Name: 胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶ ホールマウント免疫組織化学法とレーザー走査共焦点顕微鏡を用いたマウス胚肢皮膚の血管網形成解析法。血管分岐形態形成と発生過程を詳細に観察できます。

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我々はマウスの繁殖と介護の支援のために、実験室の管理のためのK.ギルに感謝。また、技術的なヘルプのための向山研究室のメンバーに感謝します。資金は、保健のNaitonal研究所の学内研究プログラムによって提供されていました。

1。マウス胚の四肢の皮膚の収集（E13.5〜E17.5） <ol><li>安楽死は、承認された手順によって女性を差し込む。私達の承認された動物のプロトコルによると、女性はCO 2曝露により安楽死され、その後、頚椎脱臼により保証。その吸水性のペーパータオルに動物を置くと、スクイーズボトルから70％エタノール/ H 2 Oでそれを徹底的に浸します。 </li><li>子宮はそのままに摘出し、血液を洗い流すために、氷冷ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を含む100 × 15ミリメートルペトリ皿に入れてください。 </li><li>胚を分離して分析する。胚から非常に薄い羊膜を取り外します。 </li><li>各胚は遺伝子型をする必要がある場合（オプション）35 x 10 mmのシャーレに、単一の胚を摘出。解剖テールは、ジェノタイピングのために0.2ミリリットルのPCRチューブに移している。 </li><li>胚の前肢を切断し、転送はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で氷冷新鮮な4％パラホルムアルデヒド（PFA）の2 mlを入れた24ウェルプレートにリングの鉗子によって前肢。 </li><li> 4℃で一晩Nutatorミキサーで穏やかに混合して前肢を固定してください。 </li><li>翌日に、PFAを削除し、室温でNutatorミキサーで穏やかに混合したPBSを2 ml中で5分間3回洗浄する。 </li><li> 100％メタノール（MeOH）で前肢を移し、-20℃酵素の冷凍庫（臨界温度制御付きと自動霜取り機能のない冷凍庫）で保管してください。一次抗体は、100％メタノール処理後の表1の作業にリストされています。 </li><li>細かいピンセットを使用して前肢から剥がれ皮膚。手足の皮膚は、乾燥、手足から容易に分離する必要があります。最初に上に向けて腹側（手のひら側）で手足を置く。ビデオに示されるようにし細かいピンセットを使って、皮膚を​​カット。次のいずれかのダメージを与えることなく穏やかに肌を剥離、全体の肢の周囲解剖。 </li></ol> 2。リムのスキンのホールマウント免疫組織化学的染色<ol><li> 5分ごとのMeOH / PBT（PBS + 0.2％トリトンX - 100）（75％、50％、25％）の段階的な一連インキュベートすることにより、5ミリリットルポリプロピレン丸底チューブの手足の皮を水和。ソリューションを交換すると四肢の皮を損傷しないように気をつけなければならないことに注意してください。 </li><li>室温でNutatorミキサーで穏やかに混合してPBTで5分間2回洗浄する。 </li><li>でNutatorミキサーで穏やかに混合して2時間ヤギ二次抗体またはロバ二次抗体を10％ロバ血清/ PBS 0.2パーセントTX100ブロッキング緩衝液を10％ヤギ血清/ PBS 0.2パーセントTX100ブロッキング緩衝液のいずれかと四肢のスキンをブロック室温。 </li><li>ブロッキングバッファーで一次抗体の800μl（表に記載されているように、適切な希釈）（と2ミリリットル-マイクロ遠心チューブにリングの鉗子で35 x 10 mmのペトリ皿および転送に関する手足の皮を置き、いずれかの10％ヤギ血清/ PBS 0.2 ％TX100または10％ロバ血清/ PBS 0.2パーセントTX100）。 