Name: 核酸の光度計微量定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学ぶNanoDropを用いた核酸の光度計微量定量法。表面張力を利用したマイクロボリューム測定システムで、わずか1マイクロリットルのサンプルで正確な濃度と純度評価が可能です。

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リチャードW.ベリンジャーとDavid L.アッシュ、技術支援及び撮影のためのアプリケーションの科学者、サーモサイエンティフィックの光度計の製品、。

1。光度計2000C分光光度計を用いて微量核酸の定量<ol><li>開始するには、下側の光学面にきれいな純水の2〜3μLをピペッティングすることにより微量分光光度計のサンプル保持システムの上限と下限の光学面をきれいに。 </li><li>レバーアームを閉じて、上側の台座は、脱イオン水と接触することを保証する。レバーアームを持ち上げ、きれいな、乾いた、糸くずの出ないラボペーパーで光学面の両方を拭き取ってください。 </li><li> NanoDropソフトウェアを開いて、核酸のアプリケーションを選択します。下側の光学面に緩衝液1μLを分注してブランク測定を行うために、少量の、校正済みのピペットを使用してください。レバーアームを下げ、核酸のアプリケーションで"ブランク"を選択します。 </li><li>一度ブランク測定が完了すると、きれいな、乾いた、糸くずの出ないラボペーパーで光学面の両方をきれいに。 </li><li>測定されるサンプルの適切な定数を選択してください。 <table border="1"><tbody><tr><td> サンプルの種類 </td><td> オプションを選択します。 </td><td> 濃度を計算するために使用される定数 </td></tr><tr><td> dsDNAを</td><td> DNA - 50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNAを</td><td> DNA - 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA - 40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td>オリゴ</td><td>カスタム</td><td> 15から150 </td></tr></tbody></table> 表1。光度計微量分光光度計、TrayCellマイクロキュベットを使用する従来のキュベットベースの分光光度計、およびPicoGreenアッセイと組み合わせて微量光度計のfluorospectrometerを使用して直接A280吸光度測定用の代表的な核酸の濃度範囲。 </li><li>下の光学台に核酸サンプルの1μLを分注し、レバーアームを閉じます。測定が独立したボリュームなので、サンプルはのみ行われる測定の2つの光学面の間のギャップを埋める必要があります。 </li><li>アプリケーションソフトの"測定"を選択します。ソフトウェアは自動的に核酸の濃度および純度の比率を計算します。サンプルの測定に続いて、スペクトル出力を確認してください。 </li><li>ソフトウェアは自動的に核酸の濃度および純度の比率を計算します。サンプルの測定に続いて、サンプルの品質を評価するためのスペクトル画像を確認してください。 </li><li>典型的な核酸のサンプルは、非常に特徴的なプロファイルを持つことになります。 <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1代表的な核酸のサンプルは、非常に特徴的なプロファイルを持つことになります。 </li><li>特定の核酸の分離技術に関連する汚染物質の一般的な情報源は、フェノール/トリゾールと列の抽出などがあります。フェノール/トリゾール抽出の場合には、残留試薬の汚染は、220から240 nmの間の異常なスペクトルによってだけでなく、260〜280 nm領域の変化によって示されるかもしれません。逆に、列の抽出からの残留グアニジンは、230 nm付近のピークと230 nmから約240 nmの谷のシフトに貢献するかもしれない。 <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> （2）試料BとCのピークと谷の変化、汚染物質が核酸サンプルのスペクトルに影響を与えることができる方法を示す試料と比較して図 。 </li><li>正確にサンプルの品質を評価するために、280分の260または230分の260の比率は全体のスペクトルの質と組み合わせて分析する必要があります。純粋な核酸は、典型的にはそれぞれ、〜1.8の280分の260の比率とDNAとRNAのための〜2.0の280分の260比が得られる。この比率は、pHとブランクと試料の測定を行うために使用される緩衝液のイオン強度に依存しています。