Name: 着床前遺伝子診断のためのFISH (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 学ぶ着床前遺伝子診断のためのFISH法。ヒト胚由来単一細胞バイオプシーの核を溶解・固定し、蛍光標識DNAプローブとハイブリダイゼーションすることで、性染色体や転座異常を検出する技術を習得できます。

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1。生検割球から核を溶解し、拡散<ol><li>拡散セル（0.01 M塩酸に0.2％のTween20、pHは2.0）のための細胞溶解バッファーは、事前に24時間を用意し、-20℃で保存してください。滅菌20mLのシリンジとシリンジフィルターを用いて30 mLの滅菌ユニバーサル容器に100 mLとフィルタ20 mLを準備する。 10月15日を1.7 mL滅菌マイクロ遠心チューブに1 mLのアリコートを分注、閉じて、前に凍結するチューブにラベルを付けます。それは、新しいバッチが不十分である場合、テストされており、使用することができます使用される二つの異なるバッチ、新規のバッチと、以前のバッチを、持っていることをお勧めします。 </li><li>デフロストの30分生検の手続きの前に室温で溶解バッファー。実用的な目的のために働く温度は室温と手の温度の間になります。 </li><li>ダイヤモンドのペンと事前にラベルをケースの数、ユニークなスライド番号、および生検の日付とスライドを使用して、アミンコーティングしたスライド（例えばGenetix）の下側にある小さな円を（約5 mmの直径）のスコア。別々の番号順に各割球用スライド、および胚の数とラベルを使用してください。スライドは、4Hのような硬い鉛筆で標識し、任意のグラファイト塵を除去するためにラテックスの手袋と"ブロット"する必要があります。 </li><li>サークル内での溶解緩衝液少量を置きます。 </li><li>溶解バッファー中に生検割球を移す。細胞が溶解し始めるまでに必要な円の中に溶解バッファーを追加した場合、セルは完全に溶解する必要がありますし、細胞質には、バッファが乾燥する前に分散させる。 </li><li>それは円の中に残っていると失われないことを保証するために核を観察し、細胞が核を持っているか、複数の核を持っていない場合は、別のセルを生検。 </li><li>室温で空気乾燥にスライドしておきます。 </li></ol> （2）単一割球の核のin situハイブリダイゼーション <ol><li>滅菌蒸留水で構成されたエタノールシリーズ（70、90および100％）を準備する。 </li><li> ℃をオンにして75にホットブロック（例えばHybaid OmnislideまたはバイシスHybrite）を設定します。 </li><li>デフロストプローブ、渦、および遠心。試薬を目撃し、プローブの混合物を構成する前に、正しいことを検証する必要があります。ピペット0.65 mLの滅菌マイクロ遠心チューブに、使用前にボルテックスと遠心でプローブの混合物を補うために製造業者によって指定されたボリューム。プローブの混合物の合計量は、核あたり2μLをテストし、安全マージンを可能にするために最も近い10μLに切り上げできるようにするには十分なはずです。 </li><li>室温で5分間。：使用してリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（0.14 MのNaCl、3mMのKCl、10mMののNa 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4 pH7.0）をコプリンジャーにスライドをプレ洗浄</li><li>滅菌蒸留水で2回スライドを洗浄します。 </li><li>室温と空気乾燥で2分間ずつエタノールシリーズ（70、90、および100％）でスライドを脱水する。スライドが完全に浸漬し、任意のグラファイト塵が表面に浮く場合、きれいなティッシュで吸い取りされていることを確認します。 </li><li>位相差顕微鏡で視覚化することによって円の中に核の位置を記録します。 </li><li>室温と空気乾燥で2分間、100％エタノールで脱水。 </li><li>プローブの混合物の2μLを適用する、と9 × 9mmのカバー（18 x 18のmm第1カバースリップの4分の1）でカバー。 </li><li>ラバーセメント（;牛の校正などの牛ガム）でカバースリップの端をシールします。 </li><li> 37℃加湿チャンバー内（16〜20時間）一晩のスライドをハイブリダイズし、5分間75℃でホットブロック上でスライドをCodenature、と℃のセントロメアプローブ（劣性ケースの例）だけで構成されるプローブミックスは、ハイブリダイゼーションの60分後に満足のいく結果が得られます。 </li><li> 71に十分なコプリンジャーと熱と水の風呂を沸かす℃に</li><li> 0.4x標準クエン酸生理食塩水（SSC）厳しい洗浄溶液（71時のpH 7.0 ° C、0.06 MのNaCl、6 mMのC 6 H 5のNa 3 O 7 · 2H 2 O）と水浴中で熱を準備。 </li><li>必要なコプリンジャー当たり厳しい洗浄50mLを分注し、温度が71であることを確認してください° C直ちに清浄な温度計を使用して、使用する前に。 </li><li>慎重に各スライドからゴムセメントを除去し、室温で4倍SSC/0.05％のTween20（pH7.0）を用いてカバースリップを洗い流す。 </li><li> 71で0.4x SSC厳しい洗浄でスライドを洗う℃で5分間。コプリンジャーあたり1 6よりもスライドを洗浄してください。 </li><li> 2分間、室温で4倍SSC/0.05％のTween20をでスライドを洗浄してください。 </li><li>プローブミックスは、間接的に標識プローブ（複数可）が含まれている場合、余分な液体のスライドを排出し、パラフィルムの20 × 20mm角の下に蛍光標識抗体20μLを適用します。 </li><li> 37℃加湿チャンバー内でインキュベート℃で15分間。 </li><li>パラフィルムを外し、2分間、室温で4倍SSC/0.05％のTween20をで一度洗う。 </li><li> PBSで2分間2回洗浄するtの室温とスライドを排出。 </li><li>ない22 × 22 mmまでDAPI / Vectashield（4、160 ngの"Vectashieldマウンティング培地、ベクターラボラトリーズの1 mLの1,6 - ジアミジノ-2 - フェニル二塩酸塩）の6μLを適用します。 0カバーガラスとカバーグラス上にスライドして反転。 </li><li>ブロットおよび明確なマニキュアでカバースリップの端をシールします。 </li></ol> 3。蛍光顕微鏡を用いた解析では、好適に用いるプローブのための適切なフィルターを装備。 <ol><li>アッセイにおける蛍光顕微鏡および各蛍光色素の単一バンドパスフィルタを使用して直接可視化によるスコアの信号。それぞれの原子核は2つのアナリストによって得点されるべきである。一般的なガイドラインは、狭い間隔で2つの信号が離れて一つのドメイン（信号幅）未満の単一の信号の得点につながる必要がありますが、経験に基づく判断は大きさ、強度、および分離を様々な信号を解釈するために行使する必要があります。 </li><li>視覚的な診断の確認のため、および実験室の品質保証計画の一環として、画像のアーカイブのために核の画像をキャプチャするために、イメージングソフトウェア（CytoVision、Genetix等イシス、メタシステム、Altlussheim、ドイツ）を使用してください。 </li></ol> 4。代表的な結果： 培養末梢血リンパ球から分裂中期および間期核は、選択されたプローブは、ブレークポイントのための有益な、転座の染色体に特異的な（subtelomereプローブが中心に転セグメントとセントロメアプローブ（s）にのみハイブリダイズすることを確認するために検討する必要がありますセグメント（S））と間期核に信号が明るいと離散してください。各パートナーか​​ら100間期核内の各プローブの信号の数を得点とアッセイの効率を評価することをお勧めします。この場合、2つの信号は、各プローブの核の95％-99％でスコア化した。図1は、染色体5および9の短腕の間に相互転座のための準備から分裂中期および間期核を示しています。 胚の割球から間期核内の信号は、明るく、離散的になると使用される色に別々のバンドパスフィルタを使ったスコア付けてください。図2は、第5染色体と9の通常またはバランスのとれた染色体の補数との一貫性のある正常な信号パターン（テストされたすべての遺伝子座の2コピー）、および転座のアンバランスの製品との一貫性のある異常な信号パターンを持つ原子核と割球の核を示しています。それは第5染色体と9番染色体の転セグメントのトリソミー（3部）の転セグメントのモノソミー（つのコピー）があります。 <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1分裂中期スプレッドと5p14.3と9p24.1における染色体5とブレークポイントの9の短腕との間の相互転座のキャリアから培養した末梢血リンパ球から調製した間期核：46、XY、T（5 、9）（p14.3; p24.1）っぽいT（5、9）（5ptel48 -、9ptel30 +; 9ptel30 -、5ptel48 +、9cen +）。 （; 9p24.1→9pter、緑Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC 5p14.3→5pter、赤Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed）と9番染色体の中心部分（9p24.1→9qter、青アボットCEP 9 FISHプローブは、転セグメントの両方のために選択したアルファサテライトSpectrumAqua）。 <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 日- 3胚から間期割球の核の図2。シグナルは、それぞれの蛍光色素との複合画像を形成するために合併のための異なるフィルタを使用してキャプチャ。 （A）転座染色体の正常またはバランスの補数と一致している各遺伝子座、2つのコピーを示す各プローブの2つの信号。 （B）一つの赤いシグナル、3つの緑色の信号と第5染色体の転セグメントの1つのコピーを示す2つの青の信号、9番染色体の転座のセグメントの3つのコピーと、隣接すると一貫性のある9番染色体の中心の部分、の2つのコピー9p24.1→9pter用5p14.3→5pterとトリソミーのためのモノソミーとアンバランスの製品で、その結果転座の-1分離。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

