Name: 効率的なポリエチレングリコール（PEG）モスの媒介形質転換ヒメツリガネゴケ /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: 学ぶPEGを用いたヒメツリガネゴケプロトプラストの効率的な形質転換法。マンニトール洗浄と選択培地での培養により、蛍光タンパク質発現を確認できます。遺伝子機能解析やRNAi実験に応用可能です。

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1。プロトプラストの作成<ol><li>ペトリ皿にマンニトール8％9 mLを加え。 </li><li>スパチュラを用いて、5の2-3 PPNH4プレートから7日間の古い苔を置く - ペトリ皿を含むマンニトールで。 </li><li>シャーレに2％Driselase 3mLの（シグマD9515 - 25G）を追加します。 </li><li> 1時間静かに振とうしながら室温でペトリ皿をインキュベートする。 </li><li> 100μmのメッシュ（BDファルコン352350）を通じてプロトプラスト懸濁液をフィルターします。 </li><li> 5分の250 gでフィルタリングされたサスペンションを回転させる。上清を取り除く。 </li><li> 8％マンニトール500μLのと非常に穏やかにプロトプラストを再サスペンド。 </li><li>培養チューブの9.5 mLの8％マンニトールを追加。プロトプラストが完全に中断されていることを確認します。 </li><li>ろ過と再懸濁のステップ（1.6、1.7および1.8）をさらに2回繰り返します。 </li><li>プロトプラスト溶液10μLを取り、血球計算盤でプロトプラストをカウント。 </li><li> mL当たりプロトプラストの数を取得するために、000で16㎡地域におけるプロトプラストの数を掛ける（図1を参照）。 </li></ol> 2。変換<ol><li> 5分の250 gでプロトプラスト懸濁液をスピン。上清を取り除く。 </li><li> 160万プロトプラスト/ mLの濃度でMMGの溶液中でプロトプラストを再サスペンド。 </li><li> 20分間室温でプロトプラスト懸濁液をインキュベートする。 </li><li> 60μgのDNAを含有する培養管にプロトプラスト懸濁液600μLを加える。チューブ優しくスワール。 </li><li>プロトプラスト/ DNA混合物中にPEG / Caのソリューションを700μLを加える。全体の混合物が均質になるまでゆっくりと渦巻きがチューブ。 </li><li>室温で30分間混合物をインキュベートする。 </li><li>少なくとも5分間プレートの表面に水和物へのセロファンを可能にする、この待機期間中は、PRM - Bセロファン付きプレート（80 mm径の円、AAパッケージリミテッド、英国）をカバー。 </li><li>スパチュラで、セロファンとプレートの間に閉じ込められた気泡を取り除く。 </li><li> W5溶液3 mLの混合物を希釈する。 </li><li> 5分の250 gで混合物を回転させる。上清を取り除く。 </li><li> PRM - Tの溶融を2mLで再懸プロトプラスト（この溶液は42℃で液体に保つことができるプロトプラストに追加する前に）。セロハンでカバーPRM - Bプレート当たりの再サスペンドプロトプラストのプレート1 mLの。細孔（3M、ヘルスケア）でプレートを包みます。成長チャンバー内で25℃でプレートを保管してください。 </li><li>また、プロトプラストを液体メッキの培地とセロハンで覆われたPRM - Bプレート上にプレーティング0.5 mLを1 mLに再懸濁させることができる。これは速く再生することができますが、再生工場の数は低くなります。 </li><li>成長チャンバーは16時間に設定されています。光と8時間。暗サイクル。 </li><li> 4日間の変換後の新鮮な選択プレートに上にセロハンを移動します。 </li></ol> 3。代表的な結果： 変換の例を図2に示されています。この例で使用されているDNAは、ハイグロマイシン耐性カセットを有するプラスミドスーパーコイル7.8キロバイトでした。播種プロトプラストの量は、写真撮影のための50％に減少した。写真は、植物を選択プレートに移動された二週間後に採取された。形質転換効率は最大60μgまでのDNA濃度の影響を受けません。 DNAの高濃度では形質転換の効率に有害である。データは、このメソッドは、DNA量の広い範囲にわたって一貫性のある結果をもたらすことを示した。また、このメソッドは効果的に表1に示すように安定した形質転換体を生成することも可能です。こちらは、以前に14に報告されたものよりはるかに高い直鎖状DNAのマイクログラムあたり4安定した形質転換体を、約得ることができます。 我々はまた、マーカーとしての蛍光タンパク質の遺伝子を運ぶスーパーコイルプラスミドを形質転換して形質転換効率で熱ショックの効果を試験した。熱ショックは3分間45℃の水浴で混合物をインキュベートすることにより、10分室温でのインキュベーション（ステップ2.6以内）後に実施した。混合物を17分間熱ショック直後に室温の水浴中でインキュベートした。結果は、22時間変換後に記録した。で得られた形質転換体と熱ショックなしの比率は（〜25％）非常に類似していたが、我々は、プロトプラスト（データは示さず）の生存に熱ショックの悪影響を観察した。 <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。血球計算板のプロトプラストの表示。プロトプラストの計数のために必要なセクションが赤い四角で示されます。プロトプラストをカウントするために必要な16の正方形の点に注意してください（1.11参照）、画像は24プロトプラスト（240,000細胞/ mL）の数を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 18日間の古い一時的な形質転換体の写真。プロトプラストのトランスいたスーパーコイル状プラスミドの指示された量で形成。 ：15μg、B：30μg、C：60μg、D：120μg。 <table border="1"><tbody><tr><td> DNAの量（μg） </td><td> 効率（tranformants /μgのDNA） </td></tr><tr><td> 15は、プラスミドスーパーコイル</td><td> 120 ± 24 </td></tr><tr><td> 30は、プラスミドスーパーコイル</td><td> 145 ± 54 </td></tr><tr><td> 60は、プラスミドスーパーコイル</td><td> 121 ± 60 </td></tr><tr><td> 120は、プラスミドスーパーコイル</td><td> 71 ± 38 </td></tr><tr><td> 60は、線状化プラスミド</td><td> 4 ± 1 </td></tr></tbody></table>種々のDNA量で表1。形質転換効率。

