着床前遺伝子診断のためのFISH

この記事では、シングルセルFISH、割球の核の拡散技法、およびin situハイブリダイゼーションと臨床の現場で着床前遺伝子診断（PGD）に印加さ​​れる信号のスコアリング、適したプローブの選択について説明します。

この手順の目的は、蛍光in situ 2ハイブリダイゼーション技術を使用して、遺伝的異常のリスクがあるin vitroヒト胚の性染色体または転座状態を決定することです。これは、3日目の胚からスライドガラス上に生検された単一細胞を溶解し、核を空気乾燥させることによって達成されます。第2のステップは、Dの性質をコードし、異なる色の蛍光色素で標識されたDNAプローブと標的核DNAをハイブリダイズすることです。

次に、余分なプローブを厳格な洗浄を使用して除去し、核をDNA特異的な蛍光染色で染色します。最後のステップは、蛍光顕微鏡を使用して原子核を観察し、デジタル画像をキャプチャすることです。最終的には、蛍光顕微鏡法により標的染色体領域のコピー数を示す結果を得ることができます。

一般的に、この技術に不慣れな人は、蛍光in situハイブリダイゼーション技術の限界に達しているため、苦労するでしょう。24時間前に、細胞を拡散するための細胞溶解バッファーを準備します。溶液をろ過し、1ミリリットルのアリコートを10〜15、1.7ミリリットルの滅菌マイクロ遠心分離機チューブに分配し、生検手順の直前に摂氏マイナス20度で凍結する前にチューブにラベルを付けます。

溶解バッファーを室温で解凍します。ダイヤモンドペンを使用して、アミンコーティングされたスライドの下側に直径約5ミリメートルの小さな円を刻み、次にラテックス手袋でスライドBLOに事前にラベル付けされた硬い4H鉛筆を使用します。グラファイトダストを除去するには、ブラスターミラーごとに番号順に別々のスライドを使用します。

次に、円の中に少量の溶解バッファーを置きます。生検ブラスターを溶解バッファーに移します。必要に応じて溶解バッファーを添加し、細胞を溶解します。

原子核を観察して、原子核が円内に留まり、失われていないことを確認します。細胞に核がない場合、または複数の核がある場合は、別の細胞を生検します。スライドを室温で風乾させます。

まず、リン酸緩衝生理食塩水を使用して、室温で5分間、コプランジャーでサンプルを事前に洗浄します。次に、滅菌蒸留水で2回すすぎ、エタノールシリーズで脱水し、室温でそれぞれ2分間、自然乾燥させます。スライドが完全に浸されていることを確認し、グラファイトの粉塵が表面に浮かんでいる場合は、きれいなティッシュで浸してください。

位相差顕微鏡で視覚化することにより、円内の原子核の位置を記録します。次に、サンプルを100%エタノールで室温で2分間脱水し、風乾します。次に、2マイクロリットルのプローブ混合物を塗布し、9 x 9ミリメートルのカバースリップで覆います。

カバースリップの端をゴムセメントで密封します。コード化されたナチュリングを実行します。摂氏75度のヒートブロックを5分間踏んでから、摂氏37度の加湿チャンバーでカップリングジャーごとに一晩ハイブリダイズします。

50ミリリットルの0.4倍のSSCストリジェント洗浄液を摂氏71度の水浴中で平衡化します。厳格な洗浄ボトルと空のカップリングジャーを室温のpH71°Cの水浴に入れ、厳格な洗浄とデカントをコーチンジャーに入れます。各スライドからゴムセメントを慎重に取り除き、室温でSSC 0.05%tween 20 pH 7の4倍を使用してカバースリップを洗い流します。

71°Cの0.4倍のSSCストリンストリント洗浄で5分間、続いて4倍のSSC 0.05%Tween 20を室温で2分間洗浄します。間接的に標識されたプローブの場合は、スライドから余分な液体を排出し、20 x 20 mm四方のパラフォームの下に20マイクロリットルの蛍光標識抗体を塗布します。37°Cの加湿チャンバーで15分間インキュベートします。

パラフィルムをはがし、以下の洗浄を室温で2分間行ってください。SSC 0.05%tween 20の4回に1回、PBSで2分間に2回。スライドを排出した後、DPIを含む6マイクロリットルのベクトルシールド封入剤を22 x 22 mmに塗布します。

ナンバーゼロのカバーを滑り込ませ、カバーの上でスライドを反転させます。カバースリップの端をスリップブロットし、透明なマニキュアでシールします。最後に、蛍光顕微鏡でサンプルを分析します。

2 人の独立したアナリストが各核をスコアリングします。また、イメージングソフトウェアを使用して核の画像をキャプチャし、視覚的診断の確認や、ラボの品質保証の一環として画像アーカイブを行います。ここでは、末梢血リンパ球から調製された中期の広がりと期間核は、5番染色体と9番染色体の短腕の間の相互転座のキャリアを示しており、ブレークポイントは5つのP 14.3と9つのP 2、4.1です。

魚のプローブは、9番染色体シグナルのトランス位置セグメントと中心セグメントの両方を照らします。3日目からの界面芽球の単なる核では、胚を捕捉し、結合して合成画像を形成することができます。各プローブの2つの信号は、各遺伝子座の2つのコピーを示し、これは正常または平衡補体と一致します。

転座染色体の場合、色付きの信号は、染色体のトランス位置セグメントの1つのコピー、5番染色体のトランス位置セグメントの3つのコピー、およびCH染色体9の中心セグメントの2つのコピーを示します。このデータは、5つのPが14.3〜5PTのman somiと、9つのPが2、4.1〜9ptのトリソミーという不均衡な積と一致しています。このビデオを見れば、ヒト胚から生検した単一細胞を解析し、蛍光in situハイブリダイゼーション技術を使用して単一核を調製する方法を十分に理解できるはずです。

これは、性染色体補体、または胚の転座状態を決定するための再現性のある最適な試験結果を達成するために重要です。