単胚細胞（割球）にin situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光のアプリケーションは、実用性にし、信号パターンの解釈の両方の特殊な課題を提示している。細心の注意は、細胞質が分散されていることを、細胞が溶解されることを確実に取られる必要があります、そしてその核、生検細胞はその局在以下のFISHを容易にするために、スライド上のあらかじめ定義されたエリア内に分散する必要がある診断は、この単一のセル、厳格なスコアリングと解釈のガイドラインを適用する必要があるから結果に依存するように、と、目に見えるとそのままです。しかし、経験豊富な手の中に、FISHは、臨床診療における着床前遺伝子診断（PGD）のための堅牢なテクニックです。 FISHによるPGDの原理は、異なる蛍光色素やハプテンで標識された標的特異的DNAプローブは、ロバートソンを含め、特定の遺伝子座のコピー数を検出するために、そしてそれによって染色体再配列の減数分裂分離（1）に関連付けられている染色体の不均衡を検出するために使用できることです転座、相互転座、逆位、および複雑な再編成（2）。 FISHもない突然変異特異的なテスト（3、4）存在しないため、X連鎖疾患を持つ家族の女性の胚を選択するために使用することができます。より多くの論争、FISHは、生殖補助（5、6）の効率を改善するためにために散発的な染色体の異数性のスクリーニングにも使用されていますが、FSIHを使用して、このテストの予測値は、ほとんどの人々のに容認できないほど低い可能性が高いです手とそれは日常的な臨床使用（7）には推奨されません。この記事では、技術的側面と臨床的単一細胞診断に適用されるFISHの限界に集中。 単一の割球を拡散し、固定の方法は、メタノール/酢酸（5、8）、ツイーン/塩酸（9）、およびTween / HClおよびメタノール/酢酸（10）の組み合わせが含まれています。バリエーションは、事前の拡散および/またはペプシンへの細胞の低張処理し、固定後のホルムアルデヒド処理が挙げられる。メソッドは、適切に実験室（14）のために検証する必要があります。トゥイーン/塩酸メソッドは、この記事で詳細に説明されています。トゥイーン/塩酸法では、異なる研究室で技術的に簡単な再現性の高いです。このメソッドは、許容診断精度（7）とのセックスの決定と染色体再配列のFISH診断のための単一の核を準備するために使用することができます。 プローブミックスは、異なるメーカーのプローブ、およびプローブを直接標識して間接的に標識組み合わせることができます。既知の多形性染色体領域のためのプローブ（11,12）、または両方の生殖のパートナーに事前のテストでPGDのための具体的かつ適切であることが示される場合に使用することができますが、他の染色体（13）で有意にクロスハイブリダイズすることが知られているものは、避けるべきである。目の肥えたプローブで使用可能な蛍光色素/ハプテンと戦略は次のとおりです。