基本的な解決策は、0.2から0.3での比率をオーバー表す一方、酸性溶液は、0.2から0.3での比率を過小表します。大幅に異なる純度の比率は、280 nm付近で強く吸収されるタンパク質、フェノールやその他の汚染物質の存在を示すことがあります。 230分の260の純度比は1.8〜2.2の範囲で一般的に"純粋な"核酸の値を持つDNAの純度の第2の測定です。期待値よりも著しく低い純度の比率は、使用される分離技術はさらなる最適化を必要とする可能性を示している可能性があります。 </li><li>光度計分光光度計は、直接の吸光度を用いてタンパク質やタンパク質比色定量法によってを定量化するために使用することができます。適切な列の形成と再現性を確保するために、2μlの試料をタンパク質サンプルのためにお勧めします。微量タンパク質の濃度測定光度計分光光度計を使用して、次のJoveのビデオを参照してください<a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610を</a> </li></ol><ol><li>光度計3300を用いた高感度微量核酸の定量を実証するために、PicoGreen蛍光キットが使用されます。開始するには、室温にキットの標準と、すべての核酸サンプルを平衡化してください。蛍光試料は光に敏感であり、黄色またはアルミラップチューブに保管する必要があります。 </li><li>必要とされるPicoGreen実用的なソリューションのためだけでなく、測定するすべての標準およびサンプルに十分な1 × TEバッファーを準備します。製造業者のプロトコルごとにヌクレアーゼフリー水で提供される20倍のTEバッファーを希釈することにより1xTEバッファを準備します。反応容量は、200μLからわずか10 ulの範囲で指定できます。この例では、10μLの反応ボリュームが用意されます。 </li><li>ヌクレアーゼフリーバイアルまたはチューブの2倍の最終的な所望の濃度で希釈した二本鎖DNAの基準を準備する。ヌクレアーゼフリーアンバーまたは箔で覆われたチューブラベルの付いた個々に希釈した二本鎖DNAの基準の各5μLを転送する。 </li><li>適切に標識されたヌクレアーゼフリーのアンバーや箔で覆われた管への関心の各二本鎖DNAの試料のアリコート5μL。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってPicoGreenワーキング溶液を調製。興味の標準またはサンプル（この例では5μL）のいずれかを含む各チューブにPicoGreenワーキング溶液に等量を転送する。 </li><li>リファレンスソリューションとして機能する負の制御を、準備するために1 × TEバッファーとPicoGreenワーキング溶液の等容量を兼ね備えています。 </li><li>穏やかなピペッティングでよく、各反応管の内容物を混合し、室温で5分間反応をインキュベートする。蛍光シグナルは温度によって影響されるすべてのスタンダードとサンプルは測定前に同じ温度に平衡化する必要があります。 </li><li>楽器を準備し、測定を実行するには、最初のサンプル保持システムの下限と上限の表面を清掃してください。下側の光学面上に脱イオン水の2〜3μLピペットは、近くにしてレバーアームを開いて、きれいな、糸くずの出ない、ラボ用ワイプで上下測定を汚点。表面はlintは励起源の存在下で蛍光を示すことと、測定に干渉することができるように進む前に糸くずのないことを確認します。 </li><li>測定器ソフトウェアを開いて、"核酸"アプリケーションを選択し、"PicoGreen - dsDNAを"オプションを選択します。 </li><li>楽器をブランクに、下の台座に1 × TEの2μLを追加し、アームを閉じて、測定器ソフトウェアの分野では"ブランク"を選択します。ブランクが完了すると、サンプル保持システムの両面から空のソリューションをオフ汚点。 </li><li>穏やかなピペッティングによる参照の解決を混ぜる。下の台座の上に低保持のヒント、ピペット2μLを使用し、アームを閉じてください。 </li><li>測定タイプの"リファレンス"を選択し、目的の単位を選択します。測定サイクルを開始する"測定"をクリック。 </li><li>測定サイクルが完了すると、腕を開いて、徹底的にサンプル保持システムの表面をオフに汚点。 5つまでの測定は、各レプリケートのための新鮮なアリコートを使用して、参照の複製。 </li><li>標準曲線を構築するために追加の標準のプロセスを繰り返します。最大7つの基準に使用することができます。ソフトウェアは、5にそれぞれの標準のための複製を格納するために設計されています。標準の複製サンプルの濃度を自動的に決定されるから標準曲線を生成するために平均化されています。 </li><li>標準曲線が完了すると、、"サンプル"タブを選択し、それぞれのサンプルのID情報を入力して、それぞれの未知試料を測定する。 </li></ol>