4℃で一晩Nutatorミキサーで穏やかに混合して四肢のスキンをインキュベートする。別の種（例えば、ラットモノクローナル抗体+ウサギポリクローナル抗体）から派生した複数の一次抗体を同時に使用することができることに注意してください。 </li><li>次の日に、2％ヤギ血清/ PBS 0.2パーセントTX100または2のどちらかは、洗浄バッファー（の4ミリリットルで5ミリリットルポリプロピレン丸底チューブにリングの鉗子で35 x 10 mmのペトリ皿や転送に四肢のスキンを配置％ロバ血清/ PBS 0.2パーセントTX100）。 </li><li>穏やかな室温でNutatorミキサーで混合しながら15分間5回洗浄する。 </li><li>ブロッキングバッファー中の二次抗体の800μl（どちらか10％ヤギ血清/ PBS 0.2パーセントTX100をまたは10％ロバ血清/を持つ2ミリリットル、マイクロ遠心チューブにリングの鉗子で35 x 10 mmのペトリ皿や転送に四肢のスキンを配置PBS 0.2パーセントTX100）。一般的に我々は、ジャクソンイムノ（Cy3標識、Cy5で、1:300希釈）またはInvitrogen社（のAlexa Fluor ® 488のAlexa Fluor 568、のAlexa Fluor 633、1:250希釈）から二次抗体を使用してください。二次抗体の凝集した粒子を除去するために0.22μmのPVDF膜シリンジフィルターを用いて二次抗体溶液をフィルタ。室温でNutatorミキサーで穏やかに混合して1時間暗いまたはアルミホイルで包んだの四肢のスキンをインキュベートする。異なる種に由来する異なる蛍光標識二次抗体を同時に使用することができることに注意してください。 </li><li>洗浄バッファーの4ミリリットル（2％ヤギ血清/ PBS 0.2パーセントのどちらかTX100または2％ロバ血清/ PBSで5ミリリットルポリプロピレン丸底チューブにリングの鉗子で35 x 10 mmのペトリ皿や転送に四肢のスキンを配置0.2パーセントTX100）。暗いまたは穏やかな室温でNutatorミキサーで混合とアルミ箔で包んで15分間5回洗浄する。 </li><li> （核に対する対比のためのオプション）インビトロジェンT3605 TO - PRO - 3（洗浄バッファー（2％ヤギ血清/ PBS 0.2パーセントTX100または2％ロバ血清/ PBSのいずれか0.2パーセントTX100）の4ミリリットルと四肢のスキンをインキュベート、暗いまたは部屋temperatuでNutatorミキサーで穏やかに混合しながら10分間アルミホイルで包んで1:3000希釈）再。その後、上ミキシング優しいと暗いまたはアルミホイルでラップされたの洗浄バッファー（2％ヤギ血清/ PBS 0.2パーセントTX100または2％ロバ血清/ PBSのいずれか0.2パーセントTX100）の4ミリリットルで5分間3回洗浄室温でNutatorミキサー。原子核の強いと特異的染色が特定の排出（HeNeレーザ633nmの励起）でTO - PRO - 3で観察されていることに注意してください。 </li></ol> 3。スライド上のリムのスキンの取り付け<ol><li> 35 x 10 mmのシャーレの上で手足の皮を置きます。粉塵、結晶、漂白豊富な写真を避けるために、低照度で実体顕微鏡下で微細なピンセットを使用してスキンの内側の層から繊維を取り除く。 </li><li>リングの鉗子によって接着剤顕微鏡スライドに手足の皮を転送します。スライド（カバーガラスに向かってすなわち）に上向きに横たわって内層でのスキンを置きます。慎重に細かいピンセットを使ってスキンを平らにし、キムワイプで洗浄バッファーキャリーオーバーを削除します。 </li><li>気泡なしでアンチフェードマウントメディアにマウントします。我々は、25"X25"カバースリップを使用してください。暗闇の中で平らな場所に置き、乾燥（例えば、サンプルが表示する前に、室温で暗所で一晩置かれているゴールド試薬を延長使用してマウント）。長期保存のために、4でスライドして格納するためにカバースリップをシール℃に</li></ol> 4。共焦点顕微鏡<ol><li>蛍光体の適切なレーザーを設定します。