テキサスレッド（TR）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、SpectrumGreen（バイシス）、SpectrumOrange（バイシス）、SpectrumAqua、TR -アビジンで検出されたビオチン化プローブを、FITC -アビジン、またはをCY - 5ストレプトアビジン（FarRedフィルタを用いて可視化）、黄信号、ハイブリダイゼーションの第二ラウンドと）TexasRedとSpectrumGoldフィルタを使用してSpectrumOrangeのシーケンシャルキャプチャすることにより作成された別の色を生成するために赤と緑のプローブのミックス。 XとY染色体と常染色体つのセントロメア領域の特定の3つのプローブを含むプローブセットは、性別判定（14）をお勧めします。常染色体プローブは、（2N、47トリソミーXとを区別する倍数性とそれによって確立するために使用されます、XXX）と三倍体（3N、69、XXX）、およびテトラソミーX（48、XXXX）とtetraploidy（4N、92、XXXX）の間。このプローブセットは非常に低い多型率を持つことが実証されているため、前処理作業まで生殖パートナーの、典型的なプローブは、α-サテライトX、Y、および18を含むアボットのAneuVysionミックスは、この設定に適用される設定（14）は不要です。 特定の再配置のためのプローブミックスはする必要があります。理想的に染色体の不均衡と再配置のすべての期待される製品を検出するには、少なくとも十分なプローブが含まれています。これが不可能な場合、プローブは検出されずにアンバランスの製品が認識可能な妊娠で非現実的なように評価し、非常に低い有病率は（14）許容さ​​れる場合があるためにそれがある場所ミックス。両方の生殖のパートナーか​​ら培養したリンパ球分裂中期でテストされる。少なくとも10の分裂中期スプレッドは、プローブの特異性、遺伝子多型とクロスハイブリダイゼーションのために検討されるべきである、と、染色体再配列のキャリアのための、プローブとして再配置の異なるセグメントに予想されるハイブリダイズことを確認します。さらに、これらの調製物から少なくとも100間期核は、信号の特異性、明るさ、および離散性（14）を評価するために得点する必要があります。 コムデギャルソンrcial PGSのプローブセットが利用可能である（例えば、アボットMultiVysion PBまたはPGT）、最も頻繁に受胎産物で異数性があることが判明染色体をターゲットとし、標的染色体ごとに単一のプローブで構成される。典型的には核が染色体13、15、16、18、21、22、及びXY（14）についてのアッセイを提供する追加の染色のためのプローブで2番目のハイブリダイゼーションを持つことができます。拡散とFISH技術はここで説明を使用してこのテストの予測値は、ほとんどの人々の手に許容できないほど低くなる可能性が高いと、それは（7、15）日常の臨床使用は推奨されていません。 単一のセルに適用されるような比較ゲノムハイブリダイゼーションなどの手法（CGH）各染色体のコピー数（ウィルトンら、2001）をテストすることができる、と一塩基多型（SNP）アレイと定量分析（の使用Wells ら、2008年）や&quot;karyomapping&quot;遺伝子型は（ハンディーら 2009）染色体の異数性を検出するための代替技術を期待されている。しかし、セグメントの不均衡の解像限界と精度が不安定なままであると、それは魚が小さなセグメントを含む染色体再配列のための選択の手法であり続けるだろうと思われる。

