光学的に透明な酸化インジウムスズ電極上にパターニングセル

こんにちは、イシャです。Zen博士の研究室の大学院2年生です。私たちはカリフォルニア大学デービス校の生物医学工学科にいます。

本日は、組織工学および再生医療において臓器の微小環境を模倣する試みの中で、微細加工された光学的に透明な酸化インジウム錫（Indium 10 oxide）電極上でのイオン制御について解説します。この微小環境をインビトロで構築するためには、基板上で細胞を空間的および時間的に分離することが不可欠です。私たちは、異なる肝細胞型の配置を制御できる表面の設計に関心を寄せています。

本日の実験では、表面修飾、微細加工、および電気化学を用いて、細胞非接着性から細胞接着性へと切り替え可能な表面を形成します。最初のステップはフォトリソグラフィです。ここでは、そのプロセスの流れを示すフローチャートを提示します。

青色はガラス基板であり、緑色はガラス基板の上にコーティングされた酸化インジウム錫（ITO）です。まず、ここに示されているフォトレジストを、酸化インジウム錫がコーティングされたガラス基板の上にスピンコートします。次に、フォトマスクを介して紫外線を照射し、露光領域を現像液で現像します。

フォトレジストで保護されていないITO領域は、エッチングによって除去されます。その後、最後に、残っているすべてのフォトレジストをアセトンで除去することで、ITO電極が形成されます。以下は、残りの3つのステップを示すフローチャートです。

まず、表面全体をPEG-シリンで修飾します。これにより表面が非特異的吸着防止となり、細胞やタンパク質が結合しなくなります。次に、電気化学的手法を用いて、先に作製した2つの電極からPEG-シリンを選択的に脱離させます。

最後に、表面に線維芽細胞を播種してインキュベートします。すると、細胞はストリップ領域にのみ選択的に結合します。これで、実験を開始する準備が整いました。最初のステップはフォトリソグラフィーであり、これはクリーンルーム内で行われます。

それでは、クリーンルームに入りましょう。現在、クリーンルーム内にいます。実験を開始する前に、酸化インジウムスズ（ITO）コーティング済みの試料をオーブンで 200 °C で加熱処理します。

これにより、すべての表面を脱水することができます。200 °Cでベイクした後、スピンコーターに設置して、実際にフォトレジストを塗布します。ITO基板の脱水後、それをスピンコーターのチャックに固定します。

このチャックは、ガラスライトの4分の1を保持するのにちょうど良い大きさです。次に真空を印加します。その後、基板上にポジ型フォトレジストを塗布します。

フォトレジストの塗布後、そのまま工程を開始します。これには、まず塗布（スプレッディング）を行い、次にスピンコートを行うという2つのステップがあります。

チャックを800 RPMで回転させることで、フォトレジストが表面全体に均一に塗布されます。次にスピン工程があり、ここでは4,000 RPMで回転させることで、非常に薄い層を形成します。ここでの「薄い」とは、約1 micronのことを指します。

photo-resistという言葉を分解すると、「photo（光）」と「resist（耐性・抵抗）」になります。これは光によって活性化されます。そのため、クリーンルーム内でフィルタリングされた光を使用することで、フォトレジストが不用意に活性化されるのを防いでいます。また、この物質は酸などの化学物質に対する耐性を持っており、その特性は後のエッチング工程で利用されます。

スピンコーティングが完了し、表面にフォトレジストが塗布されましたので、これを取り出して次のステップに進みます。サンプルを1分45秒間ベイクした後、ホットプレートから取り出し、キャノン製マスクアライナーに移します。ここで必要なマスクを用意し、基板の上に配置します。フォトレジストを塗布した基板とマスクを密着させてコンタクトプリントを行うため、その上に4インチのガラスウェハーを置いて重しにします。

それが完了したら、シャッターを元に戻し、サンプルにUV光を照射します。照射が完了したら、逆の手順で蓋を取り除きます。ガラスウェハを取り出し、マスクを取り除き、それから基板を取り出して現像工程へと移します。