我々は、アルゴン488nmの（のAlexa Fluor ® 488およびGFPの場合）、DPSS 561nm（のAlexa Fluor 568およびCy3用）とヘリウムネオン633nm（のAlexa Fluor 633、Cy5標識およびTO - PRO - 3）を含む3つのレーザー源とライカTCS SP5共焦点顕微鏡を使用してください。 </li><li>ダブルまたはトリプル染色サンプルのすべての色素を同時に励起されるのクロストークを軽減または回避するシーケンシャルスキャンツールを使用してください。シーケンシャルスキャンモードでは、画像を順番に記録されます。 </li><li>励起用の蛍光色素とレーザーに関する一般的な情報はヒブズによる"生物学者のための共焦点顕微鏡"（2004）年に設立されることがあります</li></ol> 5。代表的な結果汎血管内皮細胞のマーカーに対する抗体とE15.5のマウス前肢の皮膚のホールマウントトリプルラベル共焦点immnofluorescence顕微鏡PECAM - 1（図1A - C、Dブルー）、ニューロフィラメントマーカー2H3（図1A緑）、および平滑筋細胞マーカーαSMA（図1A、B、赤）は、四肢の皮膚に2H3 +末梢神経に沿ったαSMA+動脈、の特徴的な分岐パターンを明らかにした。分岐血管に加えて、この四肢の皮膚の血管系のモデルは、リンパ管内皮細胞マーカーLYVE - 1（図1D、E赤）とNeuropilin2（NRP2）（図1D、F緑に対する抗体を用いて分岐リンパ管のパターニングを研究するために使用され）。 <img src="/files/ftp_upload/2620/2620fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1（AC）動脈は、胚肢の皮膚の末梢神経に合わせます。汎血管内皮細胞マーカーPECAM - 1（AC、青）に対する抗体とホールマウントトリプルラベル共焦点immnofluorescence顕微鏡、ニューロフィラメントマーカー2H3（A、緑）、および平滑筋細胞マーカーαSMA（AとB、赤）が表示されます。 E15.5、2H3で+末梢神経（オープン矢印は）αSMAでカバーされている動脈（矢頭）+平滑筋細胞に関連付ける。胚肢の皮膚の（DF）リンパ脈管。汎血管内皮細胞のマーカーに対する抗体PECAM - 1（D、青）、リンパ管内皮細胞マーカーLYVE - 1（DとE、赤）とNeuropilin2（NRP2）（DとF、緑とトリプルラベル共焦点immnofluorescence顕微鏡）が表示されます。 LYVE - 1はまた、マクロファージ（オープン矢頭）の部分集合で表されるのに対し、リンパ管は、LYVE - 1とNRP2両方により可視化。スケールバー：100μmの。

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li>
<li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

それが臓器に十分な酸素と栄養を供給するので、血管系は、胚形成の間だけでなく、臓器のメンテナンスと成人の生殖機能のための器官の開発にとって極めて重要である。適切な血管網は、既存の毛細血管網が高度に分岐したと階層構造で編成されている血管新生により、複雑で多段階のプロセスで十分に確立されている。数々の作品は様々な分子がこ​​れらのプロセスに関与していることが示されているが、それは、臓器またはそのコンポーネントが血管分岐の内皮細胞の分化とパターン形成を含む、血管の開発の段階的なプロセスを促進するための信号を提供する方法を明らかになっていない。この問題に対処するために、我々は血管の開発のプロセスに従うことができる適切な血管新生器官が必要です。機能獲得と機能喪失型の遺伝子操作による手足の皮膚血管系モデルは、血管の開発の高分解能解析を可能にします。 ここでは、胎児マウスの前肢の解剖、日常的に四肢の皮膚の血管新生とリンパ管新生を分析するために我々の研究室で使用されているホールマウント免疫組織化学的染色と共焦点顕微鏡など、詳細なプロトコルを記述する。プロトコルは、早期のための再現可能な結果と無傷の血...

