クローン原性アッセイ：付着細胞
2011年3月13日
生殖可能性を評価するためのクローン原性アッセイの適用は50年以上のために設立されました。ここでは、接着細胞とクローン原性アッセイを行うための一般的な手順を示しています。
こんにちは、私の名前はラムで、現在、エピゲノム医学研究所の責任者であるトム・カリアン博士の監督の下、BE IDI Heart and Diabetes Instituteで博士号を取得しています。このビデオでは、Clon Genic Survival Assayと呼ばれる手順を実演します。これは50年前の技術であり、放射線や化学物質への曝露などのさまざまな治療が細胞の生殖生存率に与える影響を評価することができます。
コンジェニック生存アッセイは、さまざまな細胞株の放射線感度を評価し、さまざまな放射線防護化合物または放射線増感化合物の有効性をテストするための放射線生物学の中心的な技術です。A接着細胞株を使用する場合、極低温サバイバルアッセイは3つのフェーズで構成されています。まず、接着細胞の単層の処理。
第二に、単一細胞懸濁液の調製と既知の数の細胞および塗装皿のプレーティング、そして第三に、インキュベーション期間後に形成された染色、計数、およびコロニー。このビデオでは、不死化したヒトシノサイト細胞を使用して、ポリジーンバイブルアッセイを使用して天然の抗酸化物質のラジオプロテクト特性を決定する方法を示します。1225 Mフラスが事前に5ミルの培地に細胞の播種されているため、実験当日にはフラスコあたり100万個の細胞が存在します。
必要な濃度を達成するために、適切にラベル付けされた各フラスコ内の5ミルの培地に50マイクロリットルの薬物を異なる濃度で添加し、この場合はPBSである1つのビヒクル制御と同様に5つの濃度が使用されます。薬物を添加した後、インキュベーション後、使用する細胞株に適した条件で細胞を1時間インキュベートする。制御グループを除くフラックスは、選択された線量(この場合はガンマ線を放出するセシウム源によって生成された4グレイ)で照射されます。
照射後、培地を注ぎ出し、各フラスコを2ミルのPBSで5分間洗浄します。PBSを注ぎ落とした後、0.05%トリプシンの2ミルを各フラスコに加えて、フラスコからA接着細胞を分離します。次に、10%のウシ胎児血清を含むDMEMの下位5ミリリットルを各フラスコに追加して、トリプシンを不活性化します。
その後、fascの全内容物をラベル付きの10ミリリットルのファルコンチューブに移します。完成したら、これらのチューブを5分間遠心分離し、その後、回外器を口蓋を乱さずに慎重に廃棄し、5ミルのクレシー培地を各チューブに加えます。各サンプルの細胞濃度はENCで計算され、サンプルごとに5ミリリットルの培地を含む5つのシャーレに播種される細胞の最終濃度を達成するために必要な各サンプルの量も計算されます。
例えば、対照群では、1皿あたり100個の細胞が播種されるため、25ミリリットルあたり500個の細胞を達成するために必要な容量は、より濃縮されたサンプルに対して計算され、100マイクロリットル未満の容量を使用する場合に伴う誤差を最小限に抑えるために、10倍希釈または100倍の連続希釈を行います。これで、以前に計算された容量が、各サンプルごとに25ミリリットルの培地を含むFalconチューブに調製されます。サンプルは、以前にラベル付けされたプレ・トゥ・ディッシュに移すことができ、各ディッシュに5ミリリットルを追加して、取り扱いと輸送を容易にすることができます。
皿は、滅菌済みの大きな容器または消毒済みの容器に保管してください。その後、皿を適切な条件で加湿インキュベーターに入れ、8日間インキュベートします。8日後にケラチノサイトを使用する場合は、インキュベーターから皿を慎重に取り出し、ドラフト内に1つずつ並べます。
形成されたコロニーが邪魔されないように、その場所を優しく取り扱うように注意してください。蓋を取り外し、各皿に5mlの0.9%生理食塩水を加えて洗います。準備チップを皿の隅に向け、コロニーが誤ってこすり落とさないように、皿の底に触れないようにします。
5分後、生理食塩水を慎重に吸引します。現在、コロニーは4%フォーミュラの3ミリリットルで固定されており、蒸発を避けるためにリードを交換する必要があります。15分から30分後、フォーミュラは吸引され、適切に廃棄されます。
コロニーは0.1%クリスタルバイオレットで染色する準備ができており、各皿に5ミリリットルが追加され、30分から1時間後に蓋が交換されます。その後、染料を蒸留水で洗い流し、皿を反転させて一晩乾燥させます。これで、コロニーを数える準備が整いました。
コロニーは、解剖顕微鏡を使用して手動でカウントできます。50個以上の細胞を含む細胞のクラスターは、コロニーと見なされます。以上で、Congenic Survival Assayのデモンストレーションは終了です。
このアッセイが他の技術と比較した場合の主な利点は、非常に感度が高く、細胞死のログが6回も続いた後でも、広範囲で生存を検出できることです。これは、この感度は、より大きなセル数をめっきすることによって達成されます。このエッセイは、細胞毒性のテストなどのテストなど、他の目的に簡単に使用できます。
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概要
コロニー形成アッセイは、特にさまざまな処理に対する細胞の生殖能を評価するための確立された手法です。本記事では、付着細胞を用いてコロニー形成アッセイを行うための一般的な手順について概説します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 放射線生物学
- 生殖能評価
背景
- コロニー形成能試験は50年以上にわたって利用されてきました。
- この試験は、放射線照射や化学物質への曝露などの処理が細胞に及ぼす影響を評価するものです。
