Name: 集束イオンビームは、粉砕し、脳組織の走査型電子顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶ集束イオンビーム走査型電子顕微鏡を用いた脳組織の連続イメージング手法。樹脂包埋したラット脳の特定領域を高解像度で三次元可視化し、神経構造の詳細な解析を可能にします。

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1。サンプルの固定と樹脂の埋め込み<ol><li>新鮮な組織や細胞のサンプルを2％パラホルムアルデヒド中で少なくとも2時間固定し、pH7.4の0.1 Mリン酸緩衝液中2.5％グルタルアルデヒドされています。サンプルサイズが十分浸透または固定を可能にするために厚さ0.150ミリメートルを超えてはならない、と12時間以上の修正に配置したままにしないでください。 </li><li> 20ミリリットルのガラスシンチレーションバイアルにサンプルを配置し、それらに0.1Mカコジル酸緩衝液で3回、5分ごとに、すすいでください。 </li><li> 30分間、0.1Mカコジル酸緩衝液（0.1M、pH7.4）中1.5％（w / v）のフェロシアン化カリウムと1％（w / v）の四酸化オスミウムで染色。 </li><li> 30分間0.1Mカコジル酸緩衝液で1.0％（w / v）の四酸化オスミウムで染色。 </li><li> 3分間蒸留水で一度すすいでください。 </li><li> 30分間二重蒸留水の1％（w / v）の酢酸ウラニルで染色。 </li><li>段階的なアルコールのシリーズ、2分ごとに変化（1 × 50％、1 × 70％、1 × 90％、1 × 95％、2 × 100％）で脱水後、蒸留水で5分間のセクションをすすぎ、と。 </li><li> 70％、90％、95％、次いで100％エタノールで50％Durcupanから始まるエタノール混合Durcupan樹脂、それぞれの変更30分、濃度の増加に埋め込む、その後に続く。 </li><li>新鮮なDurcupanと交換し、4時間ゆっくり振とうする。 </li><li>場所のセクション、金型分離剤を塗布した、と65の場所ガラスの顕微鏡で、木製のカクテルの棒をスライドを使用して24時間℃のオーブン。 </li></ol> 2。 FIB / SEM用サンプルの準備<ol start="11"><li>二枚のガラスの顕微鏡スライドの間から、サンプルを含む、樹脂層を分離し、エージェントを分離し、任意の型を削除するには徹底的に洗ってください。 </li><li>低消費電力の目標に透過光顕微鏡を使用して、または樹脂のスライス内に​​関心領域を識別するために、透過照明で顕微鏡を解剖。 </li><li>カミソリの刃を使用して、関心領域の周りに小さな（3mm × 3mmの）正方形を切り取り、アクリル接着剤で空白樹脂ブロック（図1）の上部にこれを貼り付けます。硬化への接着のために5分待ってから、次のステップに進みます。 </li><li> ulramicrotomeのホルダーにブロックを固定し、付属の実体顕微鏡を用いて、物質の残物の唯一の小さなピラミッドまで、カミソリの刃で対象領域の周囲にトリム。 </li><li>さらに、関心領域を正確に基準にしてブロックの表面（図1）の寸法を配置できるように、ウルトラミクロトームに固定されたガラスナイフを使用して、ブロックをトリム。ブロックの一方の端をカット、垂直のステップはサンプル（図1および2）で切断されるように、関心領域に近い。このステップでは、画像面（図2）を形成する。 </li><li>透過光顕微鏡を用いて、ウルトラミクロトームと写真ブロック内の関心領域からブロックを削除します。 </li><li>残りの樹脂のスタブからトリミングされたブロックをカット。これは、宝石商の鋸を使用して行われ、唯一の小さなブロックがFIB / SEMの内部に配置されることが保証されている。このブロックの全体の高さは5mmを超えてはなりません。 </li><li>イメージを作成する側は、最も外側のエッジ（図1）にあることを確実にカーボンペーストをアルミスタブに接着剤がブロック。 </li><li>接着剤が乾燥した後、金の薄層（&gt; 20 nmの、クレッシントンの真空蒸着装置）でコーティングブロックを。 </li></ol> 3。 FIB / SEMのイメージング<ol start="20"><li>関心とブロックの側面の選択された領域が撮像されるように、低倍率で、そして二次電子を用いてイメージング（5kVの、0.5 NAMP）、オリエントブロックは演算子（図2のC、D）を直面している。 </li><li>オリエントは、顔を撮像するようにブロックが加工ビームと平行に位置しています。これは、電子ビームがこの面に54 °（図2 B）に配向していることを意味します。 </li><li> 13の現在のイオンビームを使用して - 30 kVで27 NAMPSは、撮像しようとする領域の前面から樹脂の狭いバンドを削除します。 </li><li>関心領域を覆う粉砕顔を表示するには、後方散乱イメージングモードに切り替えます。 </li><li> （図2）粉砕し、撮像されるブロックの正確な領域を見つける光顕微鏡の基準画像（ステップ16で撮影）と粉砕顔の画像を使用する。 </li><li>関心領域（図2）の上に、ブロックの表面に、顕微鏡のガス噴射システムを使用して、炭素（または金属）の保護層（約1ミクロンの厚さ）を、入金。 </li><li> 700ピコアンペア、細かく粉砕最後の画像が撮影される内のブロックの領域の現在の使用。 </li><li>はミリングアーティファクトが顔に見られないようになるまで完全に工場この画像の顔に加工ビームを残す。顔の完全な工場は、視野全体にわたって続く各画像の変化を観察することによってチェックされます。