共鳴と自発ラマン顕微の蛍光バックグラウンドの除去

我々は、蛍光信号からのラマン分離する超高速全光スイッチングを使用する複雑な非線形光学系の構築と運用について説明します。このシステムを用いて、我々は、正常にパルスエネルギーと生物学的に安全なままに平均電力を利用したラマン及び蛍光信号を分離することができます。

この手順の目的は、蛍光シグナルを拒絶しながらラマン散乱光を通過させる全光学歩行を構築することです。これは、最初にラマン散乱を励起して偏光することで達成されます。手順の2番目のステップは、ゲートを操作するためのポンプビームを準備することです。

第三に、ポンプとラムとパルスが重なるように調整する必要があります。手順の最後のステップは、時間依存性スペクトルを取得することです。最終的には、S/N比が高いラーメンシグナルの分析を通じて、生化学的定量化と分類を示す結果を得ることができます。

この手法は、ソフトウェアによる蛍光バックグラウンドの除去など、既存の方法と比較した場合の主な利点として、蛍光によって生成されるショットノイズが大幅に低減される点です。この方法は、細菌の細胞や組織における内因性蛍光の化学組成の非侵襲的な特性評価、内因性マーカーを使用したがん、血管、神経変性疾患などの細胞プロセスや疾患の理解など、生物学および生物医学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、蛍光標識とRAM標識の両方として、また血液分析用の非侵襲的医療センサーに使用できる新しいプローブの開発にも役立つ可能性があります。

しかし、この方法は、生物医学工学のための生物学的システムへの洞察を提供することができます。また、バイオ燃料、研究、通信業界などの他の分野にも適用できます。生物学的サンプルは通常、ATO Fluor細胞チャンバーに取り付けられた厚さ1番のカバースリップに入れられます。

液体サンプル、特に人体に有毒なものは、シリコンエポキシによって開口部にセメントで固定されたカバースリップを備えた小さなガラス瓶に入れられ、その後、測定のために反転させられ、顕微鏡ステージの上部に取り付けられた二次ステージにサンプルを配置します。 まず、励起ビームを適切に準備する必要があります。まず、2.4ワットのチューナブルパルスGIサファイアレーザーから出る光から始めます。80メガヘルツのパルス列の各パルスは、エネルギーの30ナノジュール、140フェムト秒の時間幅と808ナノメートルを中心としたスペクトルを持つ必要があります レーザー共振器に再入射するのを防ぐために、光はファラデーアイソレータの場所、ファラデーアイソレータの前の半波長板を通過して、に送られた総電力の連続的なチューニングを可能にする必要があります制。

6ナノメートルではほとんどのラーメンモードを解決するには帯域幅が広すぎるため、ビームは非常に狭いバンドパスフィルターを介して送信されます。808ナノメートルで送信します。次に、芳香族ダブレットを使用して、5mmのベータバリウムボアに光を集中させます。

808ナノメートルから404ナノメートルまでの波長の半分に8つの結晶。ベータバリウムベイト結晶をマウントに置き、先端と傾きのコントロールを平行移動ステージに取り付けます。波長変換の効率を最大化するには、結晶をダブレットの焦点に対して正確に対称に配置し、その結晶軸を入射ビームの偏光に揃える必要があります。

波長変換の効率は偏光に依存するため、ファラデーアイソレータの後に2番目の半波長板を配置することで、サンプルに送られる光の量を制御することができます。この波長板を回転させることで、ポンプビームで送られる光の強さとは無関係に、試料に送られる光の強度を調整することができます。次に、波長変換された光は、励起ビームが顕微鏡対物レンズの後部開口部を満たすのに十分な大きさになるように選択された第2の芳香族ダブレットによって再コリメートされ、2つのステアリングミラーによって倒立顕微鏡に向けられます。