抗体 汎血管内皮細胞のマーカー <table border="1"><tbody><tr><td> 抗体 </td><td> 種 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> 労働条件 </td></tr><tr><td> PECAM - 1 </td><td>アルメニアハムスター（M） </td><td>ケミコン</td><td> MAB1398Z </td><td> 1:100希釈＃1 </td></tr><tr><td> PECAM - 1 </td><td>ラット（M） </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> 1:300希釈</td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td>ラット（M） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 14-5821-82 </td><td> 1:200希釈</td></tr><tr><td> CD34 </td><td>ラット（M） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 13から0341 </td><td> 1:300希釈</td></tr><tr><td>コラーゲンIV </td><td>ウサギ（P） </td><td> ABD Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> 1:300希釈＃2 </td></tr></tbody></table> 動脈内皮細胞のマーカー <table border="1"><tbody><tr><td> 抗体 </td><td> 種 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> 労働条件 </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td>ウサギ（P） </td><td>アレックスKolodkinのラボ第3位 </td><td></td><td> 1:3000希釈</td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td>ヤギ（P） </td><td> R＆D </td><td> AF1006 </td><td> 1:200希釈</td></tr></tbody></table> 静脈内皮細胞のマーカー <table border="1"><tbody><tr><td> 抗体 </td><td> 種 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> 労働条件 </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td>ヤギ（P） </td><td> R＆D </td><td> AF446 </td><td> 1:100希釈</td></tr></tbody></table> リンパ管内皮細胞マーカー <table border="1"><tbody><tr><td> 抗体 </td><td> 種 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> 労働条件 </td></tr><tr><td> LYVE - 1＃4 </td><td>ウサギ（P） </td><td>アブカム</td><td> ab14917 </td><td> 1:200希釈</td></tr><tr><td> LYVE - 1＃4 </td><td>ラット（M） </td><td> MBL </td><td> D225 - 3 </td><td> 1:200希釈</td></tr><tr><td> PROX - 1 </td><td>ウサギ（P） </td><td>ケミコン</td><td> AB5475 </td><td> 1:1000希釈</td></tr><tr><td> PROX - 1 </td><td>ヤギ（P） </td><td> R＆D </td><td> AF2727 </td><td> 1:50希釈</td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td>ウサギ（P） </td><td>細胞シグナリング</td><td> 3366 </td><td> 1、100希釈</td></tr><tr><td>ポドプラニン</td><td>シリアンハムスター（M） </td><td>ハイブリドーマバンク</td><td> 8.1.1 </td><td> 1:200希釈</td></tr></tbody></table> 平滑筋細胞/周皮細胞マーカー <table border="1"><tbody><tr><td> 抗体 </td><td> 種 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> 労働条件 </td></tr><tr><td> αSMA- CY3 </td><td>マウス（M）＃5 </td><td>シグマ</td><td> C - 6198 </td><td> 1:500希釈＃6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td>ウサギ（P） </td><td>ケミコン</td><td> AB5320 </td><td> 1:200希釈</td></tr><tr><td> SM22α </td><td>ウサギ（P） </td><td>アブカム</td><td> ab14106 </td><td> 1:200希釈</td></tr></tbody></table> GFPレポーターのための抗体 <table border="1"><tbody><tr><td> 抗体 </td><td> 種 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> 労働条件 </td></tr><tr><td> GFP </td><td>ウサギ（P） </td><td>インビトロジェン</td><td> A11122 </td><td> 1:300希釈</td></tr><tr><td> GFP </td><td>ラット（M） </td><td>ナカライテスク</td><td> 04404〜84 </td><td> 1:1000希釈</td></tr><tr><td> GFP </td><td>チック（P） </td><td>ケミコン</td><td> P42212 </td><td> 1:300希釈</td></tr></tbody></table> LacZレポーターのための抗体 <table border="1"><tbody><tr><td> 抗体 </td><td> 種 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> 労働条件 </td></tr><tr><td> β- galを</td><td>ウサギ（P） </td><td> MPバイオメディカル</td><td> 55976 </td><td> 1:5000希釈</td></tr><tr><td> β- galを</td><td>ヤギ（P） </td><td> ABD Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> 1:500希釈</td></tr><tr><td> β- galを</td><td>チック（P） </td><td>アブカム</td><td> ab9361 </td><td> 1:200希釈</td></tr></tbody></table> 末梢軸索のための抗体 <table border="1"><tbody><tr><td> 抗体 </td><td> 種 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> 労働条件 </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td>マウス（M）＃7 </td><td>ハイブリドーマバンク</td><td> 2H3 </td><td> 1:200希釈</td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td>マウス（M）＃8 </td><td> Covance </td><td> MMS - 435P </td><td> 1:500希釈</td></tr><tr><td>ペリフェリン</td><td>ウサギ（P） </td><td>ケミコン</td><td> AB1530 </td><td> 1:1000希釈</td></tr></tbody></table> シュワン細胞を移行するための抗体 <table border="1"><tbody><tr><td> BFABP </td><td>ウサギ（P） </td><td>トーマスミュラーの研究室第9位 </td><td></td><td> 1:3000希釈</td></tr></tbody></table> （P）：ポリクローナル抗体、（M）：モノクローナル抗体第1位：ヤギ抗アルメニアハムスター- Cy3の（ジャクソンイムノ127-165-160）抗体を二次抗体として使用する必要があります。 第2位：コラーゲンIV抗体は、in situハイブリダイゼーションの後に血管を検出するために使用することができます。 ＃3：Neuropilin1の抗体は、親切にジョンズホプキンス大学のアレックスKolodkinの研究室によって提供されます。我々はまだそれをテストしていないもののヒツジ抗ヒトNeuropilin1の抗体は、R＆D（AF3870）で利用可能です。 ＃4：LYVE - 1抗体はまた、胚性皮膚におけるマクロファージのサブセットを検出する。 ＃5：抗αSMA抗体マウスIgG2aモノクローナル抗体です。 ＃6：Cy3結合αSMAの抗体は、秒と一緒に室温で1時間インキュベートする他の一次抗体のための二次抗体。 ＃7：2H3抗体神経フィラメントに対するマウスIgG1モノクローナル抗体です。 ＃8：Tuj1抗体はニューロン固有のクラスIIIβ-チューブリンに対するマウスIgG2aモノクローナル抗体である。 ＃9：BFABP（脳特異的脂肪酸結合タンパク質）抗体は、親切に分子医学のマックスデルブリュック - センターのトーマスミュラーの研究室によって提供されます。

胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

イメージングのためのホールマウント免疫組織化学分析は、全​​体の血管系は分岐形態形成の細胞メカニズムを理解するために極めて重要である。我々は、既存のプリミティブ毛細血管叢が階層的に分岐した血管網に再編成されている血管の発達を研究するために四肢の皮膚の血管系モデルを開発した。複数のラベルを持つホールマウント共焦点顕微鏡は、特定の蛍光マーカーを使用して、無傷の血管の堅牢な画像だけでなく、内皮細胞、周皮細胞および平滑筋細胞を含むそれらの細胞成分が可能になります。遺伝学的研究でこの四肢の皮膚の血管系モデルの進歩により、血管の開発とパターン形成の分子機構を理解改善している。四肢の皮膚の血管系のモデルは、末梢神経、動脈の分化とパターン形成のために空間的なテンプレートを提供する方法を研究するために使用されています。このビデオの記事では、我々は血管の開発のプロセスに従うことができる血管新生化胚の臓器に適用可能な血管特異的な抗体と蛍光二次抗体、で無傷の血管を染色するためのシンプルで堅牢なプロトコルを記述します。

我々はマウス胚の四肢の皮膚に複雑な血管網の形成を分析するために複数のラベルで共焦点顕微鏡を走査型ホールマウントの免疫組織化学とレーザーをご紹介。

血管系全体をイメージングするためのホールマウント免疫組織化学的解析は、分枝形態形成の細胞メカニズムを理解する上で極めて重要である。我々は、既存の原始的な毛細血管叢が階層的に分枝した血管ネットワークへと再編成される過程における血管発達を研究するため、四肢皮膚血管モデルを開発した。多重標識を用いたホールマウント共焦点顕微鏡観察では、特異的な蛍光マーカーを用いることで、無傷の血管だけでなく、内皮細胞、ペリサイト、平滑筋細胞を含むその細胞構成成分を堅牢にイメージングすることが可能となる。遺伝学的研究を伴うこの四肢皮膚血管モデルの進展により、血管の発達とパターニングの分子メカニズムへの理解が深まった。四肢皮膚血管モデルは、末梢神経が動脈の分化とパターニングのための空間的なテンプレートをどのように提供しているかを研究するために用いられてきた。本ビデオ論文では、血管特異的抗体と蛍光二次抗体を用いて無傷の血管を染色するための簡便かつ堅牢なプロトコルを解説する。本手法は、血管発達のプロセスを追跡することが可能な血管新生胚器官に適用できる。

本手順の目的は、発達中の肢皮膚における全血管系をイメージングするために、ホールマウント免疫組織化学分析を行うことです。まず、胚から4本の肢を切り出し、PBSで調製した4%パラホルムアルデヒドで4本の肢を固定し、次いで100%メタノールで脱水します。第2ステップでは、精密ピンセットを用いて肢の基部から皮膚を剥離します。青色の点線に沿って、100% methanolを含むディッシュの中で皮膚を剥がします。肢から皮膚を取り除きます。次に、血管特異的な一次抗体と蛍光二次抗体を用いて、肢の皮膚に対して免疫組織化学染色を行います。最終的に、多重標識を用いたホールマウント共焦点顕微鏡観察により、肢皮血管系全体の堅牢なイメージングが可能になります。これは、横断切片の組織学的解析などの既存の手法に対する本手法の利点と言えます。胚の切片作成を用いた手法とは異なり、肢皮血管系のホールマウント免疫組織化学的解析では、細胞成分を含む血管系全体のイメージングだけでなく、血管細胞の分化やパターニングのプロセス、およびリンパ管の分岐についても研究することができます。私の研究室のポストドクターであるWinding DAと共に手順を実演します。まず、妊娠した雌マウスから胚の肢皮を回収します。子宮を取り出して洗浄した後、解剖顕微鏡下で胚を分離し、解剖します。胚の解剖が完了したら、次のステップとして、微細ピンセットを用いて胚から4本の肢（LIM）を取り除きます。肩の部分で4本の肢を切断し、リング鉗子を使用して、氷を入れた24ウェルプレートに4本の肢を移します。冷えた新鮮なPBS中の4%パラホルムアルデヒド（PFA）を用意し、1ウェルにつき肢4本を2mLの4%PFAに入れます。回転ミキサーを用い、4°Cで緩やかに混合しながら一晩肢を固定します。翌日、各ウェルからPFAを除去し、2mLのPBSを加えます。室温でムタトールミキサーを用い、穏やかに攪拌しながら検体を5分間洗浄します。この洗浄を2回繰り返し、計3回行います。次に、4本の肢を、100%methanolを含む5 mLのポリプロピレン製ラウンドボトムチューブに移し、自動除霜機能がなく厳密な温度管理が可能な酵素用フリーザーにて-20 °Cで保存します。一晩-20 °Cで保存した後、肢から皮膚を剥離させることができます。これは本手順において最も重要な工程の一つです。なぜなら、その後の染色とイメージングの成否は、皮膚を損傷させないかどうかにかかっているからです。このように脱水処理を行うことで、4本の肢から皮膚を剥離させる際、肢から皮膚が容易に分離します。まず、肢の腹側を上にして配置します。次に、精密ピンセットを用いて、肢の基部付近の皮膚から足先に向かって直線的に切開します。続いて、肢を回転させながら皮膚を剥がし、肢全体を切り出します。皮膚を剥離させた後、4肢の肢皮のホールマウント免疫組織化学染色の準備を開始します。再水和用に、PBTで調製した75%、50%、25%のメタノールを含む50 mLストックチューブを3本用意してください。