不十分な加工もverticaに現れる白い縞や"カーテン"として見ることができるLLYイメージに。 </li><li>放散させるためにどのような熱変化のための少なくとも2時間顕微鏡を残す。これはブロック面の位置がずれて画像になって、撮像中にドリフトするというリスクを軽減します。 </li><li>顔シリアルイメージングのための顕微鏡のパラメータを選択します。電子ビームは、ブロック面の材料の非常に浅い深さだけのイメージに十分に低い電圧を持っていることを確認してください。これも削除する顔の厚さよりもはるかに浅くする必要があります。 4の間のピクセルサイズを持っている2.0 kVの - - 20 nmのイメージングのための典型的なパラメータは、1.2との間の電圧です。ピクセルは、工場の顔をにして、1つのイメージを取得する総時間は（図3）2分未満に維持されるように、10μsecs周りに保持する時間のニーズに住む。 </li></ol> 4。成功の秘訣 ステップ1）のサンプルが150ミクロンより厚くはないことを確認します。これは、材料にさまざまな汚れや樹脂の十分な浸透が可能になります。これは、すぐに固定した後、ビブラトームで試料をセクショニングすることによって達成することができます。この厚さは、脳組織に適しています。他の組織は、適切な固定と染色を確保するためにテストする必要があります。 ステップ3）試料は、自由にソリューション全体に分布し、そしてこの二次固定剤が導入されている間バイアルの一部で一緒に凝集しないようにする必要があります。これは、サンプルの最大の浸透を確保し、この固定の過程で歪んになるサンプルが削減されます。これは、穏やかに解決策が追加された直後にバイアル内のサンプルを旋回することによって達成される。 ステップ15）関心領域は、（&lt;30ミクロン）のすぐ下のブロックの表面に配置されていることを確認してください。これにより、画像取得の段階でイオンビームによる加工量が削減されます。 ステップ22）イオンビームの走査時間は、全体像の顔が完全に粉砕されていることを確認するadequteにする必要があります。不十分な加工は、画像面に垂直に現れる白い縞、または"カーテン"として表示されます。 ステップ26）最後のミルドフェースは、画像化されている顔よりも大きい必要があります。粉砕された樹脂がすぐ近くにあるブロックの表面にブロックとredepositsから排出されるためです。この再堆積は、撮影視野に侵害することができる、とイメージされるよりもはるかに大きな面積を粉砕することによって回避される。 20ミクロン幅の画像ウィンドウでは、粉砕されたブロック面は、30ミクロン幅より大きいです。 ステップ29）これは、電子ビームのパラメータは画像がブロックの表面の唯一の最初の数ナノメートルから出てくる電子によって生成されるようになっていることが重要です。これは、以下の2 kVの電圧を最小限にしていない電子が離れすぎて浸透しないようにすることで、acheved。これはまた最も高いエネルギーを持つ唯一の電子は、最終イメージに貢献するように検出器のグリッド電圧を使用することによって助けられます。通常は、1.3 kVのグリッドの張力は、1.5 kVのイメージング電圧に使用されます。 5。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1樹脂ブロックの準備が。）樹脂はsteromicroscopeで表示成体ラットの脳の冠状断面（80ミクロン厚い）を埋め込 ​​まれた。画像は明らかにメス刃を用いて節（b）からカットすることができます別の脳領域を示しています。ここでは、皮質から1mmの正方形は削除され、（C）ブランク樹脂ブロックにスタックしています。D）樹脂ブロックは、ウルトラミクロトームに取り付けられたガラスナイフでトリミングされ、そして一度ブロックだけを残すために削減されています関心領域（E）、ステップが埋め込 ​​まれた材料の表面に対して垂直にカットされるが。f）この全体のトリミング領域は、その後に金属のコーティングとイメージングを処理する準備が樹脂の残りの部分から切断し、アルミニウムのスタブ上にマウントされています走査型電子顕微鏡。 <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。）。FIB / SEMイメージングのためのブロック面を準備し、b）のブロックと画像の顔を（黒双方向の矢印で示される）を作成するために粉砕され、エッジのイラストを表示。イオンビーム（ホワイト）の位置は、撮像面に平行に表示されており、電子ビーム（灰色）は、イオンビームに54 °で顔を打つ示されている。c）は電子ビームで撮影されたブロックのビューを示しています。と二次電子で撮像。ブロックのこの側面に沿ってより暗い領域（点線の白いボックスで示されている）ほぼ粉砕された顔の一部を示しています（ダブルヘッドで表示ED黒い矢印）が基本となるサンプルを明らかにする。d）この領域が埋組織を見ることができる唯一の反射電子を用いて画像化されている場合。ここでは、埋め込まれた組織切片の全幅は、二重頭の白い矢印で示されている。 cのスケールバー）は100ミクロンです。 <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。イメージング等方性ボクセルによる脳組織の容積。）ラットの脳の領域内の超微細構造を示すブロック面のコントラスト後方散乱画像を反転。すべての膜は、目に見えるだけでなく、大型の高分子構造です。B）1600の画像の合計は等方性ボクセルによる画像のスタックに、その結果が5nm間隔で収集された。c）このスタックは、同じ解像度を持つ任意の平面上に結像することができます。この画像は、xy平面、yz平面上に結像される単一のシナプス結合を示しています。

