ロングレンジDNAの相互作用を識別するための関連する染色体のトラップ

次の実験の全体的な目標は、長距離の関連DNAパートナーを発見し、特定することです。これは、最初の制限酵素によるDNAの固定、細胞溶解、および消化と、それに続くライゲーションによって、2つの関連遺伝子からのセグメントで構成されるキメラDNAを作成することによって達成されます。次に、リンカーを第2の制限消化後にキメラDNAに添加し、その増幅を容易にするために、PCR増幅は、リンカーおよびベイトDNA特異的プライマーを用いて行い、十分な量の関連DNA断片を得るために、増幅されたDNA断片の配列分析に基づいて、ベイトDNAと結合する長距離の関連DNAパートナーを示す結果が得られる。

この手法は、染色体確認キャプチャや3つのCなどの既存の方法と比較した場合の主な利点として、A-C-T-S-Aを使用して未知の長距離関連DNAパートナーを効果的に同定できることです。一方、3つのCは、以前に疑われた相互作用のみの検証のために生じました。このプロトコル培養を開始するには、インキュベーター内のヒト細胞に摂氏37度で5%の二酸化炭素を供給し、80〜90%のコンフルエントになるまで

このデモンストレーションには、ヒトプロム酸性白血病細胞が使用されます。細胞を50ミリリットルのNOCチューブに注いで細胞を採取し、1200RPMで15分間遠心分離します。遠心分離後、吸引して培地を除去します。

5ミリリットルの培地を加えて、細胞ペレットを再懸濁します。ヘモサイトメーターで細胞をカウントした後、10倍から7番目の細胞に約1回、RPMI 1640、10%FBSを含む培地で40ミリリットルの容量にします。次に、1.7ミリリットルの37%ホルムアルデヒドを加えて、希薄なクロマチンを固定します。

サンプルを室温で10分間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。インキュベーション後、2.4ミリリットルの2モルグリシンで反応を急冷します。次に、サンプルを1200 RPMおよび摂氏4度で15分間遠心分離します。

スーパーナチンを除去した後、ペレットを40ミリリットルの氷冷PBSで一度洗浄し、次にサンプルを遠心分離して洗浄した細胞ペレットを回収し、得られたペレットを新たに添加したプロテアーゼ阻害剤と0.1ミリモルPMSFを添加した40ミリリットルの氷冷溶解緩衝液に再懸濁し、サンプルを低温室で90分間回転させてインキュベートします。最後に、サンプルを2, 500RPMで15分間遠心分離し、スーパーナチンを除去して単離された核を得る。1つのXNEBバッファー3の0.5ミリリットルで核を再懸濁し、10%SDSの15マイクロリットルを追加します。

サンプルを摂氏37度で1時間、振とうしながらインキュベートします。次に、20%Triton X 100の45マイクロリットルを加えてSDSを隔離し、37°Cで1時間再度インキュベートし、10倍を6分の1に振とうします。核または約15マイクログラムは、55マイクロリットルの核溶液への制限酵素消化に使用されます。

XNEBバッファー1個を433マイクロリットル、BGLバッファー3個を12マイクロリットル、BGL2個を12マイクロリットル追加します。総消化反応量を500リットルにするには、反応を摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、95マイクロリットルの10%SDSを追加して制限酵素を不活性化し、摂氏65度で20分間加熱して酵素を変性させます。.

水浴中に、7ミリリットルの1つのxライゲーションバッファーと360マイクロリットルの20%Triton X 100を追加します。サンプルを摂氏37度で1時間インキュベートします。温度を摂氏16度に下げ、マイクロリットルあたり400ユニットの50マイクロリットルを追加します。

T 4 DNAリガーゼ。ライゲーション反応を摂氏16度で4時間インキュベートし、次いで室温で30分間インキュベートします。ライゲーションが完了したら、300 μgのプロテイナーゼKを加え、摂氏65度で一晩インキュベートします。

次に、5マイクログラムのRNAAを加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。フェノールクロロホルム抽出によりDNAを精製し、DNAをイソプロパノールに沈殿させ、沈殿したDNAを150マイクロリットルの滅菌蒸留水に溶解します。キメラDNAにリンカーを添加するには、まず、精製されたDNAを2マイクログラムの精製DNAと5単位のmsp(1つは37°Cで1つは消化後4〜6時間)でインキュベートしてDNAを消化し、MSPを65°Cで10分間不活性化します。

次に、DNAをエタノールに5ミリグラム/ミリリットルの1マイクロリットルで沈殿させます。グリコーゲンは、得られたDNA口蓋を50マイクロリットルの滅菌蒸留水に溶解します。次に、50マイクロリットルのMSPと1つの処理DNAを、2マイクロリットルの20マイクロモルリンカーオリゴヌクレオチドLおよび1マイクロリットルの20マイクロモルオリゴヌクレオチドSと混合し、次に1マイクロリットルの滅菌蒸留水と6マイクロリットルの10XT 4DNAリガーゼバッファーを添加します。

混合物を液体ワックスで覆います。オリゴヌクレオチドを摂氏50度で1分間変性させ、毎分0.5°Cの勾配で摂氏10度まで徐々に冷却します。サーマルサイクラーを使用して、1マイクロリットルあたり400ユニットのT4DNAリガーゼを1マイクロリットル追加し、反応を摂氏15度で一晩インキュベートします。