<table><tbody><tr><td>塩酸、2.5L</td><td>VWR international</td><td>101254H</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム、5kg</td><td>VWR international</td><td>443827W</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム, 250g</td><td>VWR international</td><td>26764.232</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム 無水 500g</td><td>VWR international</td><td>102494C</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム, 500g</td><td>VWR International</td><td>10203 4B</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウムペレット、500g</td><td>VWR international</td><td>28245.265</td><td></td></tr><tr><td>Tween20, 500mL</td><td>VWR international</td><td>663684B</td><td></td></tr><tr><td>エタノール, 2.5L</td><td>VWR international</td><td>8.18760.2500</td><td>関税込み</td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム, 5Kg</td><td>VWR international</td><td>27833.363</td><td></td></tr><tr><td>牛ゴム溶液, 250mL</td><td>Cow Proofings Ltd.</td><td>利用不可</td><td>古い在庫は、今でも画材店で見つけることができます。</td></tr><tr><td>DAPI/Antifade ES, 0.125&amp;mu;g/mL, 500μL</td><td>Cytocell Ltd.</td><td>DES500L</td><td>150&amp;#x03BC;バイアル回収&amp;rsquo;各Cytocell TELプローブに付属しています</td></tr><tr><td>ネイルニス, 12mL</td><td>ブーツ</td><td>10088316001</td><td></td></tr><tr><td>アミンコートスライドグラス, 25枚</td><td>ジェネティクス</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>DAPI、0.1mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield、10mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas-Red-アビジン、0.001mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2016</td><td></td></tr><tr><td>FITC-アビジン、0.001mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Cy-5 ストレプトアビジン、0.001mL</td><td>GE Healthcare</td><td>PA45001</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ、1.75mL、500本入</td><td>シスル・サイエンティフィック</td><td>AX-MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ、0.6mL、1000本入</td><td>シスル・サイエンティフィック</td><td>AX-MCT-060-C-CS</td><td></td></tr><tr><td>30ml汎用コンテナ、400個入り</td><td>ステリリン</td><td>128B</td><td>NHS Supply Chainより入手可能（カタログ番号：KCP053）</td></tr><tr><td>ホットブロック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルコールランプ アルコールランプ用ソケット アルコールランプ用芯</td><td>VWR international</td><td>451-0107 451-3112 451-3111</td><td></td></tr><tr><td>栓付きガラスピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>PMK-300-052R</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ティッシュペーパー、100箱</td><td>NHSサプライチェーン</td><td>MJT058</td><td></td></tr><tr><td>金属製培養トレイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製メラミン樹脂製トレイ</td><td>VWR international</td><td>682-009</td><td></td></tr><tr><td>オーブン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>口ピペット用マウスピース</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>HAE3700</td><td></td></tr><tr><td>チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター、0.2 μm&amp;mu;孔径m、直径25mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FDM-340-010U</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドペン</td><td>VWR international</td><td>818-0021</td><td></td></tr><tr><td>スライド用ホットブロック</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HBOSBB</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションチャンバー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ティッシュロール</td><td>NHSサプライチェーン</td><td>MJT004</td><td></td></tr><tr><td>シーファーデッカー・ジャー</td><td>VWR international</td><td>631-9313</td><td></td></tr><tr><td>コップリンジャー</td><td>VWR international</td><td>631-9331</td><td></td></tr><tr><td>精密ピンセット</td><td>VWR international</td><td>232-2123</td><td></td></tr><tr><td>鈍端鉗子</td><td>VWR international</td><td>232-2113</td><td></td></tr><tr><td>1000mLビーカー</td><td>VWR international</td><td>213-1642</td><td></td></tr><tr><td>位相差顕微鏡</td><td>ニコン製機器</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>ファイバーフリーブロッティングカード、100枚入</td><td>Fisher Scientific</td><td>SDE1</td><td></td></tr><tr><td>青色フロステッド顕微鏡スライドグラス、100枚入り</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3022</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス、18x18mm、No. 1、200枚入</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3110</td><td></td></tr><tr><td> カバーガラス、22x22mm、No. 0、200枚入</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3104</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス、22x50mm、No. 0、100枚入り</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3206</td><td></td></tr><tr><td>1mLシリンジ、100本入</td><td>NHSサプライチェーン</td><td>FWC045</td><td></td></tr><tr><td>1mLピペットチップ、1000本入×10ラック</td><td>シスル・サイエンティフィック</td><td>AX-T-1000-C-L-R</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>低電気泳動可溶性複合体（LEEC）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温水槽</td><td>助成金による設備</td><td>W22</td><td></td></tr><tr><td>アルコール温度計</td><td></td><td></td><td>利用可能なさまざまなソース</td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>Jenway</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>pH電極</td><td>VWR international</td><td>662-1759</td><td>Jenway pHメーター 3305用BNCプラグ</td></tr><tr><td>加熱攪拌機</td><td>ビビー</td><td>HC502</td><td></td></tr><tr><td>1mLパストールピペット、500本入り</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP4202</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム、50mm x 75m</td><td>VWR international</td><td>291-1214</td><td></td></tr></tbody></table>