<ol><li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts%3A+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li>
<li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryophytes+as+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bryologist%22%5BJournal%5D)">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li>
<li>Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li>
<li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li>
<li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li>
<li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%3A+homologous+recombination%2C+concatenation+and+multiple+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li>
<li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li>
<li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li>
<li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li>
<li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li>
<li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss%2C+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介する方法は、 ヒメツリガネゴケのプロトプラストへの単純で一貫性DNA形質転換が可能になります。このメソッドはもともとシロイヌナズナ 1の開発が、ここではそれがヒメツリガネゴケ 、簡単で異なる植物のプロトプラストとよく実行することが実証された。したがって、この方法は若干変更して他の植物種に適用することができます。最適化のための実行可能な変更は、MMGとPEG /カルシウム溶液中でのMMGのプロトプラストの濃度、インキュベーション時間が含まれています。形質転換体の数がこの時点（表1）までのDNA濃度に比例して増加するため、我々は、ルーチンの実験で60μgのDNAを使用することを選択。我々は、植物の大規模な人口のさらなるスクリーニングと分析ができるように、単一の60μgのDNA形質転換、上の約7000の過渡形質転換体または200安定な形質転換体を得ることができる。 変換されたプロトプラストを液体メッキ媒体またはPRM - Tで拡散することができるのどちらか。再生効率が液体メッキの培地が使用されているときに低いですがプロトプラストをスーパーコイル状のプラスミドで形質転換されたとき、我々はこの方法を選択してください。表1に示した、スーパーコイルプラスミドDNAで行う変換は、より多くの形質転換体を生成し、したがって、我々はまだ液体メッキの培地で植物の多数を得ることができます。さらに、液体メッキ培地でプロトプラストを分散するとの実験9,15をノックダウンするようなRNAiのような一時的な表現型を、関連する実験のために重要である高速な再生を可能にする。さらに、トップアガーがない場合は、免疫染色とRT - PCR 9,15のための簡単な植物を分離することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 成分 </td></tr><tr><td> PPNH 4 </td><td> 1.84 mMのKH 2 PO 4 3.4 mMのカルシウム（NO 3）2 1 mMのMgSO 4を 2.72 mMの二アンモニウム、酒石酸 54μMのFeSO 4 · 7H 2 O 9.93μMH 3 BO 3 1.97μMMnCl 2を 0.4 H 2 O 0.23μMのCoCl 2 · 6H 2 O 0.19μMZnSO 4。 7H 2 O 0.22μmののCuSO 4。 5H 2 O 0.10μMのNa 2酸化モリブデン4 · 2H 2 O 0.168μMのKI 固体培地は0.7％の寒天を追加。 </td></tr><tr><td> PRM - B </td><td> 6％マンニトール、0.8％の寒天とPPNH 4。プレートを注ぐ前に、10mLの1MのCaCl 2から1 Lを追加。 </td></tr><tr><td> PRM - T </td><td> 6％のマンニトール及び0.6％寒天とPPNH 4。使用前に0.5mLの1MのCaCl 2に50mLを追加。 </td></tr><tr><td>液体めっきミディアム</td><td>寒天なしで8.5％マンニトールとPPNH 4。使用前に0.5mLの1MのCaCl 2に50mLを追加。 </td></tr><tr><td> 2％Driselase </td><td> 8％マンニトール200mlにDriselase 4gの（シグマD9515 - 25G）を追加します。 30分間静かにかき混ぜる。室温で30分間インキュベートする。 4℃、5分間穏やかに撹拌する。室温で。 10分間2500グラムをスピン、ペレットを捨てる。 10mLのアリコートとして凍結さ0.22μmの、そして店舗でフィルタ。使用前に室温の水浴で融解。 </td></tr><tr><td> MMG </td><td> 0.4 Mマンニトール 15mMのMgCl 2の 4mMのMES（pHは5.7） </td></tr><tr><td> PEG / Ca比</td><td> 4グラムPEG4000 3 mLのH 2 O 2.5mLの0.8 Mマンニトール 1 mLの1M CaCl 2を </td></tr><tr><td> W5 </td><td> 154 mM NaClを 125ミリメートルのCaCl 2 5mMのKClを 2 mMのMES（pHは5.7） </td></tr></tbody></table>

