Name: の識別のための1.5時間の手順腸球菌種 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-10T20:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: 学ぶPNA FISH法による血液培養からの腸球菌属迅速同定法。蛍光顕微鏡でEnterococcus faecalisなどを識別し、敗血症治療のタイムリーな診断決定に貢献する臨床微生物学的手法です。

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研究はAdvanDxによって後援されています。

1。標本の収集と準備<ol><li>敗血症が疑われる患者から静脈血を採取し、一緒に1つ血液培養のセットを含む二バクテック（BD、スパークス、MD）血液培養ボトル、一つ好気性と嫌気性のいずれかに入れ。 </li><li> 35バクテック9240楽器にボトルを置きます℃を</li><li>楽器は血液培養ボトル中の生物の成長のためにアラームにトリガされるまでインキュベートする。 </li><li>血液培養器からボトルを取り外します。 </li></ol> 2。染色の前に試薬の調製<ol><li>染色皿に直接新鮮な脱イオン水または蒸留水240 mLを続いて60倍のWash Solutionを4mLを追加することにより、洗浄溶液を準備します。 </li><li>暖めて55℃の水浴中で染色皿を置く。 </li><li> 2〜8の残りの濃縮液℃に保管してください</li><li>冷蔵庫から封入剤を取り外し、室温まで昇温。 </li></ol> 3。グラム染色<ol><li>優しくスワール血液培養ボトルを。 </li><li>針と注射器や継代培養装置を用いて、滅菌スクリューキャップ付きチューブのボトルと場所から血液（約5mL）を取り外します。 </li><li>滅菌ピペットを用いて、ガラスの顕微鏡スライド上に血液中の一つの大きな低下を置きます。 </li><li>空気は、スライドを乾燥し、10秒間メタノールに修正。 </li><li>スライドを風乾します。 </li><li>血液培養ボトルに成長する有機体の形態を決定するために血液のフィルムでグラム染色を行います。 </li><li>油浸レンズを使用して、スライドを表示します。ペアとグラム染色で観察された短鎖のグラム陽性球菌は、エンテロコッカス種と最も一致している。 </li><li>このグラム染色の結果は、細菌の同定に使用する適切なPNAのFISHプローブキットの選択を駆動します。この血液培養は、E.を用いて染色されます。 球菌 / OEのPNA FISH染色。 </li></ol> 4。 PNAのFISHは、染色<ol><li>塗抹標本の前に渦巻くことにより穏やかに血液を含むチューブを混ぜる。 </li><li> PNAのFISHの顕微鏡用スライドのよく上の固定液の一滴を置きます。 </li><li> 10μLまたは固定液に血液培養が陽性とチューブから一つの小さなドロップを転送して乳化するために静かに混ぜる。 </li><li> 20分のためにそれらを加熱することにより、スメアを修正。 55 ° Cの加熱プレート上に。 </li></ol> 5。品質管理材料つの正と負の品質管理のスライドは、染色用スライドの各バッチでテストする必要があります。 <ol><li> E.を使用してください球菌 / OEコントロールのスライドは、この目的のためにAdvanDxから購入またはE.の参照株の液体培養から塗抹標本を準備するポジティブコントロールは別のスライド上で、または1つのスライドおよび陰性対照物質としてブドウ球菌属やストレプトコッカス属の混合のいずれかとしてfaecalisのとE.フェシウム。 </li></ol> PNAの方法論は、細胞壁の浸透を最適化するように設計されているので、QC結果は、特に適切な試験条件、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと細胞壁の浸透に影響を及ぼすものを監視することができるはずです 6。交配<ol><li> E.の一滴を追加塗抹標本による顕微鏡スライド上のウェルにフェカリス / OE PNA。 </li><li>カバースリップを追加。空気の泡を避けてください。 </li><li> 30秒間インキュベートする± 5分。 55℃± 1℃の加熱プレート上に</li><li>インキュベーション後、スライドキャリアにスライドを配置する</li></ol> 7。厳しいウォッシュ<ol><li> 55℃予熱洗浄液に浸し、スライドキャリア° Cと慎重にカバースリップを削除する。多くの場合、カバースリップは優しく洗浄ソリューションでスライドを撹拌することによりオフスライド。時折、カバースリップを静かにピンセットでオフプッシュする必要があります。 </li><li> 30の洗浄液± 5分でインキュベートする。 55℃± 1℃ </li><li>洗浄液からスライドを削除する</li><li>空気乾燥したスライドを許可する</li></ol> 8。取り付け<ol><li>各スライドに封入剤の一滴を追加</li><li>カバースリップを追加。空気の泡を避けてください。 </li><li> 2時間以内に蛍光顕微鏡でスライドを調べます。 </li><li>これは蛍光消光につながる可能性があるので太陽の光などの強い光源を指示するためにスライドを公開しないでください。 </li></ol> 9。結果の解釈スライドの検討に用いる蛍光顕微鏡はAdvanDxデュアルバンドフィルタと60倍または100X油浸対物装備されている必要があります。 