着床前遺伝子診断のためのfish

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

着床前遺伝子診断（PGD）は、胎児診断に確立された代替手段であり、そして生殖補助技術（ART）によって生成されたコホートから着床前の胚を選択することが含まれます。一方のパートナーは、染色体の再配列（例えば、双方向の相互転座）搬送するため、この選択があるため家族性単一遺伝子疾患（例えば、嚢胞性線維症）が必要、または可能性があります。 PGD​​は、および/または染色体再配列、再発性流産、または不妊の場合には、以前の影響を受ける子供たちを持っていたカップルのために利用可能です。卵母細胞は、以下の卵巣刺激が精液を用いたin vitro浸漬（IVF） にするか、個々の精子（ICSI）の細胞質内注入によって受精されている吸引。着床前の切断段階の胚は、通常3日後の受精で単一細胞の除去によって、生検を実施している、と生検細胞は、胚の遺伝的地位を確立するためにテストされています。標的特異的DNAプローブと生検細胞の固定核のin situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光は、染色体再配列に関連付けられている染色体の不均衡を検出するための選択のテクニックであり、そしてそこにであるためにX連鎖性疾患を持つ家族の女性の胚を選択するは変異しない固有のテスト。 FISHは、試してみて、生殖補助の効率を向上させるために、自発的な染色体の異数性（またPGSとして、またはPGD - AS知られている）のための画面の胚にも使用されていますが、拡散とFISH法を用いてこの試験の予測値は、ここで説明ほとんどの人々の手に許容できないほど低くなる可能性が高いと、それは日常的な臨床使用は推奨されていません。我々は、単一セルFISH、割球の核の拡散技術、及びin situハイブリダイゼーションと臨床の現場でPGDに印加される信号のスコアリング、適したプローブの選択について説明します。

この記事では、シングルセルFISH、割球の核の拡散技法、およびin situハイブリダイゼーションと臨床の現場で着床前遺伝子診断（PGD）に印加さ​​れる信号のスコアリング、適したプローブの選択について説明します。

