核酸の光度計微量定量

NanoDropサンプル保持システムは、液体の固有の表面張力を利用して、QTSやキャピラリーを使用せずに2つの光学ペデスタルの間に微量サンプルを保持し、測定する革新的な技術です。1 µLという極少量のサンプルを、下側の光学表面の上に直接ピペッティングします。分光計のアームを閉じると、上部と下部の光学ペデスタルの間に液柱が形成されます。

表面張力によって垂直の光路が形成されるため、測定中に垂直方向の光路長をリアルタイムで自動的に変更できます。光路長を短くすることで高濃度の測定が可能となり、ほとんどの核酸サンプルにおいて希釈操作を行う必要がなくなります。さらに、サンプル保持システムにより、光学表面をラボワイプで拭き取るだけで迅速な洗浄ができ、実験プロセスを効率化できます。

本日は、Thermo Scientific社のマイクロボリューム分析装置を用いて核酸濃度を決定する2つの手順を実演します。最初のプロトコルは、NanoDrop 2000C分光光度計を用いた核酸の直接測定です。2つ目のプロトコルは、NanoDrop 3000 螢光分光光度計を用いた核酸の間接蛍光測定です。

まず、マイクロボリューム分光光度計の試料保持システムの上下の光学面を洗浄します。2〜3 µLの清浄な脱イオン水を下側の光学面にピペットで滴下してください。レバーアームを閉じ、上側のペデスタルが脱イオン水に接触するようにします。その後、レバーアームを持ち上げ、清浄で乾燥した糸くずの出ないラボ用ワイプで両方の光学面を拭き取ります。

次に、NanoDropソフトウェアを開き、核酸アプリケーションを選択します。校正済みの微量ピペットを使用して、下部の光学面に1 µLのバッファーを分注し、ブランク測定を行います。レバーアームを下げ、核酸アプリケーション内の「blank」を選択します。

ブランク測定が完了したら、両方の光学表面をラボワイプで清掃します。前述と同様に、測定するサンプルの適切な定数を選択してください。次に、1 µLの核酸サンプルを下の光学ペデスタルに分注し、レバーアームを閉じます。

測定は容量に依存しないため、サンプルは2つの光学表面の隙間を埋めるだけで十分です。測定を行うには、アプリケーションソフトウェアで「measure」を選択します。すると、ソフトウェアが核酸濃度と純度比を自動的に算出します。サンプルの測定後、スペクトル出力を確認してください。典型的な核酸サンプルは、非常に特徴的なプロファイルを示します。

サンプルの品質が低いことを示すスペクトルの指標には、波形のベースライン（trough）におけるチップ状のノイズや、260 nanometerのピークに見られる不自然な変動があります。特定の核酸抽出法に関連する一般的な不純物の原因には、フェノール、トリゾール、およびカラム抽出が挙げられます。フェノール・トリゾール抽出の場合、220から240 nanometersの間の異常なスペクトルや、260から280 nanometer領域のシフトによって、残留試薬による汚染が示唆されることがあります。

逆に、カラム抽出に由来する残留グアニジンが、230 nanometers付近のピークや、230 nanometersから約240 nanometersへの谷のシフトに寄与している可能性があります。サンプルの純度を正確に評価するには、2 62 80および2 62 30の比率を、スペクトル全体の品質と組み合わせて分析する必要があります。純粋な核酸の場合、2 62 80比は通常、DNAで約1.8、RNAで約2.0となります。

この比率は、ブランクおよびサンプルの測定に使用される緩衝液のpHとイオン強度に依存します。Banana drop 3, 300 蛍光分光光度計は、NanoDrop 2000 C 分光光度計と同じ特許取得済みの微量サンプル保持システムを採用しています。わずか 1 µL のサンプルで蛍光測定が行われるため、ユーザーは3種類のLEDから励起光源を選択し、サンプルに対して水平方向に照射させます。

