光学的に透明な酸化インジウムスズ電極上にパターニングセル

こんにちは、私はイシャです。Dr.Zenの研究室の大学院2年生です。私たちはカリフォルニア大学デービス校の医用生体工学科にいます。

今日は、組織工学における微細加工された光学的に透明なインジウム10酸化物電極でのイアンの制御と、臓器の微小環境を模倣するための再生努力をお見せします。この微小環境を試験管内で作り出すためには、細胞を基板上に空間的・時間的に分離することが不可欠です。私たちは、さまざまな種類の肝細胞の位置を制御できる表面を設計することに興味があります。

今日の実験では、表面改質、微細加工、電気化学を使用して、細胞非接着性から細胞性接着剤に切り替えることができる表面を形成します。最初のステップはフォトリソグラフィーです。これは、そのプロセスがどのように機能するかのフロー図です。

青はガラスライト、緑はガラスライトの上にコーティングされた酸化インジウム10です。まず、ここで示すスピンコートフォトレジストレッドを、酸化インジウム10コーティングガラスライトの上に塗ります。次に、それをフォトマスクに通して紫外線に渡し、露光領域を現像液で展開します。

フォトレジストで保護されていないITO領域は、IT化で除去されます。そして最後に、残りのフォトレジストをすべてアセトンで除去して、ITO電極を形成します。残りの 3 つのステップのフロー図を次に示します。

まず、ペグシリンダーで表面全体を変更します。これにより、表面が汚れなくなり、細胞やタンパク質が結合しなくなります。次に、電気化学を使用して、前に作成したI 2つの電極からペグシリンを特異的に吸収します。

そして最後に、表面の上で線維芽細胞をインキュベートし、それらはストリップ領域にのみ選択的に結合します。さて、いよいよ実験を始める準備が整いました。最初のステップは、クリーンルームで実施されるフォトリソグラフィーです。

それでは、さっそくクリーンルームに入っていきましょう。だから今、私たちはクリーンルームにいます。実験を始める前に、酸化インジウムスズまたはITOコーティングされたサンプルをオーブンで200°Cで焼きます。

そうすれば、すべての表面を脱水することができます。そして、200°Cで焼いた後、スピンテックに置き、実際にフォトレジストを塗布します。そこで、ITO基板を脱水した後、スピンテックのチャックに載

このチャックは、ガラスライトの4分の1を保持するのに十分な大きさです。次に、真空を適用します。その後、基板上にポジトーン、フォトレジストを塗布します。

フォトレジストを塗布した後、先に進んで開始します。これには 2 つの手順があります。1つ目は広がり、2つ目は広がりステップのスピンコーティングです。

チャックは800RPMで回転し、フォトレジストを全面に均一に広げます。しかし、次はスピンステップで、これは4, 000 RPNで、4, 000 RPMで、非常に薄い層を形成します。細いというのは、約1ミクロンのことです。

写真、レジストという言葉を分割すると、写真に変わってレジストします。光によって活性化されます。したがって、私たちはクリーンルームで作業し、フィルターされた光を使用して、フォトドアレジストが光によって活性化されず、後でエッチングを行うときに使用する資産に耐性があります。

さて、スピンコーティング、表面のフォトレジストが完成したので、それを取り出して次のステップに進みます。そこで、サンプルを1分45秒間焼いた後、ホットプレートから取り出し、キャノンマスクライナーに移します。ここでは、必要なマスクを取り、ポートレジストを使用した基板とマスクとの間に接触印刷を行うために、マスクを基板の上に置き、重量を追加するために4インチのガラスウェーハを配置します。

それが終わったら、シャッターを再びオンにして、サンプルをUVライトにさらします。露光が完了したら、逆の順序で蓋を離します。ガラスウエハースを取り出し、マスクを取り出し、基板を取り出して開発に持ち込みます。

サンプルを公開した後、開発者ソリューションに配置します。サンプルに紫外線を当てると、水素イオンの形ができ、それがベースと現像液で中和され、実際に表面から除去されます。ですから、サンプルを採取する際には、常に基板を回転させていることを確認する必要があります。