<ol><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li>
<li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoolstra%2C+C+%22Implen+Applications+Note%22">Implen Applications Note</a>. , Munich, Germany. (2006).</li>
<li>Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJr%2C+Ingle+%22Spectrochemical+analysis%22">Spectrochemical analysis</a>. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).</li>
<li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li>
</ol>

フィリップデジャルダンとデブラコンクリンは、この資料に使用される楽器を作り出すサーモサイエンティフィック㈱エルプロダクツ株式会社によって雇用されている。

ここで紹介する定量プロトコルは、最も広く受け入れられている微量のシステムに基づいています。このようなシステムは、より大きなサンプルの量と封じ込め装置の使用に依存している伝統的な核酸の定量方法論、実用的な代替案を提供しています。 光度計微量技術は、液柱を形成するために、測定される試料の表面張力の特性に依存しているサンプル保持システムを採用しています。それは、サンプルが適切な列形成のための上限と下限の光学測定面に接触することが不可欠です。任意の時点での測定結果が再現が不正確かどうかと思われる場合は、それが最も可能性が高いサンプルの不均一性や液柱の破損の結果です。 洗剤やイソプロピルアルコールは、彼らが台座の測定面を無条件可能性があるため、洗浄剤を推奨されていません。無条件の台座には、サンプルの液滴の平坦化、その結果、台座の疎水性表面の特性が危険にさらされている場合に発生します。無条件の台座は、測定中に液柱の破損につながることができます。 <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。無条件の表面は、水滴の平坦化によって特徴付けられる。 Uncondtioned台座の表面は、光度計台座コンディショニング化合物（PR - 1、サーモサイエンティフィック㈱エルプロダクツ）を使用して再調整することができます。化合物を再調整の薄層が〜30秒間乾燥させ、上部と下部台座の表面に適用され、その後きれいな、乾いた、糸くずの出ないラボペーパーを使用してオフこすった。が正常に再調整状態は底部の台座の表面に適用した場合、最大ビーズ水滴によって特徴付けられる。 <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図は、4。再生された表面は、水滴のビーズアップによって特徴付けられる。 微量定量システムが大幅にサンプルの消費を削減し、より伝統的な定量化のシステムに比べて劇的に濃度範囲を増加させる。微量定量は、しばしばそのような針生検とレーザーキャプチャーマイクロダイセクションなどの限られた細胞集団が関与する状況を可能にする技術となっていますが、この手法の効率性と使いやすさは、それにも伝統的な核酸の定量方法に広く受け入れられている代替きましたと、サンプルが豊富です。

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

核酸の光度計微量定量

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

生体分子のアッセイは、継続的に多くの場合、微量の定量を行うことができるものについては核酸の定量のための従来のキュベットベースの計測器の使用を排除し、材料の徐々に少量を使用することを開発されています。 光度計微量サンプル保持システム（サーモサイエンティフィックの光度計の製品）などのキュベットやキャピラリーのような伝統的な封じ込め装置の独立したサンプルの微量をキャプチャして保持する光ファイバ技術と自然の表面張力の特性を組み合わせることで機能します。さらに、システムは本質的に希釈を行うために必要がなくなり、核酸濃度測定値の広い範囲につながる短いパスの長さを、採用しています。分光分析に必要なサンプルの量を減らすことはまた、多くの分子のワークフロー全体を通じて追加の品質管理の手順を含めることを容易に、効率を高め、最終的に下流の結果が大きな自信につながる。 限られた大量の高感度蛍光分析の必要性はまた、最近の実験の進歩で浮上している。同じ微量サンプル保持技術を用いて、蛍光の測定は、蛍光アッセイのボリュームの要件が大幅に削減できるように、材料の2μLを実行することができる。 10μL以下のようなmicroreactionsは、専用の微量fluorospectrometerを使用可能になりました。 二つの微量核酸の定量のプロトコルは、従来のキュベットベースのプロトコルへの実用的な代替案として、統合されたサンプル保持システムを使用することが実証されます。最初に、微量分光光度計を使用して直接A260吸光度法が説明されています。これは、微量fluorospectrometerで低次元ボリューム蛍光反応を可能にする蛍光ベースの方法のデモが続いている。これらの新しい技術は、1〜pg /μLのサンプルの最小限の消費量15,000 ng /μLのに至るまでの核酸濃度の評価を可能にします。