サンプルの露光後、現像液に浸します。サンプルがUV光に露光されると水素イオンが生成され、これが塩基である現像液によって中和され、表面から除去されます。したがって、サンプルの処理中は基板を絶えず揺らし続けるようにしてください。

そうすると、最初の1分から1分半ほどで、露光された領域が実際に現像され、表面から除去されるのが分かります。ただし、完全に現像させるために、現像液に約5分間浸しておきます。現像が完了したら、取り出してDIウォーターで洗浄し、窒素ガンを用いて乾燥させます。

サンプルの乾燥後、顕微鏡を用いて観察を行います。ここでは、5分間の現像処理を終えて取り出したばかりのサンプルを顕微鏡で観察しています。

ここでは2つの領域を確認できます。フォトレジストで覆われた暗い領域と、フォトレジストが除去された明るい領域です。先ほど使用したマスクとの関係では、マスク上の暗い領域が、現在顕微鏡下で見えている暗い領域に相当し、ここに見える明るい領域は、マスク上で透明だった部分に相当します。ここに示されているデザインの一つは、500 µmから50 µmまでサイズが異なるアレイであり、もう一方のデザインは、相互に接続された1000 µmの円形パターンです。

ここでは、同じ手順を用いて作製された別の設計を示します。ここにあるのは、個別にアドレス指定可能な電極です。これは、ITOの異なる領域が相互に接続されており、それぞれを個別に活性化できることを意味しています。

例えばここでは、中央の円形領域はこの電気パッドに接続されており、一方で最も外側の長方形領域は別の電気パッドに接続されています。このようにして、これら2つの異なる表面を異なる時点で刺激することができます。サンプルの確認後、次のステップとしてサンプルのエッチングを行います。

写真によって保護されていない領域は、ITOエッチングによって除去されます。その前に、ITOエッチング液には酸が含まれているため、適切な保護衣を着用しているか確認する必要があります。耐酸性のガウンを着用し、フェイスシールドを装着した状態で、ガラスビーカーにITOエッチング液を注ぎます。

ITOエッチング液は、20%の塩化水素、5%の硝酸、および残りの脱イオン水で構成されています。次に、サンプルを持ってきてエッチング液に入れます。先ほど顕微鏡で確認した通り、フォトレジストで保護されていない領域がいくつか存在していました。

ITOエッチングに使用した酸がそれらの領域を攻撃し、その領域のITOがエッチングされ除去されました。ITOは表面から徐々に分解されるにつれて、色が変化します。ここでは、元々あった青みがかった色から紫がかった色に変化し、現在は黄色への変化へと移行していることがわかります。

色の変化は、ITOがエッチングされて除去されていることを示しています。さて、15分が経過しました。ITOはすべて完全にエッチングされました。

現在ご覧いただいている写真は、保護されたITO領域です。エッチング完了後、表面にはまだ酸が残っています。これらの酸を除去するため、炭酸ナトリウム溶液に浸し、すべての酸を中和させます。

酸を中和した後、取り出してDI waterで洗浄し、窒素で乾燥させます。これで酸エッチングは完了です。酸はもう使用しないため、耐熱ガウンを脱ぎます。

サンプルを取り出して転送し、顕微鏡下で観察します。現在、顕微鏡でサンプルを観察しています。これはITOエッチングを行った後の状態です。

このケースにおいて、色が濃い領域はITOがエッチングされて除去されたガラス領域です。そして、色が明るい領域は、この場合フォトレジストによって保護されたITOです。ここでも、これらは500 µmから50 µmまでのアレイであり、もう一方のケースでは、それぞれ1000 µmの相互接続された円形パターンとなっています。

顕微鏡で観察したところ、ガラス領域とITO領域があることが確認でき、ITO領域はフォトレジストによって保護されていました。次に、このフォトレジストを除去する必要があります。基板をアセトンに入れ、それを超音波洗浄機に設置し、10分間超音波処理を行います。

これにより、すべてのフォトレジストが除去されます。洗浄にはトナーのみを使用することも可能ですが、音波を用いて衝撃を与える超音波洗浄を行うことで、フォトレジストを確実に除去できます。超音波洗浄後、DIウォーターで洗浄し、窒素ガスで再度乾燥させると、ガラス基板上にパターンが明確に現れます。これらが、当初フォトレジストによって保護されていたパターンです。

