集束イオンビームは、粉砕し、脳組織の走査型電子顕微鏡

この手順の目的は、集束イオンビーム（FIB）および走査電子顕微鏡（SEM）を用いて、脳組織の特定領域の連続画像を収集することです。これは、まず脳をスライスして染色し、樹脂に包埋することで達成されます。次に、包埋された脳切片から目的領域を切り出し、空白の樹脂ブロックにマウントします。

第3ステップでは、ウルトラミクロトームで樹脂ブロックをトリミングし、顕微鏡のイオンビームを用いて、イメージングを行う領域のみを切り出します。最終ステップでは、イオンビームを用いて薄い層を繰り返し除去し、各画像の撮影前に樹脂ブロックの面を連続的にイメージングします。最終的に、関心領域を通過する連続画像を得ることができます。

画像シリーズは自動的に収集され、データセットは通常、等方性ボクセルを持つため、スタック内の画像構造をあらゆる角度から観察することができます。この手法の既存の方法（連続切片透過電子顕微鏡法など）に対する主な利点は、はるかに高いZ方向の分解能を達成できることです。また、電子トモグラフィーと比較して、樹脂埋め標本において最適な分解能でより大きな体積をイメージングすることが可能です。

まず、麻酔後、灌流固定したラットから脳を摘出します。温めた5% arosをプラスチック製モールドに入れ、脳を埋め込みます。arosが凝固する前に脳を適切な角度に調整し、脳を含むarosブロックをバイブラトームのサンプルホルダーに固定します。冠状断で80 micronの切片を作成し、目的の領域が含まれるまで必要な枚数の切片を切り出します。

次に、サンプルを20 milliliterのガラス製絶縁バイアルに入れます。1つのバイアルにつき最大10セクションまで入れることができます。0.1 molar K coateバッファーで、5分間ずつ3回、サンプルを洗浄してください。

次に、0.1 M K coate緩衝液を用いて、1.5%シアン化カリウムおよび1%四酸化オスミウムでサンプルを30分間染色します。続いて、0.1 M K coate緩衝液中の1%四酸化オスミウムでさらに30分間、サンプルの染色を継続します。その後、二回蒸留水で3分間1回すすぎ、二回蒸留水中の1%酢酸アルミニウムで30分間染色します。

次に、切片を2回蒸留水で5分間すすぎ、その後、段階的なアルコール系列で脱水させます。この際、各段階で2分間置きます。次のステップでは、アルコールと混合した濃度を段階的に上げたDuran樹脂で切片を包埋します。各段階の間は30分間置きます。まずエタノールと樹脂を50:50の割合で開始し、次に30:70、続いて10:90とし、最後に切片を100%樹脂に30分間浸します。

次に、培地を100%の新鮮なデュラン樹脂に交換します。ローラーミキサーを用いて1時間、ゆっくりと攪拌します。包埋後、木製のカクテルスティックを使用して、あらかじめ型離脱剤を塗布したガラス顕微鏡スライドに切片を配置します。

スライドに可能な限り多くの切片を載せますが、詰め込みすぎないように注意してください。また、顕微鏡スライドの間に識別ラベルを必ず挟んでください。スライドを65 °Cのオーブンに入れ、24時間放置します。

翌日、サンプルをオーブンから取り出します。カミソリの刃をガラス顕微鏡スライドの間に慎重に差し込み、樹脂層を指で保持しながら、サンプルを含む樹脂層をスライド間から取り出します。サンプルを流水で静かに洗浄します。

金型離型剤を除去するため、低倍率の対物レンズを用い、透過照明を備えた解剖顕微鏡下にサンプルを配置します。細い針を用いて、関心領域に印を付けます。カミソリを用いて、関心領域の周囲に3 mm × 3 mmの小さな正方形に切り出します。

アクリル接着剤を使用して、小さな樹脂ブロックをブランク樹脂ブロックの上部に貼り付けます。次に、ブロックをウルトラミクロトームのホルダーに固定します。装着された実体顕微鏡で観察しながら、関心領域の周囲をカミソリで削り、材料が小さなピラミッド状になるまでトリミングします。

ウルトラミクロトームに固定したガラスナイフを用い、ブロックの上面に対して角度をつけて、関心領域に近いエッジ部分をカットします。さらにブロックをトリミングし、ブロック表面の寸法に対して関心領域を正確に位置づけられるようにします。ブロックをウルトラミクロトームから取り外し、透過光顕微鏡の下に設置します。

関心領域を撮影します。ジュエリーソーを使用して、カーボンペイントを塗布した状態で、トリミング済みのブロックを残りの樹脂スタブから切り離します。切り出したSAオフブロックをSEM試料ホルダーに固定し、撮像したい面が最も外側のエッジに向くように配置します。

接着剤が乾燥した後、試料をクライオ転送および真空蒸着システムに移し、ブロックに20 nanometers以上の薄い金層をコーティングします。これで、樹脂埋入組織ブロックを集束イオンビーム走査電子顕微鏡で観察する準備が整いました。低倍率でサンプルをホルダーごと顕微鏡に挿入し、二次電子像を用いて、関心領域と観察したいブロックの面が向かい合うようにブロックの向きを調整します。

オペレーターは、撮像する面がミリングビームと平行になるようにブロックを向けます。これにより、イオンビーム電流13〜27 nano amps、加速電圧30 kilovoltsにおいて、電子ビームがこの面に対して54度の角度で方向付けられます。

イメージングを行う領域の前方から、樹脂を狭い帯状に除去します。次に、後方散乱電子イメージングモードに切り替え、目的領域の上に位置する Milling 面を観察します。あらかじめ撮影しておいた光学顕微鏡のリファレンス画像と Milling 面の画像を照らし合わせ、顕微鏡のガス注入システムを用いて、Milling およびイメージングを行うブロック上の正確な領域を特定します。

700 picoampsの電流を用い、関心領域上のブロック表面に、厚さ約1ミクロンのカーボンまたは金属の保護層を堆積させます。最後に、最終的な画像撮影を行うブロック内の領域をミリングします。画像撮影面にミリングのアーティファクトが見られなくなるまで、ミリングビームでこの面を完全にミリングしてください。

面（face）の連続イメージングのための顕微鏡パラメータを選択します。一般的なパラメータは、電圧が1.2〜2 kV、ピクセルサイズが4〜20 nmです。面のミリングと1枚の画像取得にかかる合計時間が2分未満になるよう、ピクセルドウェルタイムは約10 µsに設定してください。

温度変化を安定させるため、顕微鏡を少なくとも2時間静置します。その後、関心領域の連続画像を取得するために、ミリングおよびイメージングプロセスを開始します。この図は、ラップブレイン（wrap brain）内の領域における超微細構造を示す、ブロック面の逆コントラスト後方散乱電子像です。

すべての膜および巨大な高分子構造が可視化されています。この図は、5 nm間隔で収集された合計1,600枚の画像で構成されており、等方性ボクセルを持つ画像スタックとなっています。このスタックを用いることで、どの平面においても同一の解像度で結像させることが可能です。

このビデオを視聴することで、集束イオンビーム走査電子顕微鏡を用いた連続イメージングのための脳組織の調製方法について、十分に理解できたはずです。