ビボ犬筋肉の機能アッセイに

本手順の目的は、非侵襲的な方法を用いて、生存している犬の後肢筋肉の機械的特性を測定し、評価することである。まず、生理学実験装置に犬を適切に配置する。次に、等尺性単収縮トルクおよび強直性脛足関節屈曲トルクを測定し、記録する。

手順の3番目のステップは、遠心性収縮を行うことです。手順の最終ステップは、脛足関節伸展時の等尺性収縮、トルク、および強直トルクを測定し、記録することです。最終的に、非侵襲的な生理学的手法を通じて、後肢の筋力および反復的な遠心性収縮に対する反応を示す結果を得ることができます。

終末研究であるex vivoや単離筋肉アッセイなどの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、非侵襲的で耐容性が高く、時間をかけて繰り返し実施できる点にあります。この手法は、収縮誘発性損傷や疲労に対する筋肉の反応など、筋生理学分野における重要な疑問を解明するのに役立ちます。また、本手法は犬やその他の大型哺乳類における筋肉機能を測定できるため、筋ジストロフィーの治療や診断への応用が期待されます。

多くの新しい治療法の臨床試験および患者への適用に先立つ前臨床研究では、このような大型動物が必要とされます。この手法はイヌモデルに関する知見を提供しますが、非ヒト霊長類などの他の動物モデルシステムにも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな者は、刺激電極の配置に細心の注意が必要であることや、トルク波形から何を読み取るべきかという知識が不足しているため、習得に苦労します。筋肉から最大トルク反応を誘発させるには精密な操作が要求され、電極配置の手順を習得することが困難であるため、この手法を視覚的に提示することが極めて重要です。

本研究では、Dynamic Muscle Control (DMC) ソフトウェアで作成した2つのプロトコルを用いて、刺激およびデータロギングのパラメータを定義しています。1つ目のプロトコルである等尺性収縮プロトコルは、単収縮と強直収縮の両方に使用されます。2つ目のプロトコルである偏心性伸張損傷プロトコルは、偏心性収縮に使用されます。各プロトコルで使用される刺激装置の設定およびソフトウェアのシーケンスは、ここに示す表に記載されており、単収縮は1 Hzの刺激で誘発されます。

強直性収縮およびエキセントリック収縮は、50 Hzの刺激によって誘発されます。エキセントリック収縮の場合、収縮中の筋肉に伸展が加えられます。これらの実験では、腓骨神経を刺激して屈筋の単収縮、強直性収縮、またはエキセントリック収縮を誘発させ、また脛骨神経を刺激して伸筋の単収縮または強直性収縮を誘発させることで、数種類の筋肉収縮を導き出します。

犬を麻酔した後、瞬目反射を確認し、動物が十分に麻酔されていることを確かめます。二酸化炭素濃度、パルスオキシメトリ、および体温を綿密にモニタリングしてください。処置中に、刺激電極を配置する膝関節外側の被毛を剃毛します。

次に、犬を生理学テーブルの上に配置します。背臥位で、大腿骨と脛骨が直角になり、脛骨がテーブル面に平行になるように後肢を配置し、フォースペダルが安全に回転できることを確認します。手動で動かしたときに、硬い感覚があるはずです。

次に、生理学装置の電源を入れ、ペダルを起動させます。ペダルの動作はサーボモーターによって制御されており、このモーターはコンピューターで制御されています。ここで、犬の肢端をフットペダルにそっと乗せ、回転中心軸から外側指の末端までの長さを測定し、記録します。

次に、伸縮性自己粘着ラップを使用して、犬の足をフットペダルに固定します。ペダル内のトランスデューサーが、脚の筋肉収縮による力を記録します。シールド単極24ゲージ電極を刺激絶縁ユニットに接続し、刺激電極を設置します。