サンプルを確認し、ITOパターンの検出または作製が完了しましたので、実験の第2段階に移行します。この段階では、PEGシクリンの自己組織化単分子層を用いて表面修飾を行います。ただし、その前に表面に反応性があることを確認する必要があります。

そのために、サンプルをプラズマクリーナーに入れます。これにより表面にヒドロキシ基が導入され、反応性が高まります。具体的には、サンプルをプラズマクリーナーにセットし、真空ポンプを起動します。

酸素を供給し、メイン電源を入れます。この電力を用いて酸素ガスをプラズマに変換し、それを導入することでヒドロキシル溝を形成します。電源を入れた後、「スタート」ボタンを押します。

プロセスが完了したら、基板を取り出してディッシュに保管し、クリーンルームから出てガウンを脱ぎ、次のステップに進みます。クリーンルームを出て、理想的なパターニングが完了したところで、今パターニングした表面をポリエチレングリコールシラン、すなわちPEGシランで修飾します。PEGシランは水分に反応しやすいという点に注意することが重要です。

したがって、使用する木製器具はすべて水分を取り除いた状態でなければなりません。ここで使用しているガラス器具やペトリ皿は、100 °Cで一晩焼成しています。また、溶媒として使用するトルエンも脱水物を使用します。

水分は含まれていません。そこで、サンプルが入った方の容器を含む2つのガラスビーカーに、脱水トルエンを注ぎます。修飾を行うための容器が必要なため、ペトリ皿を2枚使用します。

そして、もう一方は、修飾が完了した後に実際に基材を洗浄するために後で使用します。ガラス製のピザ皿に入れた後、こちらへ移動させ、グローブボックス内のエアロックチャンバーに移します。エアロックチャンバーを閉じた後、チャンバー内に窒素を導入します。

現在、こちらのメインチャンバーはすでに窒素で満たされています。したがって、窒素で満たされていない限り、このチャンバーを開けてはいけません。両方のチャンバーが窒素で満たされたら、ピペットを使用してすべてのサンプルを移送します。

後でサンプルの移行に使用するペグとピンセットを用意します。それでは、手袋を着用し、チャンバーを開け、エアロック内にあるものをすべてゆっくりと慎重に取り出してメインチャンバー内に配置します。こちらは基材を入れたシャーレと、洗浄に使用するトルエンのみを入れたシャーレです。

提供されているpxiは窒素封入されており、窒素環境下にない限り、このボトルを開封しないでください。したがって、サンプルを取り出す際は、すぐにバッグの中に戻してください。シリンダーを取り出し、使用する濃度はトルエン中で2%とします。

取り出したものをトールインに入れ、混合します。また、チャンバーを用いて十分に混合されたことを確認し、サンプルをトールイン中で2時間インキュベートします。2時間が経過し、サンプルがPxiに浸漬されたので、サンプルを取り出して新しいトールイン溶液に移し、短時間洗浄して軽くすすいだ後、エアロックチャンバーへ移動させます。

エアロックチャンバー内に入った後、チャンバーを開いて修飾表面を取り出し、窒素ガンを用いて乾燥させます。これを再び清潔で乾燥したペトリ皿に入れ、100 °Cのオーブンでさらに2時間加熱します。サンプルを100 °Cのオーブンで2時間焼成させたので、準備しておいた電極にワイヤーを取り付けます。

銀エポキシと硬化剤を1対1の割合で混合して作成します。これが銀エポキシで、ここに同量の硬化剤を加えます。十分に混ぜ合わせ、これを配線の固定に使用します。

使用する電極上にワイヤーを配置し、固定します。ITOにははんだ付けができないため、銀エポキシと硬化剤を使用する必要があります。その後、焼成を行うことで、先に使用した硬化剤を除去して硬化させ、電極として使用できるようにします。

2つのフェーズが終了しましたので、実験の第3フェーズである電気化学測定を開始します。まず、サンプルを取り出して電気化学セルに設置します。電気化学セルに設置した後、その上にOリングを配置します。