QCのスライドは、そのハイブリダイゼーションが起こるか確認するために最初に調べる必要があります。E.は球菌は、ビューの複数のフィールドに明るい緑色の蛍光球菌のように表示されますとE.フェシウムは鮮やかな赤色球菌として表示されます。非腸球菌コントロールのスライドは非蛍光表示されます。コントロールにシステムを確認した後、患者のスライドを調べることができます。血液FIL最初はmは、赤みがかった表示されますが、明るい赤と緑球菌は非常に明らかであろう。 <img src="/files/ftp_upload/2616/2616fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1。緑色の陽性E.の代表的な例としては、 球菌 （左）、赤のプラスE.フェシウム（真ん中）、そして負（右）のテスト結果。 10。代表的な結果三機関は、このPNAのFISH染色を評価し、ちょうど検討された短縮1.5時間のプロトコルに2.5時間のプロトコルを比較する多施設共同臨床試験に含まれていた。ペアとチェーンの152ルーチンのグラム陽性球菌の合計（GPC）陽性の血液培養ボトルは、研究に含まれていた。 100％（152分の152）は、E.のための修正と、元のアッセイ手順の結果の間に合意があった球菌 / OEのPNA FISH：41分の41 E.球菌 、33分の33、他の腸球菌と78分の78他のGPC（表1）。この染色法は、この臨床試験（表2）の間に絶妙な感度と特異性を持っていた。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> ルーチン方法 </td><td> E. faecalisの / OEのPNA FISHの標準手順 </td><td> E. faecalisの / OEのPNA FISHショート手順 </td></tr><tr><td> E. faecalisの </td><td> 41 </td><td> 41（グリーン正） </td><td> 41（グリーン正） </td></tr><tr><td> E.フェシウム </td><td> 27 </td><td> 27（ポジティブレッド） </td><td> 27（ポジティブレッド） </td></tr><tr><td> E. casseliflavus </td><td> 2 </td><td> 2（正レッド） </td><td> 2（正レッド） </td></tr><tr><td> E. gallinarum </td><td> 2 </td><td> 2（正レッド） </td><td> 2（正レッド） </td></tr><tr><td> 他の腸球菌属。 </td><td> 2 </td><td> 2（正レッド） </td><td> 2（正レッド） </td></tr><tr><td> 肺炎球菌 </td><td> 17 </td><td> 17（負） </td><td> 17（負） </td></tr><tr><td> S.ビリダンス </td><td> 33 </td><td> 33（負） </td><td> 33（負） </td></tr><tr><td> S.可鍛鋳鉄 </td><td> 1 </td><td> 1（負） </td><td> 1（負） </td></tr><tr><td> S.化膿連鎖 </td><td> 3 </td><td> 3（負） </td><td> 3（負） </td></tr><tr><td> S.ボビス </td><td> 2 </td><td> 2（負） </td><td> 2（負） </td></tr><tr><td> S.バリウス </td><td> 1 </td><td> 1（負） </td><td> 1（負） </td></tr><tr><td> S. sanguinis </td><td> 2 </td><td> 2（負） </td><td> 2（負） </td></tr><tr><td> S. agalagtae </td><td> 7 </td><td> 7（負） </td><td> 7（負） </td></tr><tr><td> 他のレンサ球菌属。 </td><td> 7 </td><td> 7（負） </td><td> 7（負） </td></tr><tr><td> Abiotrophia属。 </td><td> 3 </td><td> 3（負） </td><td> 3（負） </td></tr><tr><td> Peptostrepococcus属。 </td><td> 2 </td><td> 2（負） </td><td> 2（負） </td></tr><tr><td>合計</td><td> 152 </td><td> 152分の152 100％の契約</td><td> 152分の152 100％の契約</td></tr></tbody></table>細菌の表1。リストは、標準（2.5時間）と急速に（1.5時間）プロトコルの両方を使用してテスト。 <table border="1"><tbody><tr><td> 感度E.faecalis </td><td> 感度その他のエンテロコッカス属。 </td><td> 特異 </td></tr><tr><td> 100％（41分の41） 95％CI（93.0〜100） </td><td> 100％（33分の33）33分の33 95％CI（91.3〜100） </td><td> 100％（78分の78） 95％CI（96.2〜100） </td></tr></tbody></table> 表2。1.5時間のPNA FISHプロトコルの感度と特異性。