効率的なポリエチレングリコール（peg）モスの媒介形質転換ヒメツリガネゴケ</em

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

<p class="jove_content"&gt;変換するのは簡単かつ効率的な方法は、<em&gt;ヒメツリガネゴケpantens</em&gt;プロトプラストが記載されている。このメソッドは、のためのプロトコルから適応される<em&gt; Physocmitrella</em&gt; protonemalプロトプラストと<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;葉肉プロトプラスト形質転換<sup&gt; 1</sup&gt;。相同組換え効率的分裂を受けるためにその能力に起因する<em&gt;、ヒメツリガネゴケ</em&gt;は、近年、重要なモデル系として注目されています<sup&gt; 2</sup&gt;。この能力は、遺伝子の高い周波数がターゲット可能に<sup&gt; 3月9日</supなどの他のモデル植物で見ていない&gt;、<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;。このシステムを最大限に活用するには、我々は、コケの細胞にDNAを提供する効果的かつ簡単な方法が必要。このコケを変換する最も一般的な方法は、粒子衝突です。<sup&gt; 10</sup&gt;とPEG -媒介DNA取り込み<sup&gt; 11</sup&gt;。粒子衝突は、高い形質転換効率を生成することができますが、<sup&gt; 12</sup&gt;、遺伝子銃は多くの研究室へ容易に入手できないとプロトコルが標準化することは困難です。一方、PEG媒介形質転換は、特殊な機器を必要としない、そして無菌フードを持つ任意の実験室で行うことができます。ここでは、コケのプロトプラストの形質転換のための簡単​​かつ非常に効率的な方法を示しています。このメソッドは、以前に報告された最も効率的なプロトコルから改善されているDNAのマイクログラムあたり120以上の一過性形質転換体を、生成することができます<sup&gt; 13</sup&gt;。そのシンプルさ、効率性、および再現性のため、この方法は、ルーチンの変換のためだけでなく、形質転換体の大きい数を必要とするプロジェクトに適用することができます。</p

変換するのは簡単かつ効率的な方法<em&gt;ヒメツリガネゴケpantens</em&gt;プロトプラストが記載されている。このメソッドは、のためのプロトコルから適応される<em&gt; Physocmitrella</em&gt; protonemalプロトプラストと<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;葉肉プロトプラスト形質転換<sup&gt; 1</sup&gt;。

