効率的なポリエチレングリコール（PEG）モスの媒介形質転換ヒメツリガネゴケ

この手順の全体的な目標は、SCOメータープロトプラストを変換することです。これは、最初にDrizlyで植物を消化することによって達成されます。次に、プロトプラストをマンニトールで洗浄して滴り落ちるものを取り除き、DNAとペグでインキュベートします。

最後に、形質転換されたプロトプラストをプレート上に広げてインキュベートします。最終的には、結果を得ることができます。それは、蛍光顕微鏡法を通じて蛍光標識タンパク質を発現する形質転換プロトプラストを示しています この手順を実証するのは、私の研究室のポスドクであるY luです。

この技術の主な利点は、それが効果的であり、一貫して目的のタンパク質を発現するプロトプラストを生成することです コケを単離するには、プロトプラストは、へらを使用してペトリ皿に8%マンニトールの9ミリリットルを追加することから始めます。マンニトールに2〜3枚のPP、NH、4枚のプレートから5〜7日齢のコケを置きます。この試薬レシピおよび追加の試薬レシピについては、添付の書面によるプロトコルを参照してください。次に、2%drizlyの3ミリリットルを加え、室温で1時間穏やかに振とうしながらインキュベートします。

混合物を100ミクロンメッシュでろ過して、緑色の均質な懸濁液を得ます。次に、濾液を250 Gで5分間回転させます。上澄みを非常に穏やかに捨てます。

プロトプラストを500マイクロリットルの8%マンニトールに再懸濁します。次に、9.5ミリリットルの8%マンニトールを追加します。プロトプラストが完全に懸濁

溶液を再び250 Gで5分間回転させることにより、洗浄手順をさらに2回実行します。上清を捨て、プロトプラストを懸濁させて蘇生します。500マイクロリットルで最初。

次に、ヘモサイトメーターを使用して9.5ミリリットルの8%マンニトール。懸濁液の10マイクロリットル中のプロトプラストの数を数え、DNAを単離されたプロトプラストに変換します。まず、プロトプラスト混合物を250Gで5分間遠心します。

上清を除去し、MMG溶液中にプロトプラストを1ミリリットルあたり160万で再懸濁します。懸濁液を室温で20分間インキュベートします。次に、600マイクログラムのDNAを含む培養チューブに600マイクロリットルのプロトプラスト溶液を加えます。振る。

700マイクロリットルのPEGカルシウム溶液をそっと加えて振る。この待機期間中に、サンプルを室温で30分間十分にインキュベートします。PRMBプレートをセロハンで覆います。

次いで、懸濁液を3ミリリットルのW 5溶液で250Gで5分間希釈する。PEG再懸濁液を除去するために、プロトプラストは、セロハンで覆われたPRMBプレート1枚につき1ミリリットルのPRMTプレートに2ミリリットル入る。プレートを成長チャンバー内で摂氏25度に保ちます。

最後に、形質転換の4日後、セロハンを新しいセレクションプレートに移します。この図は、プロトプラストから再生された18日齢の植物を、15マイクログラムのスーパーコイル状プラズマDNA(DNA)で形質転換し、ハイグロマイシン耐性カセットを運んだ例を示しています。ここでは、同じスーパーコイルプラスミドであるDNAの30マイクログラムをプロトプラストに変換しました。

このサンプルでは、60マイクログラムの格子縞DNAを形質転換しました。そして最後に、これらの植物は、ハイグロマイシン耐性カセットを運ぶ同じスーパーコイル状血漿DNAの120マイクログラムで形質転換されたプロトプラストから再生されました。形質転換効率は、最大60マイクログラムのDNA濃度の影響を受けません。

ただし、DNAの濃度が高いと、この手順に悪影響を及ぼします。データは、この方法が学期後に広範囲のDNA量にわたって一貫した結果をもたらすことを示しています。この手法は、適切に実行すれば3時間で実行できます。

この手順に続いて、遺伝子機能に関する追加の質問に答えるために、一過性RNAiや遺伝子ノックアウトなどの追加の方法を実行できます。