共鳴と自発ラマン顕微の蛍光バックグラウンドの除去

本手順の目的は、蛍光信号を排除しつつラマン散乱光を透過させる全光学的ゲートを構築することです。これは、まずラマン散乱を励起し偏光させることで実現します。手順の第2ステップでは、ゲートを動作させるためのポンプ光を準備します。

第三に、ポンプ光、ラム光、およびパルスが重なり合うように調整する必要があります。手順の最終ステップは、タイムゲート分光スペクトルを取得することです。最終的に、高い信号対雑音比を持つラマン信号の解析を通じて、生化学的な定量および分類を示す結果を得ることができます。

蛍光背景のソフトウェア的な除去などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、蛍光によって生じるショットノイズを大幅に低減できることです。この手法は、細菌細胞や組織における内因性蛍光物質の化学組成の非侵襲的な特性評価や、固有のマーカーを用いた細胞プロセスおよび癌、血管疾患、神経変性疾患などの疾患の理解といった、生物学および生物医学分野における重要な課題の解決に寄与します。また、本手法は、蛍光ラベルとRAMラベルの両方として使用可能な新しいプローブの開発や、血液分析用の非侵襲的医療センサーの開発にも役立つ可能性があります。

この手法は、生体医学工学における生物学的システムの洞察を得るために有用ですが、バイオ燃料研究や電気通信業界などの他の分野にも応用可能です。一般的に、生物学的試料はATO Fluorセルチャンバーに取り付けられた厚さ1番のカバースリップ上に配置されます。

液体サンプル、特に人体に毒性のあるものは、小型のガラス瓶に入れ、開口部をシリコンエポキシでカバーガラスで密封し、測定のために倒立させます。タイムゲート・ラマン分光測定を行うため、サンプルを顕微鏡ステージ上部に搭載された、独立したフォーカス制御機能を備えたセカンダリステージに配置します。まず、励起ビームを適切に準備する必要があります。2.4 Wの波長可変パルスGIサファイアレーザーから出射される光を用います。80 MHzのパルス列の各パルスは、エネルギー30 nJ、パルス幅140 fs、中心波長808 nm、スペクトル帯域幅約6 nmである必要があります。後方反射光がレーザー共振器に再入射するのを防ぐため、光をファラデーアイソレータに通します。システムに導入される総出力を連続的に調整できるよう、ファラデーアイソレータの前に半波長板を配置してください。

6 nmという帯域幅ではほとんどのラマンモードを分解するには広すぎるため、ビームを非常に狭いバンドパスフィルターに通します。波長を808 nmに設定してください。次に、アクロマティックダブレットを用いて、光を5 mmのベータホウ酸バリウム（BBO）結晶に集光させます。

波長を808 nanometersから404 nanometersへ半分に変換するために、結晶を1つ使用します。ベータホウ酸バリウム（BBO）結晶を、翻訳ステージに取り付けられたチップおよびチルト制御付きのマウントに設置します。波長変換の効率を最大にするには、結晶をダブレットの焦点に対して正確に左右対称に配置し、結晶軸を入射ビームの偏光方向に合わせる必要があります。

波長変換の効率は偏光に依存するため、ファラデーアイソレーターの後に2枚目の半波長板を配置することで、試料に送られる光量を制御することが可能です。この波長板を回転させることにより、ポンプ光の強度とは独立して、試料に送られる光の強度を調整できます。その後、波長変換された光は2枚目のアクロマティックダブレットによって再コリメートされます。このダブレットは、励起ビームが顕微鏡対物レンズの後方開口を満たすのに十分な大きさになるように選択され、2枚のステアリングミラーを介して倒立顕微鏡へと導入されます。

顕微鏡対物レンズが光軸を定義するため、励起ビームをこの軸に合わせます。顕微鏡の試料面にかがみを設置します。次に、顕微鏡のイメージングポートに取り付けられたCCDカメラで後方反射したレーザービームを観察しながら、2枚のステアリングミラーを繰り返し調整します。

