼ標識悪性末梢神経鞘腫瘍細胞の坐骨神経同所移植法。免疫不全マウスを用いたin vivoバイオルミネセンスイメージングにより腫瘍成長をモニタリングし、候補治療薬の効果を評価する信頼性の高いモデルを確立します。

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この作品は、との省（ケビンA.ロスとSLCとKRZにCA13148 - 35にSLCにR01 CA122804、R01 CA134773）神経疾患と脳卒中の国立研究所（SLCにR01 NS048353）、国立癌研究所によってサポートされていました防衛（SLCへX81XWH - 09 - 1 - 0086）。 UABの包括的がんセンター小動物イメージングの共有施設の運転を支援する資金をNCIコアサポート助成金（; E.パートリッジ、PI P30 CA13148 - 35）により提供された。我々はアラバマ神経科学ブループリントコアセンター（P30 NS57098）とその支援のためのUABの神経科学コアセンター（P30 NS47466）を感謝。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも健康や国防総省の国立研究所の公式見解を表すものではありません。

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利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介する詳細な同所xenografting方法は、我々は、広くこれらのNF1関連末梢神経鞘腫瘍の研究で使用されている行をST88 - 14 MPNST細胞を用いて開発したものです。しかし、この方法論は、他のMPNSTの細胞株と前臨床研究のための容易に適応可能である。例えば、我々はまた、我々はST88で観察されたと同様の成功と、STS - 26T 10個の細胞、NF1関連MPNSTから導出される散発的に発生するMPNSTとT265 - 2C 11細胞に由来するラインでxenografting同所行われている-14細胞。 、我々はST88 - 14細胞のxenografting同所性のためにここに記述する正確な条件は、直接他のMPNST行のグラフト化のために採用することができないことに注意することをということ。代わりに、方法論の重要なパラメータは経験的に各細胞株ごとに決定する必要があります。これらのパラメータは、最初に移植したMPNST細胞数、移植片の開発と、より少ない程度に、腫瘍細胞が注入されているボリュームに許可される時間が含まれています。新しい行のためにこれらのパラメータを確立するために、我々 10 3と5〜マウスの移植群（1群5匹）× 10 6腫瘍細胞、大きさの注文ごとに細胞の2つの濃度をチェックする（すなわち、10 3個 、5 × 10 3個 、10 4個 、5 × 10 4細胞、等）。腫瘍細胞数が多い（&gt; 10 6）がより大きなボリュームで注入する必要があります我々は、最高5 mLまでは移植された神経由来の細胞を失うことなく注入できることを見出した。我々はまた、高密度懸濁液が腫瘍細胞を殺すせん断にますますやすくなるように5 mLの体積あたりせいぜい5 × 10 6個の腫瘍細胞を注入することができることを見出した。各グループ内の少なくとも3匹が触知可能腫瘍を持ってまで、我々は、そのグループを終了し、移植片の成長を確認するために組織学的に神経を調べ、その時点で、これらのマウスに従ってください。一般的に、我々は30〜60日以内に最大許容腫瘍の成長を達する細胞の濃度を求めている、明らかに、時間はこの時点では注入された細胞の数に応じて、異なります到達するために必要な。より急速な成長は難しい実験の終了前に効果的な治療濃度を達成するために作成して/または実験の過程で十分な生物発光イメージングのデータポイントのコレクションを防ぐことができます。 60日よりも長い時間のコースでは、実験パラメータは扱いにくいの調整になり、不必要に計画された実験の期間を延長する。 最後に、我々はまた、我々はタモキシフェン6の治療効果を実証するためにNIH IIIのマウスに移植したST88 - 14細胞でこの同所xenografting方法論を使用していることを指摘しておきます。我々が日常的に同所性異種移植片に対する候補治療薬の効果を評価するために使用する方法の詳細な説明は、その原稿に記載されています。また、神経線維腫の細胞が正常に修正を加えて、このプロトコルで説明する手順は、神経線維腫に対して向けられた候補の治療薬と前臨床試験を実行するために使用できる、ことを示唆し、末梢神経12に接ぎ木することができることが実証されている。

<table><tbody><tr><td>FoxchaseアウトブレッドSCIDマウス</td><td>Charles River Laboratories</td><td>#236</td><td></td></tr><tr><td>NIH IIIマウス</td><td>Taconic</td><td>#NIHBNX</td><td></td></tr><tr><td>NOD-SCID&amp;#947;マウス</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#005557</td><td></td></tr><tr><td>セルストリッパー</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-056-cl</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond外科用接着剤</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ</td><td>Hamilton Co</td><td>#80030</td><td>容量 10 &amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ針</td><td>Hamilton Co</td><td>#7803-05</td><td>33 Ga.、0.5 inch、PT4（カスタムメイド）</td></tr><tr><td>耳タグ</td><td>National Band and Ear Tag Co.</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>眼軟膏</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