顕微鏡対物レンズは、励起ビームをこの軸に整列させるための光軸を定義します。顕微鏡のサンプル平面にミラーを置きます。その後、2つのステアリングミラーは、顕微鏡のイメージングポートに取り付けられたCCDカメラで後方反射レーザービームを観察しながら、繰り返し調整されます。

カメラ上の画像が顕微鏡の視野の中心にあると仮定すると、ビームは軸上にあります。焦点が顕微鏡チップの中心にあり、Z軸に沿った対物レンズの並進は変化しません。デフォーカスビームラーメン散乱の中心点は、試料を試料平面に置き、レーザー光を照射することで発生します。

顕微鏡の対物レンズの下に配置されたダイクロイックフィルターは、シフトした波を分離します。ラーメン散乱光を顕微鏡のサイドポートに向ける励起ビームからのラーメン散乱光。顕微鏡は、この経路内のレンズを取り外すように変更されており、顕微鏡から出る信号ビームがグランドの明確な開口部よりも大きいため、コーティングされた顕微鏡から信号光が出現します。

トンプソン偏光子は、2つの芳香族ダブレットで構成された0.47倍望遠鏡で、ビームを縮小するために使用されます。次に、信号光は、ラボフレーム内で垂直に対して0度に向けられたグランドトンプソン偏光子によって偏光され、ダイクロイックミラーに向けられ、そこでポンプビームと再結合されます。ポンプビームは、互いに直角に2つのミラーで構成された遅延線に送られ、両方ともポンプパルスと信号パルスの時間的重なりを確保するように調整できる線形変換ステージ上に配置されます。

遅延材の後、ビームはハーフウェイプレートと偏光子を通って、ラボフレームの垂直に対して45度に向けられます。これにより、ポンプビームが非線形媒体に到達したときのポンプビームの適切な偏光状態が保証されます。次に、光は2つのステアリングミラー(1つは圧電制御付き)で反射され、最終的にポンプビームの位置を調整して信号ビームと空間的に重なるようにする必要があります。

この重なりを得るためには、第1のステアリングミラーを用いて近点で2つのビームを重ね合わせ、ピゾミラーを用いて遠点でビームを重ね合わせることにより、ビームが合体するダイクロイックミラーから近接する場所と遠い位置の2つの位置でポンプビームと信号ビームを観測し、ポンプビームを信号ビームと正確に同一視することができる。次に、波形と収集システムを設定して、収集した時間ゲート信号を最大化する必要があります。これを行うには、まず、ポンプビームと信号ビームを404ナノメートルでOD6のDIICフィルターに通し、残留励起光が非線形媒体内で励起および散乱するのを防ぎます。

次いで、ポンプビームおよび信号ビームは、芳香族ダブレットによって、非線形材料を含む1センチメートルの経路長の石英sベテに集束され、適度に高い非線形指数および適度に短い時間応答を有する任意の非線形材料を利用することができる。ここは。これらの実験では、硫化炭素を使用します。次に、光は、最初のダブレットと同じ焦点距離を持つ2番目のダブレットによって再コリメートされます。

次に、ビームは回転マウント上のグランドトンプソンアナライザーを通過し、次に808ナノメートルでODが10になる吸収フィルターと干渉フィルターのセットを通過します。最後に、信号光は、芳香族ダブレットによって50ミクロンのマルチモード光ファイバーに集束され、ここで、ファイバーはX、Y、およびZでの並進を可能にするステージに取り付けられます。次に、ファイバーはCCDカメラが取り付けられた商用イメージング分光器に結合され、収集された信号を最大化するために収集システムを調整します。 アナライザーを0度に設定し、トルエンのテストサンプルをサンプル平面に配置し、ファイバーマウントのX、Y、Z制御を調整して収集したラマン信号を最適化し、ポンプビームと信号ビームの適切な空間的および時間的オーバーラップを確保します。顕微鏡のサンプル平面にミラーを置きます。