そうすると、最初の1分から1分半ほどで、露出した領域が実際に発生し、表面から除去されていることがわかります。しかし、完全な開発を行うには、開発者ソリューションに約 5 分間置いたままにします。開発が完了したら、それを取り出し、洗って水で拭き、窒素ガンで乾燥させます。

サンプルを乾燥させたら、それを引き継いで顕微鏡で視覚化します。ここでは、顕微鏡でサンプルを見ています。5分間の現像後、取り出しました。

ここには、フォトレジストで覆われた暗い領域と、フォトレジストが除去された明るい領域の2つの領域があります。先ほど使用したマスクに関連して、マスクの暗い領域は、顕微鏡で今見ている暗い領域でしたが、ここで見える透明な領域はマスク上で透明でした。ここに示されている設計の 1 つは、500 ミクロンから 50 ミクロンまでのさまざまなサイズの配列ですが、もう 1 つの設計は、相互接続された 1000 ミクロンの円です。

したがって、ここには、同じ手順を使用して作成された別のデザインがあります。ここでは、個別にアドレス指定可能な電極があります。つまり、ITOの異なる領域は相互に関連しており、異なる方法で活性化できるということです。

たとえば、ここでは、中央の円形領域は、ここでは1つの電気パッドに接続されていますが、最も外側の長方形の領域は、別の電気パッドに接続されています。このようにして、これら2つの異なる表面を異なる時点で刺激することができます。サンプルを見た後、次のステップに進むのは、サンプルをエッチングすることです。

写真で保護されていない領域は、ITOエッチングでエッチングされます。その前に、ITOエッチングには酸が含まれているため、適切な衣服を着用する必要があります。そして今、酸防護ガウンに着替え、フェイスシールドを装着した後、ガラスビーカーにITOエッチングを注ぎます。

ITOエッチングは、塩化水素20%、硝酸5%で構成され、残りは脱イオン水です。そして、サンプルを持ってきてエッチングに入れます。顕微鏡の前半で、フォトレイズによって保護されていない領域がいくつかあることがわかりました。

ITOエッチング中の酸がこれらの領域を攻撃し、その領域からのITOをエッチングしました。ITOは表面からゆっくりと劣化するにつれて、色が変わります。ここでは、もともと青みがかった変化からこの紫がかった変化に変化し、現在は黄色の交換に移行していることがわかります。

色の変化は、ITOがエッチングされていることを示しています。さて、今では15分です。すべてのITOは、完全にエッチングされています。

そして、今あなたが見ているのは、写真が保護されているITO領域です。そのため、エッチングが完了した後も、表面にはまだ酸が残っています。これらの酸を取り除くために、炭酸ナトリウム溶液に入れ、すべての酸を中和します。

酸を中和した後、それを取り出してDI水で洗浄し、窒素が終わった状態で乾燥させます。これで、酸エッチングは完了です。もう酸はなく、熱いガウンを脱ぎ捨てました。

それを取り出して転送し、顕微鏡で視覚化します。そこで、顕微鏡でサンプルを観察しています。ITOエッチングを行った後です。

この場合、暗い領域は、ITOがエッチングされたガラス領域です。そして、明るい領域は、この場合フォトレジストで保護されているITOです。繰り返しになりますが、これらは500〜50ミクロンの配列であり、他のケースでは、それぞれ1000ミクロンの相互接続された円があります。

そこで、顕微鏡で見てみると、ガラス領域とITO領域があることがわかりましたが、ITO領域はフォトレジストで保護されていました。次に、このフォトレジストを取り出す必要があります。ですから、私たちがやろうとしていることは、私たちの基質を取り、それをアセトンに入れ、これを超音波処理剤に入れて、10分間超音波処理することです。

これにより、すべての光抵抗が取り除かれ、それ自体でトーンとして使用できますが、音波を使用してヒットし、フォトレジストが正しく除去されることを確実にする音波打撃によって使用できます。音波の空気から取り出した後、DI水で洗浄し、再度窒素で乾燥させると、ガラス基板に模様がはっきりと見えるようになります。これらは、フォトレジストによって最初に保護されていたパターンでした。