従来の核酸の定量方法論への実践的かつ効率的な代替案として光度計微量システムの使用は、2つの微量核酸の定量プロトコルのデモンストレーションを通して説明されています。

より少量の手法を用いるバイオ分子アッセイが継続的に開発されており、これにより従来の...の使用が困難になることが多くなっています。

NanoDropサンプル保持システムは、液体の固有の表面張力を利用して、QTSやキャピラリーを使用せずに2つの光学ペデスタルの間に微量サンプルを保持し、測定する革新的な技術です。1 µLという極少量のサンプルを、下側の光学表面の上に直接ピペッティングします。分光計のアームを閉じると、上部と下部の光学ペデスタルの間に液柱が形成されます。表面張力によって垂直の光路が形成されるため、測定中に垂直方向の光路長をリアルタイムで自動的に変更できます。光路長を短くすることで高濃度の測定が可能となり、ほとんどの核酸サンプルにおいて希釈操作を行う必要がなくなります。さらに、サンプル保持システムにより、光学表面をラボワイプで拭き取るだけで迅速な洗浄ができ、実験プロセスを効率化できます。本日は、Thermo Scientific社のマイクロボリューム分析装置を用いて核酸濃度を決定する2つの手順を実演します。最初のプロトコルは、NanoDrop 2000C分光光度計を用いた核酸の直接測定です。2つ目のプロトコルは、NanoDrop 3000 螢光分光光度計を用いた核酸の間接蛍光測定です。まず、マイクロボリューム分光光度計の試料保持システムの上下の光学面を洗浄します。2〜3 µLの清浄な脱イオン水を下側の光学面にピペットで滴下してください。レバーアームを閉じ、上側のペデスタルが脱イオン水に接触するようにします。その後、レバーアームを持ち上げ、清浄で乾燥した糸くずの出ないラボ用ワイプで両方の光学面を拭き取ります。次に、NanoDropソフトウェアを開き、核酸アプリケーションを選択します。校正済みの微量ピペットを使用して、下部の光学面に1 µLのバッファーを分注し、ブランク測定を行います。レバーアームを下げ、核酸アプリケーション内の「blank」を選択します。ブランク測定が完了したら、両方の光学表面をラボワイプで清掃します。前述と同様に、測定するサンプルの適切な定数を選択してください。次に、1 µLの核酸サンプルを下の光学ペデスタルに分注し、レバーアームを閉じます。測定は容量に依存しないため、サンプルは2つの光学表面の隙間を埋めるだけで十分です。測定を行うには、アプリケーションソフトウェアで「measure」を選択します。すると、ソフトウェアが核酸濃度と純度比を自動的に算出します。サンプルの測定後、スペクトル出力を確認してください。典型的な核酸サンプルは、非常に特徴的なプロファイルを示します。サンプルの品質が低いことを示すスペクトルの指標には、波形のベースライン（trough）におけるチップ状のノイズや、260 nanometerのピークに見られる不自然な変動があります。特定の核酸抽出法に関連する一般的な不純物の原因には、フェノール、トリゾール、およびカラム抽出が挙げられます。フェノール・トリゾール抽出の場合、220から240 nanometersの間の異常なスペクトルや、260から280 nanometer領域のシフトによって、残留試薬による汚染が示唆されることがあります。逆に、カラム抽出に由来する残留グアニジンが、230 nanometers付近のピークや、230 nanometersから約240 nanometersへの谷のシフトに寄与している可能性があります。サンプルの純度を正確に評価するには、2 62 80および2 62 30の比率を、スペクトル全体の品質と組み合わせて分析する必要があります。純粋な核酸の場合、2 62 80比は通常、DNAで約1.8、RNAで約2.0となります。この比率は、ブランクおよびサンプルの測定に使用される緩衝液のpHとイオン強度に依存します。Banana drop 3, 300 蛍光分光光度計は、NanoDrop 2000 C 分光光度計と同じ特許取得済みの微量サンプル保持システムを採用しています。わずか 1 µL のサンプルで蛍光測定が行われるため、ユーザーは3種類のLEDから励起光源を選択し、サンプルに対して水平方向に照射させます。続いて、サンプルの蛍光を垂直方向の90度の角度で内部分光器に収集します。