<ol><li>Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes. Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. 42rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, San Diego, , (2002).</li>
<li>Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures. Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. 103rd Annual Meeting of American Society, 2003, Washington DC, , (2003).</li>
<li>Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes. Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. 104th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2005, New Orleans, LA, , (2005).</li>
<li>Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH & C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles. Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, , (2006).</li>
<li>Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications. Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, , (2006).</li>
</ol>

このビデオ記事の生産はAdvanDxが後援した。ベンジャミンクリスタルは、この記事で使用するツールと試薬を作るAdvanDx、の従業員です。

E.腸球菌用球菌 / OEのPNA FISHアッセイは、標準的な培養法よりも2〜3日以前の識別を提供することができます。アッセイのための短縮手順（1.5 hourr）は抗菌薬治療と患者の転帰への良いアプローチに使用することができる迅速な識別を提供します。これをサポートするために一つの研究は、フォレスト、 ら （6）で実施した。 2005年から2年連続にわたって微生物学研究室では、従来の微生物学的方法による血液培養ボトル中で成長し、2006年にE.を追加してペアとチェーンでグラム陽性球菌を同定した球菌 / OEのPNA FISH。さらに、機関抗菌チーム（AMT）が開発した治療アルゴリズムは効果的にタイムリーに実験室で生成されたPNAのFISHのデータを使用する。評価主要転帰は、血液培養からの時間だったのPNA FISHの実験室のワークフローに制定された前と後の効果的な抗菌薬治療の実装に描く。病気、患者の位置と経験的抗菌療法の重症度を測定した。腸球菌による菌血症を取得した病院で224例の合計は、介入前の期間に129とPNAのFISHの期間で95と評価した。 E.を特定のPNA FISH 3日前の従来の文化をよりフェカリス （1.1対4.1日、P &lt;0.001）。 PNAの魚は中央値2.3日以前のE.フェシウムを同定した（1.1対3.4日、p &lt;0.001）および効果的な治療を開始するまでの期間で統計的に有意な減少（1.3対3.1日、P &lt;0.001）に関連付けられており、30日に減少した死亡率（26％対45％、P = 0.04）。このグループは結論づけているE. AMT治療アルゴリズムと組み合わせてフェカリス / OEのPNA FISHアッセイは、菌血症E.フェシウムを取得した病院の患者のための適切な経験的抗菌薬治療の前の開始となりました。 <ol><li>ラベルと試薬に印刷されている有効期限が何らかの方法で変更しないでください後の試薬は使用しないでください。彼らは、使用しないときは、冷蔵庫に残ってくださいまたは、彼らは効力を失う可能性があります。 </li><li>血液培養ボトルは前のサンプリングに混合する必要があります。 </li><li>これはスライドの間に材料のクロスコンタミネーションを引き起こす、または試薬の汚染を引き起こす可能性があるため、血液塗抹標本に触れることドロッパーボトルの先端を許可しないことが重要です。 </li><li>水浴および加熱ブロックは一定の55℃に維持されていることを確認します</li><li>デュアルバンドフィルタまたはカラーを明確に識別することがない以外のフィルタを使用しないでください。 </li><li>顕微鏡スライドまたはハイブリダイゼーション発生しません以外の顕微鏡スライドを使用しないでください。 </li><li>顕微鏡が正常に機能していることが重要です。顕微鏡の電球は、使用のための時間の承認数の範囲内であることを確認してください。 </li></ol><ul><li>いくつかのまれな発性腸球菌種は、E. asinii、E.dispar、E. haemoperoxidus、E. cecorum、E.鳩類、大腸菌saccharolyticus、E.孤やEなどの他のエンテロコッカス種にハイブリダイズするPNAプローブによって検出されていません。亜硫酸。 </li><li>大腸菌moraviensisはE.として識別され配列類似性に起因するフェカーリス 。 </li><li> 連鎖球菌 anginosusの一部の菌株は、配列類似性に起因する偽の緑のポジティブの蛍光を生じる。 </li><li> VersaTREKの血液培養ボトルは、臨床試験中に評価されていません。 E.を検出するためにパフォーマンス球菌と他の腸球菌属。 VersaTREKの血液培養ボトルでは不明です。 </li><li>標準FITCフィルターはデュアルバンドフィルタの代わりに使用されている場合、偽陽性緑色自家蛍光が発生する可能性があります。 </li><li>偽陰性の結果は、まれに混在成長に起因またはアッセイ法におけるエラーが原因で発生する可能性があります。 </li><li>使用する計測機器の種類と条件が得られる画像の視覚的外観に影響を与えます。蛍光は、雇用顕微鏡の種類、光源と細胞内のrRNAのレベルにvarydueこと</li><li>固体培地上に分離は他の生物との混合の成長を区別すると否定的な結果をもたらす血液培養陽性を識別するために必要とされる。 </li><li>製品は、血液培養以外の標本で検証されていません。 </li></ul>

