の識別のための1.5時間の手順腸球菌種

この手順の全体的な目的は、ペプチド核酸（PNA）蛍光in situハイブリダイゼーションを用いて、陽性血培ボトルからEnterococcus属種を迅速に特定することです。血培の調製およびグラム染色によるEnterococci培養の存在確認後、サンプルをPNA-FISH顕微鏡スライドに固定します。その後、スライドを目的の微生物に特異的なPNAプローブとともにインキュベートします。

プローブのハイブリダイゼーション後、厳格な洗浄を行い、ハイブリダイズしていない過剰なプローブを除去します。スライドに封入剤を加え、カバーガラスで封止します。サンプル中に存在するエンテロコッカス属種は、蛍光顕微鏡により同定することが可能です。

このPNA-FISH同定プロトコルは、敗血症からのEnterococcusを迅速かつ特異的に同定するための独自の手法を提供します。患者の血液培養検体として、敗血症が疑われる患者から採取した静脈血を含む好気性および嫌気性の血液培養ボトル各1本を、自動血液培養装置を用いて35 °Cで培養します。装置が微生物の増殖を検知した時点でボトルを取り出し、血液培養ボトルを穏やかに回転させて細菌を均一に再懸濁させます。

次に、滅菌済みの注射器と針を用いて、各ボトルから約5 mLの血液を、それぞれ別のスクリューキャップチューブに無菌的に分注します。すべての検体の分注が完了したら、滅菌ピペットを使用して、各チューブから血液1滴をそれぞれ別のガラス製顕微鏡スライドに滴下します。スライドを約15分間、風乾させます。

スライドが完全に乾燥した後、スライドをメタノールに浸してサンプルを固定します。スライドの固定後、それらを洗浄し、標準的なグラム染色の手順に従って、各血液培養液中に存在する微生物の形態を判定します。染色したスライドを、油浸対物レンズを備えた顕微鏡で観察してください。

血液培養液を添加すると、通常、ペアまたは短い連鎖状に集まったグラム陽性球菌が現れます。固定液を1滴、pおよび魚類用顕微鏡スライドのウェルに入れます。検査対象となる血液培養チューブを静かに混ぜ合わせます。

次に、10 µLの培養液を固定液の滴上に移し、ピペッティングしてサンプルを乳化させます。スライドを55 °Cのホットプレートで20分間加熱し、各テストの塗抹標本を固定します。アッセイの品質評価のため、必ず陽性対照および陰性対照のスライドを含めてください。

カルスコントロールスライドは、Van DX社から購入するか、参照株を用いて調製します。塗抹標本の準備が整ったら、血液培養サンプルを含むウェル、および陽性・陰性コントロールウェルに、EFIカルスO-E-P-N-Aを1滴ずつ点適します。プローブ原液の汚染を防ぐため、ドロッパーボトルの先端が血液塗抹標本に触れないように注意してください。

気泡が入らないように注意しながら、サンプルの上にカバーガラスを載せます。次に、スライドを加熱ブロックに入れ、55 °Cで30分間インキュベートします。インキュベート後、PNAをハイブリダイズさせるために、スライドをスライドキャリアに設置します。

試料を載せたスライドキャリアを、55 °Cに予熱した洗浄液が入った染色皿に浸します。バッファー中でスライドを攪拌するか、またはピンセットを使用してカバーガラスをそっと外し、試料上の過剰なPNAを除去します。スライドを洗浄液中で55 °Cで30分間インキュベートします。

次に、染色皿からスライドを取り出し、自然乾燥させます。スライドが乾いたら、室温の封入剤を1滴滴下し、サンプルの上にカバーガラスを慎重に載せます。調製後2時間以内に、デュアルバンドフィルターを用いて蛍光顕微鏡でスライドを観察してください。

この方法を用いることで、左側に緑色で示されている iffy、callous を、赤色の eum と区別することができます。一番右側の中央パネルは陰性の結果です。良好な結果を得るために留意すべき3つの点のうちの1つは、装置の温度を設定温度に維持しなければならないことです。

パッケージの添付文書に記載されている染色手順に厳密に従ってください。そして最後に、経験豊富で、スライドを詳細に読影できる読影者が不可欠です。本プロトコルは、Enterococcusによる敗血症の治療に向けた治療方針の決定に有用です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。