次に、404ナノメートルフィルターをシステムから取り外します。アナライザーを90度回転させて、レトロ反射された404ナノメートルビームがカメラを飽和させないように強度を調整して分光器に送られるようにします。次に、ポンプビームをオフにして、アナライザーを回転させて、送信される404ナノメートルの信号を最小限に抑えます。

次に、ポンプビームを再びオンにし、404ナノメートルの光の透過率が増加し始めるまで遅延ステージをゆっくりと調整します。次に、遅延ステージ、圧電ミラー、およびファイバーのX、y、Z制御を繰り返し回転させて、逆反射404ナノメートルビームとラマン散乱光がシステム内をわずかに異なる経路をたどる可能性があるため、信号を最大化します。トルエンなどの強力なラマンスキャトラをサンプルステージに配置し、ラマンフィルターを交換し、遅延ステージのピゾエレクトリックミラーを変更することでアライメントを微調整し、ファイバーのX、Y、Zコントロールでラマン信号を最適化することで最終調整を行います。

これで、システムはスペクトルを収集する準備が整いました。これには、まず、システムアーティファクトを補正するために、いくつかのバックグラウンドカーブを取得する必要があります。まず、アナライザーを0度に設定すると、励起ビームがオンになり、ポンプビームがオフになります。

未結合のスペクトルを取得し、アナライザーを 90 度に設定して、偏光子から漏れる迷光を表す背景スペクトルを収集します。次に、アナライザーを90度にしたまま、ラーメンビームをオフにし、ポンプビームをオンにします。ダイクロイック フィルターから漏れるポンプ光の量を表す 2 番目の背景スペクトルを収集します。

最後に、すべてのレーザーをオフにして、カメラと電子機器の暗電流レベルを表すベースラインのダークスペクトルを収集します。最後に、すべてのビームをオンにして、ゲートスペクトルを収集します。ゲートを通過する光だけの真のスペクトルを取得するには、このゲート付きスペクトルから 2 つの背景スペクトルとダーク スペクトルを差し引く必要があります。

ここでは、波形システムの概略図を示します。ポンプビームの経路は赤い実線で示され、SHGの経路は紺の実線で示されています。ラーメンと蛍光が重なる経路は緑色で示されています。

一方、蛍光が一時的にろ過された経路は黄色で示されています。ここでは、浸漬油に溶解したクマリンの生のスペクトルを示します。赤い曲線はゲートを開いたままにした状態で取得したスペクトルを示し、黒い曲線はアナライザを最小伝送用に位置合わせし、ポンプビームを適用したスペクトルを示しています。

青色の曲線は、アナライザを最小伝送に位置合わせし、ポンプビームを適用しなかった場合のスペクトルを示し、緑色の曲線は、ポンプビームのみを適用したスペクトルを示しています。すべてのスペクトルは、11ポイントの3次KYゴールフィルターで滑らかになっています。マゼンタの破線は、次のグラフに示すスペクトル領域を示しています。

ここでは、蛍光バックグラウンド減算後に液浸油に溶解したクマリンのスペクトルを示します。赤い曲線はゲートが開いたままのスペクトルで、青い曲線はゲート付きスペクトルです。ゲートスペクトルは、複雑な高波数、オイルのピーク特性を明確に示しています。

この手順を試みる際には、レーザーが最初にGAを駆動するのに十分なパルスエネルギーを持っている必要があり、システムでは2つのパルスの絶妙な空間的および時間的重なりが必要であることを覚えておくことが重要です。このビデオを見て、添付のプロトコルを読んだ後、レーザービームを励起ビームとカーブビームに分離する方法を十分に理解しているはずです。これら 2 つのビームを空間的および時間的に重ね合わせる方法。

スペクトログラフとC、c、Dでラーメンの信号を記録する方法、またラーメンの信号を可視化して解析する方法。レーザーでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を試みるときは常にレーザーゴーグルを着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。非線形材料の使用と特定のサンプルの使用には、追加の安全規則が適用されます。