ビボ犬筋肉の機能アッセイに

この手順の全体的な目的は、非侵襲的な方法を用いて、生体犬の後肢筋肉の機械的特性を測定し、特性評価することです。これは、まず生理学装置に犬を適切に配置することによって達成されます。手順の第2ステップでは、等尺性収縮トルクおよび強直性脛足屈曲トルクを測定し、記録します。

手順の3番目のステップは、偏心性収縮を行うことです。手順の最終ステップでは、脛足関節伸展時の等尺性収縮、トルク、および強直トルクを測定し、記録します。最終的に、非侵襲的な生理学的手法を通じて、後肢の筋力および繰り返しの偏心性収縮に対する反応を示す結果を得ることができます。

末端的な研究であるex vivoでの単離筋肉アッセイなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、非侵襲的であり耐容性が高いため、時間をかけて繰り返し実施できることです。この手法は、収縮誘発性損傷や疲労に対する筋肉の反応など、筋生理学分野における重要な疑問の解明に寄与します。また、本手法は犬やその他の大型哺乳類における筋肉機能を測定するため、筋ジストロフィーの治療や診断への応用が期待されます。

多くの新しい治療法の臨床試験および患者への適用に先立つ前臨床研究では、このような大型動物が必要となります。本手法はイヌモデルに対する知見を提供できるだけでなく、非ヒト霊長類などの他の動物モデルシステムにも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな者は、刺激電極の配置に細心の注意が必要であることや、トルク波形から何を読み取るべきかという知識が不足しているため、習得に苦労します。筋肉から最大トルク反応を誘発させるには精密な操作が要求され、電極の配置ステップを習得することが困難であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。

本研究では、dynamic muscle control（DMC）ソフトウェアで作成された2つのプロトコルを使用して、刺激およびデータロギングのパラメータを定義しています。1つ目のプロトコルである等尺性収縮プロトコルは、単収縮および強直収縮の両方に使用されます。2つ目のプロトコルである伸張性傷害プロトコルは、伸張性収縮に使用されます。各プロトコルで使用される刺激装置の設定およびソフトウェアのシーケンスをここに示す表にまとめました。なお、単収縮は1 Hzの刺激によって誘発されます。

強直性収縮および伸張性収縮は、50 hertzの刺激によって誘発されます。伸張性収縮の場合、収縮している筋肉にストレッチが加えられます。これらの実験では、腓骨神経を刺激して屈筋の単収縮、強直性収縮、または伸張性収縮を誘発し、脛骨神経を刺激して伸筋の単収縮または強直性収縮を誘発することで、数種類の筋肉収縮を誘発させます。

犬を麻酔した後、瞬目反射を確認し、動物が深く麻酔されていることを確かめてください。二酸化炭素濃度、パルスオキシメトリ、および体温を綿密にモニタリングします。処置中に、刺激電極を配置する膝関節外側の被毛を剃毛します。

次に、犬を生理学用テーブルの上に配置します。背臥位にさせ、大腿骨と脛骨が直角になり、かつ脛骨がテーブルトップと平行になるように後肢を固定し、フォースペダルが安全に回転できるかを確認します。手で動かしたときに、適度な抵抗感があるはずです。

次に、生理学装置の電源を入れ、ペダルを起動します。ペダルの動きはサーボモーターによって制御され、そのサーボモーターはコンピューターで制御されます。ここで、犬の足をフットペダルにそっと置き、回転中心軸から外側指の末端までの長さを測定し、記録します。

次に、弾性自己粘着ラップを用いて、犬の前肢をフットペダルに固定します。ペダル内のトランスデューサが、脚の筋肉収縮による力を記録します。シールド付きモノポーラ24ゲージ電極を刺激アイソレーションユニットに接続し、刺激電極を設置します。