サンプルを見て、ITOパターンを見つけたり作成したりしたので、実験の第2フェーズを開始します。この段階では、PEGサイクリンの自己組織化単分子膜による表面の修飾が含まれます。しかし、その前に、表面が反応性であることを確認する必要があります。

そのために、プラズマクリーナーに入れます。これにより、表面にヒドロキシル基が導入され、反応性になります。そのためには、サンプルをプラズマクリーナーに入れてから、真空ポンプの電源を入れます。

酸素を入れ、主電源を入れます。この電力は、酸素ガスをプラズマに変換するために使用され、プラズマが導入されて水酸基溝を形成します。そして、電源を入れたら、先に進んでスタートを押します。

したがって、プロセスが完了した後、基板を取り出して皿に保管し、クリーンルームの外に向かいます de ガウン 次のステップに進みます。クリーンルームを出て理想的なパターニングを終えたので、ポリエチレングリコール、CYLIN、またはPEGシリンでパターニングしたばかりの表面を変更します。ペグシリンは湿気に反応することを知っておくことが重要です。

したがって、私たちが使用する木材はすべて湿気フリーでなければなりません。ここで使用したガラス製品、ペットディッシュは、100°Cで一晩焼き上げました。また、溶剤として使用するタンも無水です。

水分は含まれていません。そこで、今度は無水トルをこの2つのガラススピーカーに注ぎます。そのうちの1つにはサンプルが入っています。次に、2つのシャーレを使用する必要がありますが、これはそのうちの1つが変更を行う場所であるためです。

そしてもう1つは、後で修正が終わったときに、実際に基板を洗浄するために使用します。だから、ガラスのピザ皿に入れた後、それを引き継いで、グローブボックスの中のエアロックチャンバーに移します。エアロックチャンバーを閉じた後、チャンバーに窒素を導入します。

現在、ここのメインチャンバーはすでに窒素で満たされています。したがって、窒素で満たされていない限り、このチャンバーを開けたくありません。両方のチャンバーが窒素になったら、ピペットと一緒にすべてのサンプルを移します。

ペグとピンセットを用意し、後でサンプルを移すために使用します。そこで、手袋をはめ、ここでチャンバーを開けて、エアロックにあるものをすべてゆっくりと慎重に取り出し、メインチャンバーに置きます。これは、基板が入ったペトリ皿と、洗浄に使用するトルエンだけのペトリ皿です。

存在するpxiは窒素下で包装されており、窒素の環境にいない限り、このボトルを開けないでください。したがって、サンプルを取り出したいときは、バッグに戻します。つまり、シリンを取り出して、使用する濃度はトルエンの2%です。

だから、取り出して、背の高いところに入れて、混ぜます。また、チャンバー内でよく混合されていることを確認してから、サンプルをToinで2時間インキュベートします。2時間が経過した今、サンプルはPxiにあるので、サンプルを取り出して新しいトーイン溶液に移し、そこで簡単に洗浄し、回転させて、エアロックチャンバーに移します。

エアロックチャンバーに入ったら、チャンバーを開けて改造された表面を取り出し、窒素ガンを使用して運転できます。それを再び清潔で乾燥したペトリ皿に入れ、さらに2時間100°Cのオーブンに入れます。さて、サンプルを100°Cのオーブンで2時間焼き上げたので、準備した電極にワイヤーを取り付けます。

これは、銀エポキシと硬化剤の1対1の混合物を作ることによって行われます。これが銀エポキシであり、今度は同じ量の硬化物を加えます。私たちはそれをよく混ぜたいので、これを使ってワイヤーを取り付けます。

そこで、使用したい電極にワイヤーを配置し、それをコーディングします。ITOでははんだ付けができないため、銀エポキシと硬化剤を使用する必要があります。そして、先ほど使った硬化剤を全て取り除いて固め、電極として使えるように焼きます。

さて、2つのフェーズを終えたので、実験の3番目のフェーズ、つまり電気化学の部分を開始します。そのために、サンプルを採取し、電気化学セルに入れます。それを電気化学セルに入れた後、その上にOリングを置きます。

これにより、電気化学が発生する領域が分離され、その後、セルを密閉します。そこで、ワイヤーを電気化学セルに取り付けた状態でサンプルを配置しました。これで、ポテンシャル統計を使用して電圧を印加する準備が整いました。