これにより、電気化学反応が起こる領域が隔離され、その後セルを密封します。このようにして、ワイヤーを取り付けたサンプルを電気化学セルに配置しました。これで、ポテンショスタットを用いて電圧を印加する準備が整いました。

したがって、白いワイヤーをここに参照電極に、赤いワイヤーを対極に、そして最後に緑色のワイヤーを作用電極に取り付けます。すべての電極を取り付けたら、電解槽に1xのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を加えます。ここで明確にしておきますが、現時点では表面全体がpxiで修飾されています。

したがって、周囲のガラス領域を含むすべての電極がpxiで修飾されます。電圧を全体に印加すると、電極として設計したITOが存在する領域のみからPEGアイランドが剥離し、周囲の領域には影響が出ません。これにより、基材から選択的にPEGアイランドを除去することができます。

それでは、再生ボタンを押して、作用電極に-1.4 Vの電圧を印加します。電圧が印加されると、電極上の色が変化するのがわかります。もともとは透明感のある緑がかった青色でしたが、茶色に変化します。

電極で酸化反応が起こり、それが原因で電極が茶色に変化していると考えられます。これは、表面からpxiが実際に剥離したことを示す指標の一つでもあります。繰り返しになりますが、茶色くなっている部分は、PEGアイランドが除去された箇所です。

また、周囲のガラス領域にはまだPXIがアセンブルされたままです。そこで、-1.4 Vの電圧を60秒間印加します。これにより、電極上に存在していたすべてのPXIを除去するのに十分な時間が確保されます。

この方法は、個別にアドレス指定された電極の剥離にも適用可能です。今回の例では、剥離対象として3列の円形電極があります。3種類の異なる電極を使い分けることで、どの電極を剥離させるかを選択できます。

これで、ITO電極からPGシランを選択的に除去するという、電気化学の第3パートを無事に完了しました。PBSと超純水で短時間洗浄し、ワイヤーを取り除いた後、サンプルを通常の6ウェルプレートに配置しました。次に、これらの電極上で細胞を培養します。

現在は組織培養室にいます。実験の最終段階では、本日は線維芽細胞である3T3細胞を使用します。細胞を播種する際に使用する濃度は、1mLあたり0.5〜1.5×10⁶個の範囲とします。

細胞を播種した後、サンプル上で約20分間静置します。これにより、ストリップ領域に細胞が十分に付着します。その後、インキュベーターに入れます。

20分が経過し、ITOのストリップ領域、つまり先に確認した茶色の領域にパターニングされた細胞を観察する準備が整いました。細胞はこれらの領域にのみ特異的に結合し、それ以外の場所には付着しません。ここで、茶色の領域はpxiが除去されたITO領域であることがわかります。電気化学的手法を用いることで、細胞は周囲のガラス領域ではなく、これらの茶色の領域にのみ付着しています。

別のフレームでは、再び、剥離された領域に細胞が付着しているのが分かります。それらが褐色の領域ですが、それらの褐色の領域の上方にあるITOデザインのPEGは剥離されていないため、そこには細胞が付着していません。以上です。

プロトコルは以上です。ITO電極上に細胞がパターン形成されており、まさに期待通りの結果となりました。ここでは、微細加工された光学的に透明な酸化インジウム（ITO）電極上での細胞接着の制御について説明しました。本日は、これらの電極上に3つの線維芽細胞をパターン形成する方法を紹介しました。

また、我々はこの同一の手順を用いて、Hep G two細胞、サテライト細胞、およびラット初代細胞のパターニングを行いました。現在の細胞パターニング技術では、表面上に2種類の細胞をアセンブリすることしかできません。本技術の柔軟性により、将来的には、空間的に隔離された複数の細胞タイプを表面上にアセンブリすることが可能になります。

本手法を用いて、ITO基板上に3種類の異なる肝細胞を空間的に単離し、生体内の微小環境を模倣することを計画しています。これにより、未熟細胞や幹細胞を、成熟細胞および支持細胞と共に空間的に単離することが可能になります。これにより、未熟細胞が成長および分化するための誘導環境を構築できます。