のために人間のルシフェラーゼ-タグ付き悪性末梢神経鞘腫瘍細胞の同所xenografting in vivoで</em候補治療薬の>テスト

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

in vitroで画面が候補治療薬の最初の同定に不可欠ですが、腫瘍の増殖を阻害する薬剤の能力の厳格な評価は、適切な動物モデルで実行する必要があります。この目的のために最適な動物モデルのタイプは、激しい議論の話題です。いくつかの証拠は、トランスジェニックマウスに発生する腫瘍で薬の効果を調べる前臨床試験は臨床アウトカム1のより多くの予測であり、その候補治療薬は、しばしば、これらのモデルでテストされていることを示します。残念なことに、トランスジェニックモデルは多くの腫瘍タイプは使用できません。さらに、トランスジェニックモデルは、しばしばそのような方法だけでな​​く、マウス腫瘍モデルの人間の対応、腫瘍表現型と腫瘍が発症する時期を予測することができないの不完全浸透のような懸念のような他の制限事項があります。 適切なトランスジェニック腫瘍モデルが利用できない場合、その結果、多くの研究者は、前臨床試験のために（ヒト腫瘍細胞が免疫不全マウスに移植した）異種移植モデルを使用してください。トランスジェニックモデルが使用できる場合でも、彼らはしばしば、後者は、治療範囲の迅速な決定を容易に異種移植モデルと提携しています。さらに、このパートナーシップは、トランスジェニック腫瘍と本物のヒト腫瘍細胞における薬剤の効果の比較が可能になります。歴史的に、多くの場合（異所性異種移植片）皮下腫瘍細胞を注入することによって行われているxenografting。この手法は、比較的安価で、迅速かつ再現性であり、治療期間2の間に腫瘍の成長の連続的な定量が可能になります。しかし、皮下のスペースは、ほとんどの腫瘍のための正常な微小環境ではありませんので、異所性xenograftingで得られた結果は、宿主組織と腫瘍遺伝子の器官特異的発現の欠如などを要因として誤解することができます。これは次のように強く異所性移植の研究はヒト腫瘍細胞が起源の彼らの組織（同所xenografting）2に移植されている研究によって交換または補完することが推奨されています。残念なことに、この勧告の実装は、しばしば同所xenografting方法論はまだ多くの腫瘍タイプ用に開発されていないという事実によって妨害される。 悪性末梢神経鞘腫瘍（MPNSTsは）神経線維腫症1型3と最も一般的に坐骨神経4で発生した散発的または関連して発生する非常に積極的に肉腫があります。ここでは、ホタルルシフェラーゼタグ付きヒトのMPNSTの細胞がorthopically免疫不全マウスの坐骨神経に異種移植されている技術的に簡単な方法を説明します。個々の動物との研究グループに、後続の非バイアスされたランダム化における移植手順の成功を評価するための我々のアプローチについても議論されています。

確実に免疫不全マウスの坐骨神経にルシフェラーゼタグ付きヒト悪性末梢神経鞘腫瘍細胞を移植する方法が説明されています。研究グループに動物のランダムな分離のための腫瘍移植と基準の適切な設置を実証するために生物発光イメージングの使用についても説明します。