<ol><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li>
<li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope%3A+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li>
<li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

関心領域が大きすぎるではない場合FIB / SEMの手法は、最適に動作します。画像化されたボリュームの上限は、イオンビームとそれが多くの時間以上繰り返し圧延一貫してできる領域に依存する。今のところ、これが約60 × 60ミクロンの領域で行われている、しかし、画像はこの領域全体では、適切な画像解像度と大きな画像を収集する時間的要因が主な要因は不可能である。ピクセルと例4 KX 4 Kのイメージとして10マイクロ秒までの滞留時間を取得するには、2分40秒かかります、と60ミクロンの視野のために、これはわずか15ナノメートルのピクセルサイズを与えるだろう。イメージング、細胞と組織の超微細構造の場合は、小さい画素サイズがより適している;通常4〜10nmの/ピクセル間。 60 × 60ミクロンの領域のために画像は顕微鏡がこの能力を持っている場合でも、10時間で取得される。これらの理由から、顕微鏡で10 × 10 × 10ミクロン、または全細胞の有意な地域のために画像のボリュームに最適なツールです。これは簡単に、この手順でうまく対比されているサンプルに48時間の期間内に行うことができます。 これまでのプロトコルは、脳組織だけでなく、カバーガラスに付着している哺乳動物培養細胞の様々なタイプで主に使用されています。しかし、固定と染色の手順は同様に、コントラストの画像スタックを生成するために植物材料を含む生物学的材料の他の多くの種類、使用することができます。 したがって、この手法の主な利点は、等方性ボクセルによる画像のボリュームにその容量です。このタイプの画像のスタックは、スタック内の任意の平面で撮影した画像を使って3Dボリュームの分析が可能になります。これの利点は、あらゆる方向からの画像シリーズで、より大きなイメージの詳細（図3）を提供する画像の特徴にオブザーバをできるようにすることです。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡：ライカMZ8 </td><td>ライカマイクロシステムズ、ドイツ</td><td></td></tr><tr><td> Durcupan樹脂</td><td>シグマアルドリッチビックケミー社、スイス</td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM顕微鏡（Zeiss、主催による40） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス組織学スライド</td><td>メンツェル-グレイザー、ドイツ</td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td>ガラスナイフメーカー：ライカEM KMR2 </td><td>ライカマイクロシステムズ、ドイツ</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシンチレーションバイアル（20ml）を</td><td> EMS、米国</td><td> 72634 </td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td> EMS、米国</td><td> 16222 </td></tr><tr><td>宝石商ののこぎり</td><td> EMS、米国</td><td> 72010 </td></tr><tr><td>金型分離剤</td><td> Glorex、スイス</td><td> 62407445 </td></tr><tr><td>四酸化オスミウム</td><td> EMS、米国</td><td> 19110 </td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td> EMS、米国</td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td>リン酸緩衝液、リン酸塩</td><td>シグマアルドリッチビックケミー社、スイス</td><td> 71642と71496 </td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチビックケミー社、スイス</td><td> 20840 </td></tr><tr><td>金の対象とコーターをスパッタ</td><td>クレッシントン、米国</td><td></td></tr><tr><td>トリス塩基（TBS） </td><td>シグマアルドリッチビックケミー社、スイス</td><td> T1378 </td></tr><tr><td>ウルトラ：ライカUCT </td><td>ライカマイクロシステムズ、ドイツ</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td> EMS、米国</td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