効率的なポリエチレングリコール（PEG）モスの媒介形質転換ヒメツリガネゴケ</em

Physcomitrella patensのプロトプラストを形質転換するための、簡便かつ効率的な方法について記述する。本手法は、Physcomitrella...のプロトコルを改変したものである。

本手順の全体的な目的は、SCO Metre プロトプラストを形質転換することです。まず、植物を Drizly で消化します。次に、プロトプラストをマンニトールで洗浄して Drizly を除去し、その後、DNA および PEG と共にインキュベートします。最後に、形質転換したプロトプラストをプレート上に播種し、インキュベートします。これにより、最終的な結果を得ることができます。蛍光顕微鏡を通じて、蛍光標識タンパク質を発現している形質転換プロトプラストが観察されます。本手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクターであるY luが行います。この手法の主な利点は、効果的であり、目的のタンパク質を発現するプロトプラストを安定して生成できることです。コケのプロトプラストを単離するには、まずスパチュラを用いて8%マンニトール 9 mLをペトリ皿に入れます。2～3枚のPP NH4プレートから、5～7日経過したコケをマンニトールの中に入れます。これおよびその他の試薬の調製方法については、付随する書面プロトコルを参照してください。次に、2%ドリズリー 3 mLを加え、室温で緩やかに振盪しながら1時間インキュベートします。混合物を100 micronのメッシュでろ過し、緑色の均一な懸濁液を得ます。次に、ろ液を250 Gで5分間遠心分離します。上澄み液を非常に慎重に除去してください。プロトプラストを500 µLの8% mannitolに再懸濁します。次に、さらに9.5 mLの8% mannitolを加えます。プロトプラストが完全に懸濁していることを確認してください。溶液を再度 250 G で5分間遠心分離し、洗浄工程をさらに2回繰り返します。上清を廃棄し、プロトプラストを再懸濁します。まず 500 microliters で行います。次に、ヘモサイトメーターを用いて8%マンニトールを9.5 milliliters加えます。分離したプロトプラストにDNAを導入するため、懸濁液10 microliters中のプロトプラスト数を計測します。まず、プロトプラスト混合液を250 Gで5分間遠心分離します。上清を除去し、プロトプラストをMMG溶液中で1.6 million/mLの濃度で再懸濁します。この懸濁液を室温で20分間インキュベートします。次に、60 µgのDNAを含む培養チューブに、プロトプラスト溶液600 µLを添加します。振盪して混ぜ合わせます。700 µLのPEGカルシウム溶液を静かに加え、振とうします。この待機時間の間、サンプルを室温で30分間十分にインキュベートします。PRMBプレートをセロファンで覆います。次に、懸濁液を3 mLのW5溶液で希釈し、250 Gで5分間遠心分離します。PEGを除去するため、プロトプラストを2 mLのPRMTで再懸濁し、セロファンで覆ったPRMBプレートに1 mLずつ播種します。プレートを25 °Cの育成室で保持します。最後に、形質転換の4日後に、セロファンを新しい選抜プレートに移します。この図は、ハイグロマイシン耐性カセットを持つ15 µgの超らせん状プラスミドDNAで形質転換し、プロトプラストから再分化した18日目の植物の例を示しています。ここでは、同等の30 µgの超らせん状プラスミドDNAをプロトプラストに形質転換させました。このサンプルには60 microgramsのplaid DNAが形質転換されました。そして最終的に、ハイグロマイシン耐性カセットを持つ同じ超共役プラスミドDNAを120 micrograms形質転換したプロトプラストから、これらの植物が再生されました。形質転換効率は、最大60 microgramsまでのDNA濃度では影響を受けません。しかしながら、DNA濃度が高すぎるとこの手順に悪影響を及ぼします。データによれば、この方法は広範囲のDNA量において、1回あたり一貫した結果が得られることが示されています。適切に実施すれば、この手法は3時間で完了できます。この手順に続き、遺伝子機能に関するさらなる疑問を解消するために、一過性RNAiや遺伝子ノックアウトなどの追加手法を実施することができます。

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