着床前遺伝子診断のためのFISH

着床前遺伝学的診断（PGD）は、出生前診断に代わる確立した手法であり、...から着床前胚を選択することを含む。

この手順の目的は、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）法を用いて、遺伝的異常のリスクがある体外受精ヒト胚の性染色体または転座の状態を判定することです。これは、3日目胚から生検した単一細胞をガラススライド上で溶解し、核を風乾させることで行われます。次のステップでは、標的となる核DNAを変性させ、異なる色の蛍光色素で標識されたDNAプローブを用いてハイブリダイゼーションを行います。次に、厳格な洗浄（ストリンジェントウォッシュ）によって過剰なプローブを除去し、核をDNA特異的な蛍光染色剤で染色します。最終ステップとして、蛍光顕微鏡を用いて核を観察し、デジタル画像をキャプチャします。最終的に、蛍光顕微鏡観察を通じて、標的染色体領域のコピー数を示す結果を得ることができます。一般的に、この手法に不慣れな方は、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）技術の限界に近い操作であるため、苦労することがあります。細胞を展展させるための細胞溶解バッファーを24時間前に準備してください。溶液をろ過し、1.7 mLの滅菌マイクロ遠心チューブ10〜15本に1 mLずつ分注します。生検の手順の直前に、チューブに蓋をしてラベルを貼り、-20 °Cで凍結保存してください。ライシスバッファーを室温で解凍します。アミンコートスライドの裏面に、ダイヤモンドペンを用いて直径約5mmの小さな円状の傷をつけ、次に4Hの硬い鉛筆を使用して、ラテックスグローブを着用した状態でスライドに「BLO」とあらかじめラベルを付けます。グラファイトの粉塵を除去するため、ブラスターミラーごとに別のスライドを番号順に使用してください。次に、円の中に少量の溶解バッファーを入れます。バイオプシーブラスターを溶解バッファーの中に移します。細胞を溶解させるために、必要に応じて溶解バッファーを追加してください。核が円の中に留まっており、消失していないことを確認します。細胞に核がない場合、または複数の核がある場合は、別の細胞を生検します。スライドを室温で自然乾燥させます。まず、コプランジャーを用いて、リン酸緩衝生理食塩水で試料を室温で5分間予備洗浄します。次に、滅菌蒸留水で2回洗浄し、室温でエタノール系列を用いて各2分間脱水し、風乾させます。スライドが完全に浸っていることを確認し、グラファイトの粉末が表面に浮いてきた場合は、清潔なティッシュで吸い取ってください。位相差顕微鏡で観察し、円内における核の位置を記録します。次に、室温で100% ethanolを用いてサンプルを2分間脱水し、風乾させます。その後、プローブ混合液を2 µL滴下し、9 by 9 mmのカバーガラスで覆います。カバーガラスの縁をゴムセメントで封止します。コード化された自然化を行います。ヒートブロックを用い75 °Cで5分間加熱した後、各ハイブリダイゼーション容器を37 °Cの加湿チャンバーに入れ、一晩ハイブリダイゼーションさせます。0.4×SSC厳格洗浄液50 mLを71 °Cのウォーターバスで平衡化させます。厳格洗浄液のボトルと空のカップリングジャーをウォーターバスに入れ、室温から71 °Cまで加熱します。厳格洗浄液のpHを調整し、コチンジャーに分注します。次に、各スライドからラバーセメントを慎重に除去し、室温で4×SSC 0.05% Tween 20（pH 7）を用いてカバーガラスを洗浄します。サンプルを0.4倍SSC厳格洗浄液で71 °Cにて5分間洗浄し、続いて4倍SSC 0.05% Tween 20で室温にて2分間洗浄します。間接標識プローブを用いた場合は、スライド上の余剰液体を除去し、20 × 20 mmのパラフィルムで覆った状態で、蛍光標識抗体を20 µL添加します。加湿チャンバー内で37 °Cにて15分間インキュベートします。パラフィルムを取り除き、室温で以下の洗浄をそれぞれ2分間ずつ行います。まず、4×SSC 0.05% Tween 20で1回、次にPBSで2回洗浄します。スライドの液を切り、DPIを含むVector Shield封入剤6 µLを22 × 22 mmのカバースライドに塗布します。0番カバーガラスを使用し、スライドをカバーガラスの上に反転させて載せます。吸い取り紙で水分を除去し、カバーガラスの端を透明なマニキュアで封止します。最後に、蛍光顕微鏡を用いてサンプルを解析します。2名の独立した分析者が各核をスコア付けします。また、視覚的診断の確認およびラボの品質保証の一環としての画像アーカイブのため、イメージングソフトウェアを使用して核の画像をキャプチャします。ここでは、末梢血リンパ球から調製された中期分裂像および間期核により、染色体5番短腕（5p14.3）と9番短腕（9p24.1）の切断点を持つ相互転座のキャリアであることが示されています。FISHプローブにより、第9染色体の転座部位および中心節部位の両方のシグナルが可視化されます。培養3日目の胚盤胞核のインターフェース像をキャプチャし、それらを統合して合成画像を作成できます。各プローブに対して2つのシグナルが認められることは、各遺伝子座が2コピー存在することを示しており、これは正常または均衡型転座の補完性と一致します。転座染色体において、着色されたシグナルは、染色体5番の転座部位が1コピー、染色体9番の転座部位が3コピー、そして染色体9番の中心体部位が2コピーであることを示しています。このデータは、5p14.3から5ptまでのモノソミーおよび9p24.1から9ptまでのトリソミーという、不均衡な産物と一致しています。このビデオを視聴することで、ヒト胚から生検した単一細胞の解析方法と、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）法を用いた単一核の調製方法について十分に理解できるはずです。これは、胚の性染色体構成または転座状況を判定するための、再現性のある最適な検査結果を得るために重要です。

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Research

JoVE Journal

Medicine

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着床前遺伝子診断のためのFISH

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