手袋を着用し、犬の皮膚をアルコールで清浄します。腓骨近位外側の直遠位にある総腓骨神経を指で触診して部位を特定し、黒色の陰極電極を皮膚下に慎重に挿入します。赤色の陽極電極を、陰極電極と平行に、かつわずかに遠位の皮膚下、骨膜のすぐ外側に配置します。両電極が腓骨頭の直遠位にある総腓骨神経の内側に位置していることを確認してください。次に、刺激装置を1 Hzで起動し、モニターで不随意運動（twitch response）を観察します。

最大可能な収縮振幅を得るために、必要に応じて電極の位置を微調整します。電極が適切に配置されたら、DMCソフトウェアを起動して収縮応答を収集します。次のステップは、電極を動かさずにテタヌス収縮を誘発することです。

強直性収縮（titanic contraction）のために、表の指定に従って刺激装置を設定します。次に、ソフトウェアで等尺性収縮プロトコルを起動し、筋肉に等尺性の強直性収縮を発生させます。次の実験であるエキセントリック伸展損傷プロトコルも、電極を移動させずに実施します。

スティミュレーターを心心性収縮（エキセントリック収縮）に設定し、刺激を開始します。本プロトコルでは、神経を50 hertzで1秒間、10回刺激します。この1秒間のうち、最初の800 millisecondsは屈筋が等尺性収縮し、最後の200 millisecondsで筋肉が伸展されます。

10回の偏心性収縮を1セット行った後、筋肉を4分間休ませます。その後、伸筋を刺激するために、セット間に4分間の休息を挟みながら、この偏心性ストレッチ損傷プロトコルをさらに2回繰り返します。電極を皮膚に対して垂直に挿入し、屈曲に使用した元の電極配置よりも近位の脛骨神経に移動させます。配置するおおよその位置は、膝によって形成される90度の角を二等分する線に沿った点です。

脛骨神経は総腓骨神経よりも深層かつ内側に位置しています。最適な収縮電位を誘発するように、必要に応じて電極を移動させてください。電極の位置が決まったら、電極を動かさずに等尺性プロトコルを用いて最大収縮を誘発させます。

強直性収縮用に指定された刺激装置の設定に変更します。次に、後脛骨筋の強直性収縮を誘発し、記録します。筋肉収縮によるトルクおよび時間的情報を解析するために、ダイナミック筋肉解析（DMA）プログラムを使用します。

この図では、1 Hzでの脛骨神経刺激により、データ解析のため脛骨足指伸筋の単収縮を誘発させています。3つのカーソルの位置は次のように設定されています。青色のカーソルは、トルクが安静時トルクから上昇し始める点に設定されています。黄色のカーソルは、トルクが安静時トルクに戻る点に配置されています。

弛緩相の後、白いカーソルは不要となるため、黄色いカーソルの右側に配置されます。この図は、脛骨神経への1.5秒間、50 hertzのパルスによる等尺性強直トルク刺激により、脛骨足伸筋に強直性収縮が誘発されたことを示しています。データ解析のために、青色と黄色のカーソルが配置されます。

この図における収縮分析について、脛骨足関節屈筋に遠心性収縮を誘発させました。経皮的な会陰神経刺激により、まず800ミリ秒間の等尺性収縮を誘発し、その時点で脚に強制的な伸展を加えました。このデータ解析では、青色のカーソルを等尺性トルクが静止トルクから上昇し始める点に配置しています。

黄色のカーソルを、等尺性プラトーから偏心性伸張トルクが上昇し始める点に配置します。白色のカーソルは、トルクが安静時トルクに戻る点に配置します。この手法を習得すれば、適切に実施することで約1時間で完了できます。この手順を試みる際は、ステップごとのチェックポイントが記載された印刷済みのプロトコルに従うことが重要です。

筋線維型や、導入後の導入遺伝子の発現といった追加の疑問を解決するために、筋生検などの他の手法を用いることができます。この手法は、筋生理学分野の研究者が、筋ジストロフィー罹患犬における運動への反応を探索するための道を切り開きました。このビデオを視聴することで、犬における非侵襲的な筋生理学アッセイの実施方法について、十分な理解を得ることができます。