NanoDrop 3, 300を用いた高感度微量核酸定量法を実演するため、PicoGreen蛍光キットを使用します。まず、キットの標準試料およびすべての核酸サンプルを室温に戻し、平衡化させます。蛍光試料は光に敏感であるため、琥珀色のチューブまたはアルミホイルで包んだチューブに保管してください。測定するすべての標準試料およびサンプル、ならびに必要となるPicoGreen作業溶液に十分な量の1X TEバッファーを調製します。提供された20X TEバッファーを、製造元のプロトコルに従って核酸フリー水で希釈し、1X TEバッファーを調製してください。反応液量は、200 µLから最小10 µLまで調整可能です。この例では、反応液量を10 µLとして準備します。次に、未知のDNAサンプルの予想濃度範囲をカバーするように、二本鎖DNA標準物質の段階希釈系列と、ヌクレアーゼフリーのバイアルまたはチューブを準備してください。希釈した二本鎖DNA標準物質をそれぞれ5 µLずつ、個別にラベルを貼ったヌクレアーゼフリーの遮光チューブ（琥珀色またはアルミ箔で覆ったもの）に分注します。次に、目的の二本鎖DNAサンプルをそれぞれ5 µLずつ、適切に遮光されたチューブに分注します。メーカーのプロトコルに従ってPico Green作動液を調製した後、二本鎖DNA標準物質または二本鎖DNAサンプルが入った各チューブに、同量（今回は5 µL）の溶液を加えてください。等量のXTEバッファーとPico Greenワーキングソリューションを混合します。参照溶液として機能するネガティブコントロールを調製します。緩やかなピペッティングによって各チューブの内容物を十分に混合し、室温で5分間インキュベートします。蛍光信号は温度の影響を受けるため、すべての標準試料およびサンプルは測定前に同じ温度に平衡化させてください。機器の準備と測定を行う前に、まずサンプル保持システムの上下表面を洗浄し、下部光学表面の近くに脱イオン水を2〜3 µL ピペットで滴下します。次に、レバーアームを開き、清潔な糸くずの出ないラボ用ワイプで上下のペデスタルを拭き取ります。次に進む前に、表面に糸くずが付着していないことを確認してください。糸くずは励起光源の下で蛍光を発し、測定に影響を及ぼす可能性があるためです。装置のソフトウェアを起動します。核酸アプリケーションを選択し、pico green 2本鎖DNAオプションを選択します。1 XTEを2 µL、下部ペデスタルにピペットで分注します。レバーアームを閉じ、装置ソフトウェアのフィールドで「blank」を選択します。ブランク測定が完了したら、サンプル保持システムの両面からブランク溶液を拭き取ります。次に、低吸着チップを用いて、リファレンス溶液を緩やかにピペッティングして混合します。リファレンス溶液を2 µL、下部ペデスタルにピペッティングし、レバーアームを閉じます。「Standards」タブで「Reference」を選択し、希望の単位を選択してください。「measure」をクリックして測定サイクルを開始します。測定サイクルが完了したら、レバーアームを開き、サンプル保持システムの表面を十分に拭き取ります。各レプリケートに新しいEloquaを使用して、リファレンスを最大5回まで測定します。標準曲線を作成するため、残りの標準試料についても同様の操作を繰り返します。標準試料は最大7つまで使用可能です。ソフトウェアでは、各標準試料につき最大5つの繰り返し測定値を保存できるよう設計されています。標準試料の反復測定値を平均して標準曲線を作成し、それに基づいてサンプルの濃度を自動的に決定します。標準曲線の作成が完了したら、「samples」タブを選択し、それぞれのサンプルID情報を入力して、各未知サンプルの測定を行ってください。有効な曲線が得られていることは、必要最低限の標準試料数が満たされていることを示しています。DNA濃度は標準曲線に基づいて自動的に算出されます。NanoDropマイクロボリューム機器では、直接的なA260測定または間接的な蛍光測定法のいずれかによって核酸濃度を決定できます。また、NanoDrop分光光度計は、直接的なA280吸光度測定またはタンパク質比色定量法を用いてタンパク質を定量することも可能です。

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