カメラ上の画像が顕微鏡の視野の中央にあると仮定すると、ビームは光軸上にあります。焦点スポットが顕微鏡チップの中央に位置し、対物レンズのZ軸方向の移動によって変化しないとき。サンプルがサンプル平面に配置され、レーザー光で照射されると、デフォーカスビームのラマン散乱の中心点が発生します。

顕微鏡対物レンズの下に配置されたダイクロイックフィルターが、波長シフトしたラマン散乱光を励起光から分離し、ラマン散乱光を顕微鏡のサイドポートへと導きます。この光路上のレンズはすべて取り除かれるよう顕微鏡が改造されており、顕微鏡から出射される信号光のビーム径がグランドの有効口径よりも大きくなるため、信号光は顕微鏡からそのまま出射されます。

ビームを絞るために、2つの芳香族ダブレットで構成された0.47倍の望遠鏡とThompson偏光子を使用します。次に、信号光は、ラボ座標系の垂直方向に対して0度に設定されたグランド付きThompson偏光子によって偏光され、ダイクロイックミラーに向けられてポンプビームと再結合されます。ポンプビームは、互いに直角に配置された2枚のミラーからなる遅延線に送られます。これらのミラーは線形変換ステージ上に配置されており、ポンプパルスと信号パルスが時間的に重なるように調整することが可能です。

遅延線を経た後、ビームはラボ座標系の垂直方向に対して45度の角度に設定された半波長板および偏光子を通過します。これにより、ポンプビームが非線形媒質に到達した際に適切な偏光状態となることが保証されます。その後、光は2枚のステアリングミラーで反射されます。そのうちの1枚にはピエゾ制御が備わっており、これを用いてポンプビームの位置を最終調整し、シグナルビームと空間的に重ね合わせます。

このオーバーラップを得るためには、ポンプ光とシグナル光を、ダイクロイックミラーの近傍と遠方の2箇所で観察します。まず、1枚目のステアリングミラーを使用して近傍点で2つのビームを重ね合わせ、次にピエゾミラーを使用して遠方点でビームを重ね合わせることで、ポンプ光をシグナル光と正確に同軸上に配置できます。次に、収集されるタイムゲート信号を最大化するように、コリゲートおよび収集システムをセットアップします。そのために、ポンプ光とシグナル光を、まず404 nanometersでOD 6のダイクロイックフィルターに通し、残留励起光が非線形媒体内で励起および散乱するのを防ぎます。

次に、ポンプ光とシグナル光をアクロマティックダブレットで集光し、非線形材料を封入した光路長1 cmの石英セルに入射させます。非線形屈折率が十分に高く、時間応答が十分に短い非線形材料であれば、どのような材料でも利用可能です。本実験では、二硫化炭素を使用します。その後、1つ目と同等の焦点距離を持つ2つ目のダブレットを用いて、光を再びコリメートします。

次に、ビームを回転マウントに取り付けたグラン・トンプソン解析器に通し、さらに合計で808 nanometersにおいてOD 10の吸収フィルタおよび干渉フィルタセットに通します。最後に、信号光をアクロマート・ダブレットで集光し、X、Y、Z方向への移動が可能なステージに設置された50 micronのマルチモード光ファイバーに導入します。その後、ファイバーをCCDカメラ付きの市販のイメージング分光計に結合させ、収集システムを調整して収集信号を最大化します。解析器を0度に設定し、試料面にトルエンのテストサンプルを配置して、ファイバーマウントのX、Y、Zコントロールを調整し、ポンプ光と信号光の空間的および時間的な重なりを適切に確保することで、収集されるラマン信号を最適化します。顕微鏡の試料面にミラーを配置します。

次に、システムから404 nanometerフィルタを取り除きます。アナライザーを90度に回転させ、後方反射された404 nanometerビームが分光計に送られるようにし、カメラが飽和しないように強度を調整します。ここでポンプビームをオフにした状態で、透過する404 nanometer信号が最小になるようにアナライザーを回転させます。