肢皮を、メタノール濃度が高い順から低い順へと、各濃度で5分間ずつ段階的にインキュベートし、再水和させます。まず、肢皮をPBT中の75%methanolを含む5mLポリプロピレン製ラウンドボトムチューブに移します。ムタターミキサーで5分間攪拌した後、75%methanolを慎重に吸引し、50%methanolおよびPBTで満たします。さらに5分後。50% methanolを25% methanolおよびPBTに置換します。最後のインキュベーション終了後、25% methanol PBTを慎重に吸引し、PBTを満たします。室温にてムタトールミキサーで緩やかに混合しながら、肢皮膚を5分間洗浄します。この洗浄をもう1回繰り返します。溶液の交換時に肢皮膚を傷つけないよう注意してください。肢皮膚の再水和が完了したら、適切なブロッキングバッファーでブロッキングを行います。室温でナットミキサーを用い、緩やかに混合しながら2時間インキュベートします。2時間後、肢皮膚を35 × 10 mmのペトリ皿に移します。次に、リング鉗子を使用して、適切なブロッキングバッファーで希釈した一次抗体 800 µLを含む2 mL遠心チューブに皮膚を移します。ここでは、異なる種に由来する複数の一次抗体を同時に使用できます。肢皮をミューテータミキサーで穏やかに混合しながら4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、肢皮を35 × 10 mmのペトリ皿に移します。その後、肢皮を適切な洗浄バッファー4 Lを含む5 mLポリプロピレン製ラウンドボトムチューブに移します。室温でムタターミキサーを用い、穏やかに撹拌しながら15分間の洗浄を5回繰り返します。各洗浄の際、使用済みのバッファーを慎重に新しいバッファーに交換してください。二次抗体を準備し、凝集した粒子を除去します。0.22 µmのPVDFメンブレンシリンジフィルターを用いて、二次抗体溶液を1.5 mL遠心チューブにろ過します。次に、粒子や気泡を除去するため、ろ過したサンプルを4 °Cで15,000 RPMにて10分間遠心分離します。ろ過後の抗体溶液を2 mLマイクロ遠心チューブに回収します。5回の洗浄が完了したら、四肢皮膚を35 x 10 mmのペトリ皿に置き、ブロッキングバッファーで希釈した800 µLの二次抗体を含む2 mLマイクロ遠心チューブに移します。この工程では、異なる種由来の異なる蛍光標識二次抗体を同時に使用することができます。四肢皮膚を室温で、ムタトールミキサーを用いて緩やかに混合しながら、暗所で1時間インキュベートします。1時間のインキュベーション後、肢皮を35×10 mmのペトリ皿に置き、適切な洗浄バッファー4 mLを含む5 mLポリプロピレン製ラウンドボトムチューブに移します。共焦点顕微鏡によるイメージングのため、室温でTatorミキサーを用いて緩やかに混合しながら、暗所で15分間×5回の洗浄を行います。免疫組織化学染色の後、肢皮をスライドガラスにマウントする必要があります。この手順を開始するには、低照度の実体顕微鏡下で、染色した肢皮を35 by 10 millimeterのペトリ皿に置きます。過度な光退色を防ぐため、微細ピンセットを使用して、皮膚の内層からダストクリスタルや繊維を取り除いてください。その後、肢皮を粘着性の顕微鏡スライドガラスに移します。内層を上にして、カバーガラスに接するように皮膚をスライドグラス上に配置します。次に、精密ピンセットを用いて皮膚を慎重に平らに広げます。付着している洗浄バッファーをキムワイプで取り除きます。皮膚組織にAntifade封入剤を加え、検体の上に25 by 25 mmのカバーガラスを載せます。気泡が入らないように注意しながら、検体を長期保存するために、室温の暗所で平らな面に置いて硬化させます。カバーガラスとスライドガラスの隙間をマニキュアで封止し、4 °Cで保存してください。E 15.5のマウス肢皮における神経と血管のパターニングを、ホールマウント三重標識共焦点免疫蛍光顕微鏡法による代表的な結果で示します。汎内皮細胞マーカーのpcam oneが青色、ニューロフィラメントマーカーのtwo H threeが緑色、そして平滑筋細胞マーカーのalpha SMAが赤色で示されています。これらの画像から、血管の分岐に加えて、白の矢頭で示されるalpha SMA陽性の動脈が、白抜き矢印で示されるtwo H three陽性の末梢神経に沿って特徴的な分岐パターンを形成していることが明らかになりました。この肢皮膚血管モデルは、リンパ管内皮細胞マーカーであるLYVE1（赤色で表示）とNeuropilin-2（緑色で表示）を用いることで、リンパ管分枝のパターニングを明らかにすることも可能です。リンパ管はLYVE1とNRP2の両方によって可視化されますが、一方でLYVE1は、白抜き矢印で示されたマクロファージのサブセットによっても発現しています。この手法は、血管生物学分野の研究者が、組織の発達、組織修復、および疾患状態における血管系の複雑なパターニングや分化プロセスを探索するための道を切り拓くものです。

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Biology

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