そこで、白い線をここで参照電極に取り付け、赤い線、対電極、そして最後に緑色の線を作用電極に取り付けます。これらすべての電極を取り付けたら、電気化学自体にリン酸リン酸緩衝液生理食塩水またはPBSの1x溶液を追加するだけです。これを明確にするために、それが機能する方法は、現在のところ、表面全体がpxiで変更されています。

したがって、周囲のガラス領域を含むすべての電極は、pxiで変更されます。ITOが存在するすべての場所に電圧を印加すると、これは私たちが行った電極設計ですが、ペグアイランドはそれらの表面からのみ外れ、周辺領域には何も影響しません。したがって、基板からペグアイランドを選択的に除去します。

そこで、再生ボタンを押すと、再生が始まり、作用電極にマイナス1.4ボルトの電圧が印加されます。電圧が印加されると、電極に見える色の変化があります。透明感のある緑がかった青みがかった色から、茶色に変わっています。

茶色に変色しているのではないかと疑っています。これは、表面からの pxi が実際に表面から剥がされたことを示す指標の 1 つでもあります。そしてもう一度、茶色が見えるところはどこでも、ペグ島が取り除かれた場所です。

また、周囲のガラス領域には、まだPXIが組み立てられています。したがって、マイナス1.4ワットの電圧を60秒間印加します。これにより、電極上に存在していたすべてのpxiを取り外すのに十分な時間が与えられます。

また、この方法を使用して、個別にアドレス指定された電極をストリッピングすることもできます。この場合、ストリップされる円の 3 行がありました。3つの異なる電極すべてを使用して、何を、どのものを剥がすかを選択できます。

これで、電気化学の第3部であるITO電極からPGサイリングを選択的に除去することに成功しました。PBSとDI水で短時間洗浄し、ワイヤーを取り外して、サンプルを通常の6ウェルプレートに入れました。次に、これらの電極上のOnと培養細胞を移動します。

さて、今、私たちは組織培養室にいます。実験の最終段階では、今日は線維芽細胞、3つのT細胞、3つの細胞を使用します。細胞の播種に使用する濃度は、1ミルあたり0.5〜150万個の細胞です。

細胞を播種した後、細胞をサンプルに約20分間置きます。これにより、ストリップされた領域にアタッチするのに十分な時間を確保できます。だから、インキュベーターに入れます。

さて、20分が経ち、ITOの剥がれた領域、つまり先ほど見た茶色の領域にパターン化された細胞を見る準備ができました。これらの細胞は、それらの領域にのみ特異的に結合し、それらの領域の外側のどこにも付着しません。ここでは、茶色の領域が PXI が取り除かれた ITO 領域であることがわかります。電気化学を用いることにより、細胞はこれらの茶色の領域にのみ付着し、周囲のガラス領域には付着していません。

この別のフレームでは、再び、セルツがストリップされた領域にアタッチされているのがわかります。これらは茶色の領域ですが、その茶色の領域の上にはほとんど見えず、ITO設計PEGはこのITO設計から取り除かれていないため、細胞は付着していません。さて、これで完了です。

プロトコルが完了し、細胞はITO電極にパターンがあり、それはまさに私たちが望んでいたことです。私はちょうどあなたにマイクロ加工された光学的に透明なインジウム10酸化物電極上の細胞接着の制御を示しました。今日は、これらの電極でTHREETの3つの線維芽細胞をパターン化する方法を紹介しました。

また、Hep Gの2つの細胞、サテライト細胞、およびラット初代細胞をパターン化するためにも同じ手順を使用しました。現在の細胞パターニング技術では、表面上に2種類の細胞を組み立てることしかできません。この手法の柔軟性により、将来的には空間的に分離された複数の細胞タイプを表面上に組み立てることができます。

この技術を用いて、ITO基板上に3種類の異なる肝細胞を空間的に分離し、in vivoの微小環境を模倣する予定です。これにより、成熟細胞や支持細胞とともに、未成熟細胞や幹細胞を空間的に隔離することができます。これにより、未成熟細胞が成長し分化するための有益な環境が作り出されます。