試薬 E. faecalisの / OEのPNA FISHは、次のキットのコンポーネントで構成されています。 <ul><li>固定ソリューションの固定液は、界面活性剤とリン酸緩衝食塩水3mLの。 </li><li> E. faecalisの / OE PNA E.ハイブリダイゼーションの球菌 / OE PNA 1.5 mLのPNAプローブ。ソリューション。 30％ホルムアミドが含まれています。 </li><li>洗剤と60倍のWash Solutionを60倍洗浄液は、50 mLのトリス緩衝生理食塩水</li><li>グリセリンで封入剤封入剤3mLの光退色抑制剤</li><li>品質管理のスライド</li><li> <a href="http://www.advandx.com">AdvanDX</a> </li></ul>

の識別のための1.5時間の手順腸球菌</em直接血液培養から>種

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

腸球菌はE.による菌血症の一般的な原因です。 E.フェシウムが続く主な種であることフェカーリス 。理由E.のアンピシリン及びバンコマイシン耐性球菌は E.フェシウムの抵抗に比べて、まだ珍しいです、腸球菌種の間で差別化を可能にする迅速検査の開発は、適切な治療と耐性サーベイランスのために重要です。 E.カリス OEのPNA FISHアッセイ（AdvanDx、ウォーバーン、マサチューセッツ州）は、in situハイブリダイゼーションの形式で蛍光で種特異的なペプチド核酸（PNA）プローブを使用し、1.5時間と固有種にとって重要な情報を提供する可能性の結果に時間を提供しています治療。多施設共同研究は1.5時間E.の性能を評価するために行った球菌 / OEのPNA FISHの手順では、元の2.5時間のアッセイ手順にと血液培養陽性ボトルから直接、腸球菌の同定のための標準的な細菌学の方法に比べて。

in situハイブリダイゼーションアッセイの蛍光ペプチド核酸（PNAのFISH）を用いた血液培養陽性の腸球菌や他のエンテロコッカス種の直接同定するための迅速なプロトコル。