集束イオンビームは、粉砕し、脳組織の走査型電子顕微鏡

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

このプロトコルは、どのように生物学的サンプルは、脳組織のように、集束イオンビーム/走査型電子顕微鏡（FIB / SEM）を用いて3次元でイメージングすることができますについて説明します。サンプルは、四酸化オスミウムと酢酸ウラニルを用いてアルデヒド類、重金属で染色して固定されています。そして、彼らはアルコールで脱水し、硬化される樹脂、で浸潤。光学顕微鏡とガラスナイフを持つウルトラミクロトームを用いて、表面に近い領域の関心を含む小さなブロックが行われます。ブロックが次にFIB / SEM、およびブロックの片側に沿ってほぼ工場の垂直面をするために使用されるイオンビーム内に配置され、この地域に近い。画像基本的な構造をして後方散乱電子を用いて、小さな顔は、細かいイオンビームで粉砕し、表面には、イメージングと粉砕される顔の正確な領域を決定するために、より密接に吟味されている。顕微鏡のパラメータは、シリアル画像がブロックのボリュームを介して収集されるように顔が繰り返し粉砕し、結像されるように設定されています。画像のスタックは通常、各方向に小さな4 nm程度の寸法と等方性ボクセルが含まれます。任意の撮像面でこの画質は、ユーザーが画像スタック内の任意の視野角でセルの超微細構造を分析することができます。