その後、ポンプ光のビームを再びオンにし、404 nanometerの光の透過率が上昇し始めるまで、遅延ステージをゆっくりと調整します。次に、後方反射された404 nanometerのビームとラマン散乱光はシステム内でわずかに異なる経路を通る可能性があるため、遅延ステージ、ピエゾミラー、およびファイバーのX、Y、Zコントロールを繰り返し調整して、信号を最大化します。最後に、トルエンなどの強力なラマン散乱体をサンプルステージに置き、ラマンフィルターを交換した後、遅延ステージ、ピエゾミラー、およびファイバーのX、Y、Zコントロールを変更してアライメントを微調整し、ラマン信号を最適化します。

これで、スペクトルを収集する準備が整いました。まず、システムのアーティファクトを補正するために、いくつかのバックグラウンド曲線を測定する必要があります。最初に、アナライザーを0度に設定し、励起ビームをオン、ポンプビームをオフにします。

ゲートなしでスペクトルを取得し、次にアナライザーを90度に設定して、偏光子を透過して漏れる迷光を表すバックグラウンドスペクトルを収集します。次に、アナライザーを90度のままにして、ラマンビームをオフにし、ポンプビームをオンにします。ダイクロイックフィルターを透過して漏れるポンプ光の量を表す2つ目のバックグラウンドスペクトルを収集します。

最後に、すべてのレーザーをオフにし、カメラと電子回路の暗電流レベルを示すベースラインのダークスペクトルを収集します。最後に、すべてのビームをオンにして、ゲートスペクトルを収集します。ゲートを通過した光のみの真のスペクトルを得るには、このゲートスペクトルから2つのバックグラウンドスペクトルとダークスペクトルを差し引く必要があります。

ここでは、波形加工システムの概略図を示しています。ポンプ光の光路は赤の実線で、SHGの光路は紺色の実線で示されています。ラマン散乱と蛍光が重なり合う光路は緑色で示されています。

一方、蛍光が一時的にフィルタリングされた経路は黄色で示されています。ここでは、浸漬油に溶解したクマリンの未処理スペクトルを示します。赤色の曲線はゲートを開いた状態で取得したスペクトルを、黒色の曲線はアナライザーを最小透過率に合わせポンプ光を照射して取得したスペクトルを示しています。

青色の曲線は、アナライザーを最小透過率に調整し、ポンプ光を照射せずに測定したスペクトルを示しており、緑色の曲線は、ポンプ光のみを照射して測定したスペクトルを示しています。すべてのスペクトルは、11点の3次Savitzky-Golayフィルターを用いて平滑化されています。マゼンタ色の破線は、次のグラフに示されるスペクトル領域を表しています。

ここでは、蛍光背景除去後の浸漬油に溶解したクマリンのスペクトルを示します。赤色の曲線はゲートを開いた状態でのスペクトルであり、青色の曲線はゲートをかけた状態のスペクトルです。ゲート後のスペクトルには、オイルに特徴的な高波数領域の畳み込みピークが明確に現れています。

この手順を行う際は、まずレーザーにgaを駆動させるのに十分なパルスエネルギーがあること、およびシステムに2つのパルスの極めて精密な空間的・時間的重なりが必要であることを忘れないことが重要です。このビデオを視聴し、添付のプロトコルを読むことで、レーザービームを励起ビームとカーブビームに分離する方法、およびこれら2つのビームを空間的および時間的に重なり合わせる方法について十分に理解できるはずです。

分光計およびC、c、Dを用いてラマン信号を記録する方法、ならびにラマン信号を可視化し解析する方法について説明します。レーザーの使用は極めて危険であるため、本手順を試みる際は常にレーザーゴーグルの着用などの予防策を講じてください。非線形材料の使用および特定の試料の使用に関しては、追加の安全規則が適用されます。