のために人間のルシフェラーゼ-タグ付き悪性末梢神経鞘腫瘍細胞の同所Xenografting in vivoで</em候補治療薬の>テスト

in vitroスクリーニングは、候補治療薬の初期同定において不可欠であるものの、薬剤の...能力を厳格に評価するには、

本手順の全体的な目的は、候補治療薬が免疫不全マウスの坐骨神経に移植されたM-P-N-S-T細胞の増殖を効果的に抑制するかどうかを判定することです。まず、ティッシュフラスコから腫瘍細胞を回収し、洗浄して適切な濃度で再懸濁させます。次に、外科的に坐骨神経を露出し、そこに5,000個の細胞を注入します。次のステップでは、生体内光学的イメージングを用いて移植の成否を判定し、CINを研究グループにランダムに割り当て、候補治療薬による治療を開始します。本手順の最終ステップは、移植から30日後に腫瘍を回収し、候補治療薬が腫瘍に及ぼした影響を分析することです。最終的に、腫瘍重量の比較、KI 67の免疫染色による相対的な増殖率の確認、およびTUNELアッセイによる対照群マウスと治療群マウスにおける腫瘍細胞死レベルの評価などの手法を通じて、治療薬が腫瘍の増殖を抑制したかどうかを示す結果を得ることができます。皮下移植などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、正常な微小環境をモデル化できる点にあり、これによりM-P-N-S-Tの増殖をより適切にモデル化できることです。本手法の実演は、私の研究室の技術者であるAmy Turkが行います。移植の前日に、非ヌード免疫不全マウスを準備します。麻酔をかけたマウスを加熱パッドの上に置き、体温を維持しながら、バリカンを用いて除毛します。化学的除毛剤を用いて、残っている毛を除去します。すべての毛が除去されたら、マウスを寝床のない単独ケージ内のヒートパッド上に置き、完全に回復するまで保持します。移植当日、細胞を3000 RPMで5分間遠心分離します。注意深く上清を除去し、細胞ペレットをピューマイシンを含まないDMEM 10に再懸濁し、最終濃度を3 µLあたり5×10³個にします。細胞は使用するまで氷上で保持してください。まず、麻酔をかけた動物をヒーティングパッドの上に置き、両眼に眼軟膏を塗布します。各マウスの右耳に、個体識別番号が記載されたイヤータグを装着します。研究期間中を通じて識別を容易にするため、動物を腹臥位にし、後肢を広げます。マウスを滅菌ドレープで覆い、移植を行う部位に術野を確保します。綿棒を使用して、側腹部の中心から外科的処置部位の端に向かって渦巻き状にBetadineを塗布します。続いて、同様の手順で70%ethanolを塗布します。Betadineとethanolの連続塗布をさらに2回繰り返します。細胞を氷上から取り出し、緩やかにボルテックス処理するか、チューブを軽く叩いて沈殿した細胞を再懸濁します。ピペットを用いて細胞懸濁液を3.2 µL分取し、パラフォーム上に滴下します。次に、細胞懸濁液を3 µL分取し、10 µLのハミルトンシリンジに吸引します。33ゲージの針を装着します。細胞および細胞を含むシリンジは、使用直前まで氷上で保持してください。22番のメス刃を装着した4番のメスハンドルを使用し、大腿骨の直下で平行に、側腹部の皮膚を切開します。外科用クランプを用いて皮膚切開部を広げ、下層の筋肉を露出させます。顕微鏡下で、脚の長さに沿って走る筋膜を鋭い先端の鋏で鈍的に剥離し、太い糸ほどの太さの白い線状構造の下にある坐骨神経を露出させます。鋭い先端の曲がったピンセットを用いて、神経の下を慎重に剥離し、下層の筋肉から神経を遊離させます。神経を挙上させ、かつ慎重に分離した状態を維持するため、鉗子をそのままにしておきます。ハミルトンシリンジの針を神経内に挿入します。この際、神経の下側まで突き抜けないよう、注入角度をできるだけ神経と平行に保つようにしてください。針が神経内に正しく配置されたら、鉗子による緊張を緩め、45〜60秒かけてゆっくりと細胞を注入します。腫瘍細胞の逆流による喪失を防ぐため、ゆっくりと注入することが不可欠です。すべての細胞への注入が正常に完了したら、注入物質の喪失を最小限に抑えるため、ゆっくりと針を抜きます。注入終了後、サージカルクランプとピンセットを取り除きます。その後、神経を慎重に元の位置に戻します。切開部をVet Bond外科用接着剤で閉じて、接着剤が乾くまで約20秒間鉗子で保持します。完全に回復するまで、動物を敷材のない加温ケージに入れます。マウスの健康状態を観察します。腫瘍負荷が動物の正常体重の10%を超えるか、または体重減少が20%を超えた場合、マウスを毎日研究から除外します。処置の成功を確認するため、移植後1日目と3日目にバイオルミネッセンスイメージングを行います。マウスに2.5 milligramsのLuciferを注射し、麻酔下にある動物を加熱イメージングプラットフォーム上に配置します。基質の投与から10分後に、腫瘍で発現したホタルルシフェラーゼからの光放出を検出します。Xeno Gen社のソフトウェアを使用して、画像取得時間を1秒から10分の範囲に設定してください。次に、マウスの白黒写真および擬似カラー写真（Pseudocolor）を撮影します。発光強度の指標を示すため、これらの画像にバイオルミネッセンスのスケールを重ねて表示しています。前臨床試験コホートへの組み入れ条件として、マウスは移植後1日目と3日目の両方で検出可能なバイオルミネッセンス信号を有し、かつ信号強度が1日目から3日目の間に増加している必要があります。ここでは、ヌードマウスにおいて適切に確立された正位異種移植後の1日から18日目までに観察される、典型的なバイオルミネッセンスの漸増的な増加を示しています。異なるマウスの関心領域内で検出されたシグナルの類似性に注目してください。移植後10日目と18日目に再イメージングを行うと、個々のマウスの移植部位において生物発光シグナルが漸増していることがわかります。移植後1日から24日までに観察された生物発光シグナルの定量化により、これらのシグナルは漸増しているものの、研究期間の後期において腫瘍の増殖が著しく加速することが示されました。M pns ts の増殖は非常に速いため、移植された腫瘍細胞はしばしば神経の通常の障壁を突破し、隣接する組織に浸潤します。この移植部位の顕微鏡写真では、腫瘍の増殖と隣接する骨格筋への局所的な浸潤が示されています。この手法に習熟すれば、適切に実施することで1匹のマウスに対して10分で完了させることができます。

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超音波の利用ガイド生物学的関連性の転移性腫瘍の異種移植片の確立のため組織指示細胞注入

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マウス脳におけるヒト神経前駆細胞の脳内移植と 生体 内生物発光追跡

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神経線維腫症 1 型 (NF1) は、成長に特定の神経微小環境を必要とする良性末梢神経鞘腫瘍 (神経線維腫)...

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