手袋を着用し、犬の皮膚をアルコールで清浄します。腓骨近位外側のすぐ遠位にある総腓骨神経を指で触診して位置を確認し、黒色の陰極電極を慎重に皮下に挿入します。続いて、赤色の陽極電極を皮下に、陰極電極と平行かつわずかに遠位に配置します。両電極が、腓骨頭のすぐ遠位にある総腓骨神経の内側に位置するようにします。次に、刺激装置を1 Hzで起動し、モニター上の痙縮反応を確認します。

可能な限り大きな収縮振幅を得るために、必要に応じて電極の位置を微調整します。電極が適切に配置されたら、DMCソフトウェアを起動して収縮反応を収集します。次のステップは、電極を移動させずにテタヌス収縮を誘発させることです。

表の指示に従って、強直収縮（titanic contraction）のための刺激装置を設定します。次に、ソフトウェアで等尺性収縮プロトコルを起動し、筋肉の等尺性強直収縮を誘発させます。次の実験である偏心性伸展傷害プロトコルにおいても、電極は移動させずに実施します。

刺激装置を偏心性収縮に設定し、刺激を開始します。本プロトコルでは、神経を50 hertzで1秒間、10回刺激します。この1秒間のうち、最初の800 millisecondsで屈筋が等尺性に収縮し、その後、最後の200 millisecondsで筋肉が伸展されます。

10回の遠心性収縮を1セット行った後、筋肉を4分間休ませます。その後、伸展筋を刺激するために、セット間に4分間の休止時間を設けて遠心性ストレッチ傷害プロトコルをさらに2回繰り返します。電極を皮膚に対して垂直に、かつ屈曲時に使用した元の電極配置よりも近位に挿入し、脛骨神経へ移動させます。配置するおおよその位置は、膝によって形成される90度の角を二等分する線上の点です。

脛骨神経は総腓骨神経よりも深層かつ内側に位置しています。最適な収縮電位を誘発させるため、必要に応じて電極を移動させてください。電極を配置したら、電極を動かさずに等尺性プロトコルを用いて最大収縮を誘発させます。

強直性収縮（titanic contractions）に合わせて刺激装置の設定を変更します。次に、下腿趾伸筋の強直性収縮を誘発させ、記録します。筋肉の収縮から得られたトルクおよび時間的情報を解析するために、ダイナミック筋解析（DMA）プログラムを使用します。

この図では、1 Hzでの脛骨神経刺激により、データ解析のために脛骨足根伸筋の単収縮を誘発させています。3つのカーソルの位置は次のように設定されています。青色のカーソルは、トルクが安静時トルクから上昇し始める点に設定されています。黄色のカーソルは、トルクが安静時トルクに戻る点に配置されています。

弛緩相の後、白いカーソルは不要となるため、黄色いカーソルの右側に配置されます。この図は、脛骨神経への50 Hzのパルスを1.5秒間連続して与える等尺的な強直トルク刺激により、脛骨足根伸筋に強直収縮が生じたことを示しています。データ解析のために、青いカーソルと黄色いカーソルが配置されます。

この図の収縮分析について、脛骨足関節屈筋に偏心性収縮を誘発させました。経皮的な会陰神経刺激により、まず800ミリ秒間の等尺性収縮を活性化させ、その時点で脚に強制的なストレッチを加えました。このデータ解析では、青いカーソルを等尺性トルクが静止トルクから上昇し始める点に配置しています。

黄色のカーソルを、等尺性プラトーからエキセントリック伸張トルクが上昇し始める点に配置します。白いカーソルは、トルクが安静時トルクに戻る点に配置します。この手技に習熟すれば、適切に実施することで約1時間で完了できます。この手順を試みる際は、ステップごとのチェックポイントが記載された印刷済みのプロトコルに従うことが重要です。

筋線維型の特定や、導入遺伝子の発現確認など、追加の疑問を解消するために、筋生検などの他の手法を実施することが可能です。本手法は、筋生理学分野の研究者が、筋ジストロフィーを患うイヌにおける運動への反応を探索するための道を切り拓きました。このビデオを視聴することで、イヌにおける非侵襲的な筋生理学アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。