このプロトコルは、樹脂の埋め込み脳組織を走査型電子顕微鏡、集束イオンビームの3次元で準備し、画像化する方法について説明します。

本プロトコルでは、脳組織などの生物学的試料を、集束イオンビーム/走査電子顕微鏡を用いて三次元的にイメージングする方法について解説します。

この手順の目的は、集束イオンビーム（FIB）および走査電子顕微鏡（SEM）を用いて、脳組織の特定領域から連続画像を取得することです。まず、脳をスライスし、染色後に樹脂埋込を行います。次に、埋込後の脳切片から関心領域を切り出し、未記入の樹脂ブロックにマウントします。第3のステップは、ウルトラミクロトームで樹脂ブロックをトリミングし、顕微鏡のイオンビームを用いてイメージングを行う領域のみを切り出すことです。最終ステップでは、各画像の撮影前にイオンビームで薄い層を繰り返し除去し、樹脂ブロックの一面を連続的にイメージングします。最終的に、関心領域を貫く連続画像の結果を得ることができます。画像シリーズは自動的に収集され、データセットは通常等方性ボクセルを持つため、スタック内の画像構造をあらゆる角度から観察することができます。この手法の既存の手法（連続切片透過電子顕微鏡法など）に対する主な利点は、はるかに高いZ方向の分解能を達成できることです。また、電子トモグラフィーと比較して、樹脂埋め込み試料において最適な分解能でより大きな体積を画像化することが可能です。まず、麻酔下で灌流固定したラットから脳を摘出します。温めた5% aerosをプラスチック製のモールドに満たして脳を埋め込み、aerosが凝固する前に脳を適切な角度に調整します。脳を含むaerosブロックをビブラトームのサンプルホルダーに固定します。冠状面に沿って80 micronの厚さで切片を作成し、目的の領域が含まれるまで必要な枚数の切片を採取します。次に、サンプルを20 mLのガラス製絶縁バイアルに入れます。1つのバイアルあたり最大10セクションまで入れます。0.1 M K coate緩衝液で、5分間を1回として3回サンプルを洗浄します。次に、0.1 M K coate緩衝液中の1.5%シアン化カリウムおよび1%四酸化オスミウムで、サンプルを30分間染色します。続いて、0.1 M K coate緩衝液中の1%四酸化オスミウムで、さらに30分間サンプルの染色を継続します。その後、二重蒸留水で3分間、1回洗浄し、二重蒸留水中の1%al acetateで30分間染色します。次に、切片を2回蒸留水で5分間洗浄し、その後、段階的なアルコール系列で脱水します。この際、液を交換するたびに2分間置きます。次のステップは、アルコールと混合した濃度の異なるDuran樹脂に切片を包埋することです。各段階で30分間置きます。まずエタノールと樹脂の比率を50:50から開始し、次に30:70、続いて10:90とし、最後に100%樹脂に30分間浸漬させます。その後、培地を100%新鮮なduran resinに交換します。ローラーミキサーを用いて1時間、ゆっくりと撹拌します。包埋後、木製コクテルスティックを使用して、あらかじめ型離し剤をコーティングしたガラス顕微鏡スライドに切片を配置します。スライドに可能な限り多くの切片を載せますが、詰め込みすぎないように注意してください。また、顕微鏡スライドの間には識別ラベルを必ず配置してください。スライドを65 °Cのオーブンに24時間置いてください。翌日、オーブンからサンプルを取り出します。カミソリの刃をガラス顕微鏡スライドの間に慎重に差し込み、指で樹脂層を保持しながら、サンプルを含む樹脂層をスライド間から取り出します。流水でサンプルを静かに洗浄してください。金型離型剤を除去するために、透過照明を備えた実体顕微鏡の下にサンプルを置き、低倍率対物レンズで観察します。微細な針を用いて、関心領域に印を付けます。カミソリの刃を使用し、関心領域の周囲を3 mm × 3 mmの小さな正方形に切り出します。アクリル接着剤を使用して、小さな樹脂ブロックをブランク樹脂ブロックの上部に貼り付けます。次に、ブロックをウルトラミクロトームのホルダーに固定します。装着された実体顕微鏡で観察しながら、カミソリを用いて、関心領域のみが小さなピラミッド状に残るまで周囲をトリミングします。ウルトラミクロトームに固定したガラスナイフを用い、ブロックの上面に対して角度をつけて、目的領域に近いエッジ部分を切断します。さらにブロックをトリミングし、ブロック表面の寸法に対して目的領域を正確に位置決めできるようにします。ブロックをウルトラミクロトームから取り外し、透過光顕微鏡下に設置します。関心領域を撮影します。ジュエリーソーを使用して、トリミングしたブロックをカーボンペイントを塗布した残りの樹脂スタブから切り離します。切り出したSAブロックをSEMサンプルホルダーに固定し、撮影面が最も外側の端を向くように配置します。接着剤が乾燥した後、試料をクリスチャン・バキューム蒸着装置（crescent and vacuum evaporation system）に移し、ブロックに20 nanometers以上の金薄層をコーティングします。これで、樹脂包埋された組織ブロックを集束イオンビーム走査型電子顕微鏡（FIB-SEM）で観察する準備が整いました。試料ホルダーに入ったサンプルを低倍率で顕微鏡に導入し、二次電子像を用いて、関心領域と観察面が正面を向くようにブロックを方向付けます。オペレーターは、イメージングする面がミリングビームに平行になるようにブロックを配向させます。これにより、イオンビーム電流 13～27 nano amps、加速電圧 30 kilovolts の条件下で、電子ビームがこの面に対して54度の角度で配向されます。イメージングを行う領域の前方から、樹脂の狭い帯状の部分を除去します。次に、後方散乱電子イメージングモードに切り替え、関心領域の上にある切削面を確認します。先に撮影した光学顕微鏡のリファレンス画像と切削面の画像を用いて、顕微鏡のガス注入システムにより切削およびイメージングを行うブロック上の正確な領域を特定します。700 picoampsの電流を用いて、関心領域の上のブロック表面に、厚さ約1ミクロンのカーボンまたは金属の保護層を堆積させます。最後に、最終的な画像を取得するブロック領域をミリングします。表面にミリングによるアーティファクトが見えなくなるまで、ミリングビームでこの画像面を完全にミリングしてください。顔面の連続撮像のための顕微鏡パラメータを選択します。一般的なパラメータは、電圧が1.2から2 kV、ピクセルサイズが4から20 nmの間です。顔面のミリングと1枚の画像取得にかかる合計時間が2分以下になるよう、ピクセル滞在時間は約10 µsに設定してください。熱的な変化を安定させるため、顕微鏡を少なくとも2時間静置します。その後、ミリングおよびイメージングプロセスを開始し、関心領域の連続画像を取得します。この図は、ラップブレイン領域内の超微細構造を示すブロックフェイスの逆コントラスト反射電子像です。すべての膜に加えて、巨大な高分子構造も可視化されています。この図は、5 nmの間隔で収集された計1,600枚の画像で構成されており、等方性ボクセルを持つ画像スタックとなっています。このスタックを用いることで、どの平面においても同一の解像度で撮像することが可能です。このビデオを視聴することで、集束イオンビーム走査電子顕微鏡を用いた連続イメージングのために、どのように脳組織を調製するかについて十分に理解できたはずです。

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