エントロコッカス属菌は菌血症の一般的な原因菌であり、E. faecalisが主要な種で、次いでE. faeciumが多い。アンピシリンに対する耐性が……のため、

この手順の全体的な目的は、ペプチド核酸（PNA）蛍光in situハイブリダイゼーションを用いて、陽性血培ボトルからEnterococcus属種を迅速に特定することです。血培の調製およびグラム染色によるEnterococci培養の存在確認後、サンプルをPNA-FISH顕微鏡スライドに固定します。その後、スライドを目的の微生物に特異的なPNAプローブとともにインキュベートします。プローブのハイブリダイゼーション後、厳格な洗浄を行い、ハイブリダイズしていない過剰なプローブを除去します。スライドに封入剤を加え、カバーガラスで封止します。サンプル中に存在するエンテロコッカス属種は、蛍光顕微鏡により同定することが可能です。このPNA-FISH同定プロトコルは、敗血症からのEnterococcusを迅速かつ特異的に同定するための独自の手法を提供します。患者の血液培養検体として、敗血症が疑われる患者から採取した静脈血を含む好気性および嫌気性の血液培養ボトル各1本を、自動血液培養装置を用いて35 °Cで培養します。装置が微生物の増殖を検知した時点でボトルを取り出し、血液培養ボトルを穏やかに回転させて細菌を均一に再懸濁させます。次に、滅菌済みの注射器と針を用いて、各ボトルから約5 mLの血液を、それぞれ別のスクリューキャップチューブに無菌的に分注します。すべての検体の分注が完了したら、滅菌ピペットを使用して、各チューブから血液1滴をそれぞれ別のガラス製顕微鏡スライドに滴下します。スライドを約15分間、風乾させます。スライドが完全に乾燥した後、スライドをメタノールに浸してサンプルを固定します。スライドの固定後、それらを洗浄し、標準的なグラム染色の手順に従って、各血液培養液中に存在する微生物の形態を判定します。染色したスライドを、油浸対物レンズを備えた顕微鏡で観察してください。血液培養液を添加すると、通常、ペアまたは短い連鎖状に集まったグラム陽性球菌が現れます。固定液を1滴、pおよび魚類用顕微鏡スライドのウェルに入れます。検査対象となる血液培養チューブを静かに混ぜ合わせます。次に、10 µLの培養液を固定液の滴上に移し、ピペッティングしてサンプルを乳化させます。スライドを55 °Cのホットプレートで20分間加熱し、各テストの塗抹標本を固定します。アッセイの品質評価のため、必ず陽性対照および陰性対照のスライドを含めてください。カルスコントロールスライドは、Van DX社から購入するか、参照株を用いて調製します。塗抹標本の準備が整ったら、血液培養サンプルを含むウェル、および陽性・陰性コントロールウェルに、EFIカルスO-E-P-N-Aを1滴ずつ点適します。プローブ原液の汚染を防ぐため、ドロッパーボトルの先端が血液塗抹標本に触れないように注意してください。気泡が入らないように注意しながら、サンプルの上にカバーガラスを載せます。次に、スライドを加熱ブロックに入れ、55 °Cで30分間インキュベートします。インキュベート後、PNAをハイブリダイズさせるために、スライドをスライドキャリアに設置します。試料を載せたスライドキャリアを、55 °Cに予熱した洗浄液が入った染色皿に浸します。バッファー中でスライドを攪拌するか、またはピンセットを使用してカバーガラスをそっと外し、試料上の過剰なPNAを除去します。スライドを洗浄液中で55 °Cで30分間インキュベートします。次に、染色皿からスライドを取り出し、自然乾燥させます。スライドが乾いたら、室温の封入剤を1滴滴下し、サンプルの上にカバーガラスを慎重に載せます。調製後2時間以内に、デュアルバンドフィルターを用いて蛍光顕微鏡でスライドを観察してください。この方法を用いることで、左側に緑色で示されている iffy、callous を、赤色の eum と区別することができます。一番右側の中央パネルは陰性の結果です。良好な結果を得るために留意すべき3つの点のうちの1つは、装置の温度を設定温度に維持しなければならないことです。パッケージの添付文書に記載されている染色手順に厳密に従ってください。そして最後に、経験豊富で、スライドを詳細に読影できる読影者が不可欠です。本プロトコルは、Enterococcusによる敗血症の治療に向けた治療方針の決定に有用です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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