続いて、サンプルの蛍光を垂直方向の90度の角度で内部分光器に収集します。NanoDrop 3, 300を用いた高感度微量核酸定量法を実演するため、PicoGreen蛍光キットを使用します。まず、キットの標準試料およびすべての核酸サンプルを室温に戻し、平衡化させます。蛍光試料は光に敏感であるため、琥珀色のチューブまたはアルミホイルで包んだチューブに保管してください。

測定するすべての標準試料およびサンプル、ならびに必要となるPicoGreen作業溶液に十分な量の1X TEバッファーを調製します。提供された20X TEバッファーを、製造元のプロトコルに従って核酸フリー水で希釈し、1X TEバッファーを調製してください。反応液量は、200 µLから最小10 µLまで調整可能です。

この例では、反応液量を10 µLとして準備します。次に、未知のDNAサンプルの予想濃度範囲をカバーするように、二本鎖DNA標準物質の段階希釈系列と、ヌクレアーゼフリーのバイアルまたはチューブを準備してください。

希釈した二本鎖DNA標準物質をそれぞれ5 µLずつ、個別にラベルを貼ったヌクレアーゼフリーの遮光チューブ（琥珀色またはアルミ箔で覆ったもの）に分注します。次に、目的の二本鎖DNAサンプルをそれぞれ5 µLずつ、適切に遮光されたチューブに分注します。メーカーのプロトコルに従ってPico Green作動液を調製した後、二本鎖DNA標準物質または二本鎖DNAサンプルが入った各チューブに、同量（今回は5 µL）の溶液を加えてください。

等量のXTEバッファーとPico Greenワーキングソリューションを混合します。参照溶液として機能するネガティブコントロールを調製します。緩やかなピペッティングによって各チューブの内容物を十分に混合し、室温で5分間インキュベートします。

蛍光信号は温度の影響を受けるため、すべての標準試料およびサンプルは測定前に同じ温度に平衡化させてください。機器の準備と測定を行う前に、まずサンプル保持システムの上下表面を洗浄し、下部光学表面の近くに脱イオン水を2〜3 µL ピペットで滴下します。次に、レバーアームを開き、清潔な糸くずの出ないラボ用ワイプで上下のペデスタルを拭き取ります。

次に進む前に、表面に糸くずが付着していないことを確認してください。糸くずは励起光源の下で蛍光を発し、測定に影響を及ぼす可能性があるためです。装置のソフトウェアを起動します。

核酸アプリケーションを選択し、pico green 2本鎖DNAオプションを選択します。1 XTEを2 µL、下部ペデスタルにピペットで分注します。レバーアームを閉じ、装置ソフトウェアのフィールドで「blank」を選択します。ブランク測定が完了したら、サンプル保持システムの両面からブランク溶液を拭き取ります。

次に、低吸着チップを用いて、リファレンス溶液を緩やかにピペッティングして混合します。リファレンス溶液を2 µL、下部ペデスタルにピペッティングし、レバーアームを閉じます。「Standards」タブで「Reference」を選択し、希望の単位を選択してください。

「measure」をクリックして測定サイクルを開始します。測定サイクルが完了したら、レバーアームを開き、サンプル保持システムの表面を十分に拭き取ります。各レプリケートに新しいEloquaを使用して、リファレンスを最大5回まで測定します。

標準曲線を作成するため、残りの標準試料についても同様の操作を繰り返します。標準試料は最大7つまで使用可能です。ソフトウェアでは、各標準試料につき最大5つの繰り返し測定値を保存できるよう設計されています。

標準試料の反復測定値を平均して標準曲線を作成し、それに基づいてサンプルの濃度を自動的に決定します。標準曲線の作成が完了したら、「samples」タブを選択し、それぞれのサンプルID情報を入力して、各未知サンプルの測定を行ってください。有効な曲線が得られていることは、必要最低限の標準試料数が満たされていることを示しています。

DNA濃度は標準曲線に基づいて自動的に算出されます。NanoDropマイクロボリューム機器では、直接的なA260測定または間接的な蛍光測定法のいずれかによって核酸濃度を決定できます。また、NanoDrop分光光度計は、直接的なA280吸光度測定またはタンパク質比色定量法を用いてタンパク質を定量することも可能です。