翌日、kaya quick PCR精製キットを使用してリンカーライゲーションDNAを精製し、50マイクロリットルの滅菌蒸留水で溶出します。長距離相互作用について調査するDNAの特定の領域のプライマーを選択します。この例では、Abelをプライマーまたはベイトとして使用します。

精製されたDNAの1マイクロリットルを、20マイクロモルの可能な1つの特異的プライマー、46、56、および1マイクロリットルの20マイクロモルリンカー特異的プライマー29、63の1マイクロリットルと組み合わせることにより、最初のラウンドPCRのために精製されたDNAを調製する。次に、3 x ClinTech、DNAポリメラーゼ1カクテルの3マイクロリットルを、以前に書かれたプロトコルに従って32 P-D-C-T-Pと混合し、続いて3マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えます。PCRサイクル終了後、書かれたプロトコルに記載されているホットスタートPCRサーマルサイクルを使用してPCR増幅を行います。

カヤクイックPCR精製キットEluteを使用して、30マイクロリットルの滅菌蒸留水で最初のラウンドPCR産物を精製します。100倍に希釈した第1のPCR産物の1マイクロリットルを使用して、1マイクロリットルの20マイクロモル可能な1つの特異的プライマー、46、26、および1マイクロリットルの20マイクロモルリンカー特異的プライマーを添加することにより、ネストされたプライマーを用いて第2ラウンドのPCRを実施する。29 61。

再度、3マイクロリットルの3 x ClinTech、DNAポリメラーゼ、1つのカクテル、および3マイクロリットルの滅菌蒸留水を追加します。摂氏95度を20秒間25サイクルするサーマルサイクリングスケジュールを使用して、PCRの2回目のラウンドを実行します。摂氏67度で40秒、摂氏72度で1分間、その後、摂氏72度で5分間延長します。

5%尿素ページゲルを泳動し、リン酸化イメージャーで露光したスクリーニングをスキャンして、PCR産物を可視化します。各PCRバンドは、60マイクロリットルの滅菌蒸留水が入ったeinor tubeにゲルストリップを溶解し、摂氏95度で5分間インキュベートすることにより、ゲルからリサイクルできます。遠心機。溶解したゲル生成物は、10, 000 RPM で 10 秒間短時間

すべてのサンプルを収集します。1マイクロリットル取り出して、プライムリペアでPCRを実施するためのDNAテンプレートとして使用します。29 61 46 26。

上記と同じ条件を用いて、精製およびシーケンシング後の解析をオンラインツールを用いて実施し、染色体位置を決定することができる。ゲノムバイオインフォマティクスのサイトにアクセスしたら、blattをクリックして新しいウィンドウを生成し、DNA配列を貼り付けます。DNA配列を登録すると、BLATTの検索結果が表示されます。

100%identityのヒットでブラウザをクリックすると、DNA配列の位置が表示されます。可能な1つの領域は、その長距離DNA相互作用を決定するための餌として使用されました。PCRプライマーセットの第2ラウンドでは、2つのBGL2サイトと1つのBAM H1サイトがA CTアッセイに選択され、46 26 29 61が増幅可能なM1に使用され、46.30 29 61が可能なM2に使用され、46、36 29 61が可能なM3に使用されました。

典型的なゲルパターンは、ここで可能なM1、可能なM 2、および可能なM 3についてここに示されているように、1つからいくつかのバンドを示します。クローン可能なM1のDNA配列は、A CTアッセイからの各フラグメントが2つの結合DNAセグメントで構成されていることを示しています。1つのセグメントはベイトDNA領域に由来し、2番目のセグメントは関連するパートナーに由来します。

セグメントは、第1の制限酵素認識配列によって互いに結合されます。2番目の酵素認識配列は、関連するパートナー配列の最後に現れます。クローニングされた可解M1フラグメントは、9番染色体Q 32.4に位置するABLE Oneの領域からのDNAを含み、関連するパートナーは、proc 2として同定された染色体3P 3に位置している。

同様に、ABLE M 2の関連パートナーは5番染色体Q 21.1に局在し、クローン可能なM 3は、3つのCアッセイとは対照的に、ABLE One遺伝子座付近の染色体内関連として同定された。このビデオで概説されている方法論では、最も一般的な長距離インタラクションを選択します。しかし、PCR Rサイクルの数を増やすことにより、マウスファイバーブラスト細胞の餌DNAとしてIGF 2つのH 19遺伝子座のインプリンティングおよび制御領域またはICRを使用して、頻度の低い追加の関連を同定することが可能であり、A CTアッセイにおけるPCRの第1ラウンドおよび第2ラウンドで異なるサイクリングプログラムを適用した。

A CTアッセイは、核構造の違いや、正常細胞とがん細胞との間の長距離相互作用を特定するためにも使用できます。正常な結腸組織および結腸癌組織を均質化し、本明細書に記載の手順に従ってA CTアッセイを行った。ここに示されているのは、IGF 2 H 19遺伝子座とIGF 2遺伝子dpnのICR領域のDNA構造です。

A CTアッセイの2つの部位は標識されています 第2ラウンドPCRで使用されるプライマーは、矢印と異なる色の数字で標識されています。A CTアッセイのゲルパターンは、プライマー29 61とプライマーペア41、61、41 63、51 45、および51 51のいずれかを使用したPCR結果を表す。正常な結腸組織にのみ現れるユニークなバンドは黄色の矢印でラベル付けされ、結腸がん組織にのみ現れるバンドは赤い矢印でラベル付けされます。

この技術は、市場生物学の分野の研究者が、核構造と遺伝子調節を3次元的に探求する道を開きます。