- この手法は、異なる細胞株における放射線感受性を評価する上で極めて重要です。
- また、放射線防護剤や放射線増感剤などの化合物の有効性を検証するのに役立ちます。
研究目的
- コロニー形成生存率測定法の操作手順を実演する。
- 放射線生物学における本手法の重要性を強調する。
- さまざまな処置に対する細胞応答に関する知見を提供する。
使用した手法
- 接着細胞単層の処理。
- 処理後の細胞増殖能の評価。
- 異なる細胞株における放射線感受性の評価。
- 放射線防護剤または増感剤の検討。
主な結果
- コロニー形成アッセイは、細胞の生殖能力を効果的に評価することができます。
- 処理内容の違いにより、細胞生存率に大きな影響が及ぶ可能性があります。
- 得られた結果は、放射線に対する防御戦略の開発に役立てることができます。
- この手順は、さまざまな接着性細胞株に適用可能です。
結論
- コロニー形成能アッセイは、細胞生物学において引き続き不可欠なツールである。
- この手法は、放射線や化学物質が細胞に及ぼす影響について重要な知見を提供する。
- 今後の研究では、この方法論を基盤として、細胞応答への理解をさらに深めることができる。
よくある質問
産業上の重要性
コロニー形成能アッセイは、放射線や細胞毒性剤への曝露後における細胞の生殖能を定量化するための基礎的なツールであり、初期段階の腫瘍学および放射線生物学のパイプラインに直接的な知見を提供します。その感度により、細胞生存に対する治療効果を堅牢に評価することができ、ターゲット検証やメカニズム解析におけるリスク低減に向けた予測的信頼性を裏付けることが可能です。本アッセイは、前臨床研究ポートフォリオにおける候補化合物や放射線修飾剤の重要なgo/no-go判断の根拠となります。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 遺伝学的、化学的、または放射線による摂動に対する細胞応答の定量的な解析を可能にします。
- 単一細胞レベルで細胞静止的効果と細胞毒性的効果を区別することにより、メカニズム的なリスク低減をサポートします。
- 細胞の生存および増殖に影響を与える標的候補やパスウェイの機能的な検証を提供します。
- 強力な抗増殖能または保護能を持つ化合物を特定することで、ポートフォリオの優先順位付けを容易にします。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 細胞株における化合物の有効性と放射線感受性を評価するための、検証済みで再現性のあるシステムを構築します。
- コロニー形成効率や生存率など、研究間での比較が可能な標準化された定量的出力を提供します。
- 治療効果の高感度な検出を可能にし、信頼性の高いスクリーニングおよび用量反応解析をサポートします。
- 下流のメカニズム解析やトランスレーショナル研究に向けた生物学的システムの準備を行います。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 腫瘍学および放射線防護研究におけるトランスレーショナルな連続性を確保するため、in vitroの生存データと前臨床モデルを整合させます。
- 臨床的に関連のある曝露条件下での予測的な生存率指標を提供し、リスク調整された化合物の開発推進を支援します。
- 生存率の結果を分子または表現型のエンドポイントと相関させることで、バイオマーカーの開発を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
コロニー形成能アッセイは、初期探索、リード化合物同定、および前臨床検証の接点に位置しており、腫瘍学および放射線生物学におけるメカニズム研究とトランスレーショナルリサーチを繋ぐ架け橋としての役割を果たしています。
- 探索生物学：候補となる介入策が細胞の増殖能に及ぼす影響を定量化し、パスウェイの関連性と生物学的リスクを明らかにします。
- スクリーニング：化合物のランキングおよび用量最適化に不可欠な、再現性のある定量的な生存データを提示します。
- 分析：生存率および播種効率を算出することで、異なる実験条件間での統計的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでの生存能をin vivoの結果と結びつけることで、前臨床モデルの選択およびバイオマーカーの整合性に寄与します。
- 組織的な再利用：多様な細胞株や治療法に適応可能な、標準化されスケールアップ可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：腫瘍学および放射線防護プログラムにおけるターゲットバリデーションとメカニズムの低リスク化に対する予測的信頼性を提供します。
- 運用の価値：R&Dチーム全体でのアッセイの標準化、再現性、および拡張性を確保します。
- 戦略的価値：情報に基づいたgo/no-go判断を可能にし、リソース配分を最適化して後期段階での脱落リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付け、ならびに候補化合物および介入策の推進をサポートします。
実施上の検討事項
- 細胞培養、コロニー定量、および生存データの統計解析に関する専門知識が必要です。
- 放射線照射装置、組織培養インフラ、および検証済みの染色・計数プロトコルへのアクセスが不可欠です。
- 再現性を確保するため、播種、インキュベーション、およびスコアリング手順のチーム間での標準化が必要です。
- さまざまな接着性細胞株に適応可能ですが、特定のモデルではプロトコルの最適化が必要な場合があります。
- スループットや手動での計数が、大規模な化合物ライブラリやハイコンテントスクリーニングにおける拡張性を制限する可能性があります。
