のために人間のルシフェラーゼ-タグ付き悪性末梢神経鞘腫瘍細胞の同所Xenografting in vivoでテスト

確実に免疫不全マウスの坐骨神経にルシフェラーゼタグ付きヒト悪性末梢神経鞘腫瘍細胞を移植する方法が説明されています。研究グループに動物のランダムな分離のための腫瘍移植と基準の適切な設置を実証するために生物発光イメージングの使用についても説明します。

この手順の全体的な目標は、免疫不全マウスの坐骨神経に移植されたM-P-N-S-T細胞の増殖を、治療薬候補が効果的に阻害するかどうかを判断することです。これは、最初に組織フラスコから腫瘍細胞を取り出し、それらを洗浄し、適切な濃度で懸濁させることによって達成されます。手順の2番目のステップは、坐骨神経を外科的に露出させ、次に神経に5, 000個の細胞を注入することです。

次のステップは、in vivo の光ベースのイメージングを使用して移植の成功を判断し、CIN を研究グループに無作為化し、候補治療薬による治療を開始することです。手順の最終ステップは、移植後30日で腫瘍を採取し、候補治療薬が腫瘍に及ぼした影響を分析することです。最終的には、腫瘍重量の比較、KI 67の免疫染色による相対的な増殖速度の観察、トンネルアッセイによる対照マウスと治療マウスの腫瘍細胞死レベルの評価などの方法を通じて、治療薬が腫瘍の成長を減少させたかどうかを示す結果を得ることができます。

皮下移植のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、通常の微小環境をモデル化することであり、これはM-P-N-S-Tの成長をよりよくモデル化し、この技術が私の研究室の技術者であるエイミー・タークであることを示しています。非ヌード免疫不全マウスは、移植の前日に調製されます。バリカンを使用して、体温を維持するために加熱パッドで作業している麻酔をかけたマウスの毛を剃ります。

化学脱毛剤を使用して、残っている髪の毛を取り除きます。すべての毛を取り除いたら、完全に回復するまで、寝具なしで隔離ケージの加熱パッドにマウスを置きます。グラフトの日に、細胞を3000RPMで5分間遠心分離します。

スナットを慎重に取り外し、細胞ペレットをpurマイシンを含まないDMEM 10に再懸濁し、最終濃度が3マイクロリットルあたり3番目の細胞の10の5倍になります。使用する準備ができるまで、細胞を氷の上に置いておきます。まず、麻酔をかけた動物を加熱パッドの上に置き、各眼に眼科用軟膏を塗ります。

一意の識別番号が記載された耳タグを各マウスの右耳にクリップで留めます。研究全体で識別を容易にするために、動物を腹の上に置き、後ろ足を広げます。マウスを滅菌ドレープで覆い、移植が行われる手術窓を露出させます。

ベタジンを手術部位に塗布するには、綿の先端のアプリケーターを側面の中央から開始し、手術窓の端に向かって徐々にらせん状に伸ばします。次に、70%エタノールを同じ方法で手術部位に塗布します。ベタジンとそれに続くエタノールの連続的な適用は、さらに2回繰り返されます。.

細胞を氷から取り出し、静かにボルテックスするか、チューブをフリックして、沈殿した細胞を再懸濁します。ピペットを使用して3.2マイクロリットルの細胞懸濁液を取り出し、パラフォームに排出します。細胞懸濁液の3マイクロリットルを10マイクロリットルのハミルトンシリンジに引き込みます。

33ゲージの針を装備。セルとシリンジを含むセルを氷上に置いて、使用する準備ができるまで保持します。22番のメス刃を装備した4番のメスハンドルを使用して、大腿骨のすぐ下と平行な脇腹の皮膚を切開します。

外科用クランプで皮膚切開部を開き、下にある筋肉を露出させます。先端が鋭利なハサミを使用して、脚の長さに沿って走る筋膜を鈍く解剖し、顕微鏡下で作業する太い糸の太さほどの白い線形構造の下にある坐骨神経を露出させます。先端が鋭く湾曲した鉗子を使用して、神経の下を慎重に解剖し、下にある筋肉から神経を緩めます。

神経を上昇させ、分離させるために鉗子を所定の位置に置いておきます ハミルトン注射器の針を神経に挿入し、注射の角度を神経とできるだけ平行に保ちながら、下側に穴を開けないようにします。針が神経に適切に配置されたら、鉗子によって生成される張力を緩和し、45〜60秒かけてゆっくりと細胞を注入します。腫瘍細胞の逆流による腫瘍細胞の喪失を防ぐためには、ゆっくりとした注射が不可欠です。

すべての細胞が正常に注入されたら、注入された材料の損失を最小限に抑えるために、針をゆっくりと引き抜きます。注入が完了したら、外科用クランプと鉗子を取り外します。次に、神経を慎重に元の位置に戻します。

切開部を獣医用ボンド外科用接着剤で閉じ、鉗子で約20秒間保持して接着剤を乾燥させます。動物が完全に回復するまで、寝具のない加熱ケージに入れます。マウスの健康状態を監視します。

毎日のマウスは研究から削除されます。腫瘍の負荷が動物の正常体重の10%を超えるか、体重減少が20%を超える場合手順の成功を判断するには、移植の1日後と3日後に生物発光イメージングを実行します。マウスに2.5ミリグラムのルシファーを注入し、麻酔をかけた動物を加熱されたイメージングプラットフォームに置きます。

腫瘍発現ホタルルシフェラーゼからの発光は、基質の注入後10分で検出されます。Xeno Genのソフトウェアを使用して、画像取得時間を1秒から10分の範囲に設定します。次に、マウスの白黒写真を撮ります Pseudocolor。

生物発光のスケーリングは、発光強度の尺度を提供するために、これらの画像と重ね合わせられます。前臨床試験コホートに含める資格を得るには、マウスは移植後1日目から3日後の両方で検出可能な生物発光シグナルを持っている必要があり、シグナルの強度は1日目から3日目の間に増加する必要があります。ここに示されているのは、ヌードマウスの適切に確立された同所性異種移植片における移植片の1〜18日後に観察された生物発光の典型的な漸進的な増加です。

異なるマウスの関心領域内で検出された信号の類似性に注意してください。移植片の10日後と18日後に再イメージングすると、個々のマウスの移植部位で生物発光シグナルが徐々に増加することが示されています。移植の1〜24日後に観察された生物発光シグナルの定量化は、これらのシグナルが徐々に増加するものの、腫瘍の成長は研究期間の後半に著しく加速することを示しています。

M pns tsの積極的な増殖を考えると、移植された腫瘍細胞はしばしば神経の正常な障壁を破り、隣接する組織に侵入します。この移植部位の写真顕微鏡写真は、腫瘍の成長と隣接する骨格筋への焦点浸潤を示しています 一度習得すると、この技術は適切に行われれば、1匹のマウスで10分で実行できます。